3.4.1 丹參組：其實驗流程圖如圖 3.1
3.4.1.1 實驗分組：將 30 隻大鼠任意分為五組，每組六隻 SD 大鼠
(1)假手術組(Sham)：將動物兩側頸總動脈及右側中大腦總動脈暴露，
不阻斷血流。
(2)控制組(Cont)：阻斷兩側頸總動脈及右側中大腦動脈血流 90 分 鐘，經 24 小時再灌流後，將動物犧牲取腦。
(3)實驗組(SM30)：如控制組，但腦血流阻斷前 30 分鐘，腹腔注射丹 參水萃取物 30 mg/kg。
(4)實驗組(SM15)：如同控制組，但腦血流阻斷前 30 分鐘，腹腔注射 丹參水萃取物 15 mg/kg。
(5)對照組(PBS)：如同控制組，但腦血流阻斷前 30 分鐘，腹腔注射 PBS 水溶液。
3.4.1.2 自由基的測定
大鼠腦缺血 90 分鐘後，將結紮處鬆綁，使血液再灌流 24 小時，以 水含氯醛(Chloral hydrate)深度麻醉，於灌流之前先由心臟抽取 3 ㏄ 全血，其中 2 ㏄裝入含 Heparin 且以鋁薄紙包裹避光之試管，置於冰浴 中，用來測量自由基。另 1 ㏄則裝入含 EDTA 之試管，用來計算白血球
數目。
自由基的測定是採用 chemiluminesence analyzing system (Tohoku electronic industrial Co., Sendai, Japan)。
(1)Luminol-CL 的測量：
A.過氧化氫(H2O2)的測量原理
白血球之 myeloperoxidase 於自然狀態下可產生少量過氧化氫，而 於 zymosan 刺激下其產量可增加至 10-100 倍。故將化學發光物質 luminol 加入全血中，luminol 可被過氧化氫氧化，而於還原過程中被 微量化學發光分析儀偵測到。
B.步驟：
取 0.2 ㏄全血加入 0.1 ㏄ PBS 中，經過 200 秒後注入 1.0ml 25μM 之 luminol，再經 600 秒後注入 0.2 ml 之 Zymosan-A，持續測量至 1020 秒 為 止， 計 算 Luminol-CL counts 的 總數 ， 最後 除 以 WBC 數 而以 CL/1000WBC 來表示。
(2)Lucigenin-CL 的測量 A.超氧陰離子的測量原理
血液中之白血球於自然狀態下可產生少量超氧陰離子，而於 zymosan 刺激時其產量可增加至 10-100 倍。若於全血中加入化學發光物質 lucigenin，超氧陰離子會將 lucigenin 氧化，氧化型的 lucigenin 於
還原過程中會放出 photon 能被微量化學發光分析儀偵測到，則可知血 中超氧陰離子的多寡。
B.步驟：
取 0.2 ㏄全血加入 0.1 ㏄ PBS 中，經過 200 秒後注入 1.0ml 之 0.01 μM lucigenin，再經 600 秒後注入 0.2ml 之 zymosan-A，持續測量至 1020 秒為止，計算 lucigeuin-CL counts 的總數，最後除以 WBC 數而以 CL/1000WBC 來表示。
3.4.1.3 腦梗塞面積的測定
經 24 小時再灌流後，用水合氯醛(chloral hydrate 400mg/kg)腹腔 注射，待大鼠麻醉無痛覺反應後，用剪刀剪開皮膚，使露出胸骨柄，以 止血鉗夾住胸骨柄並往上拉，沿著肋骨邊緣將胸腔剪開，露出心臟，立 即自左心室快速灌流生理食鹽水(0.9% NaCl，南光化學製藥股份有限公 司，台灣)，並在右心房剪一小孔，讓生理食鹽水從左心室灌入，循環 全身一周後由右心室流出，清洗大鼠組織中的血流。灌流完成後，迅速 取腦置於塑膠鼠腦模型切盒中(brain matrix slicer)冠切(coronal sections)，厚度為 2 mm，從前額葉算起取六片，置於含有 2% TTC 染色 劑的 12-well 培養盤中，然後放置於 37℃恆溫箱中避光，經 15 分鐘的 染色，腦梗塞區則呈現白色，而非梗塞區為紫紅色。將 TTC 染色劑回收，
加入 10% formalin (Merck，Germany)固定貯存。完成收集 30 隻 SD 大
鼠之腦切片後，取各組鼠腦置於濾紙上，吸乾固定液，微距照相，應用 optic imagine 電腦圖像處理系統，計算每張切片腦梗塞面積。然後算 出梗塞面積和與切片總面積之百分比。
3.4.1.4 統計分析
本研究使用單因子變異數分析(one way Analysis of variance，
ANOVA scheffe’s test)來檢定各組間的差異，當 P 值＜0.05 則認為有 統計意義。
3.4.2 槐花組─ 分為實驗 A 和實驗 B ，其實驗流程如圖 3.2 實驗 A
3.4.2.1 實驗分組：將 42 隻大鼠任意分為七組，每組六隻 SD 大鼠
(1)假手術組(sham, S)：將動物兩側總頸動脈及右側中大腦動脈暴露，
不阻斷血流。
(2)控制組(control, C)：將動物兩側總頸動脈及右側中大腦動脈血 流阻斷 90 分鐘後，放開再灌流 24 小時，將動物犧牲取腦。
(3)實驗組(P-50)：如同控制組，但腦血流阻斷前 30 分鐘，由腹腔注 射槐花水萃取物 50 mg/kg。
(4)實驗組(P-100)：如同控制組，但腦血流阻斷前 30 分鐘，由腹腔 注射槐花水萃取物 100 mg/kg。
(5)實驗組(P-200)：如同控制組，但腦血流阻斷前 30 分鐘，腹腔注 射槐花水萃取物 200 mg/kg。
(6)對照組(PBS)：如同控制組，但腦血流阻斷前 30 分鐘，由腹腔注 射 PBS 水溶液。
(7)實驗組(D-200)：如同控制組，但腦血流阻斷後 30 分鐘，由腹腔 注射槐花水萃取物 200 mg/kg。
3.4.2.2 神經學狀態評估
經 24 小時再灌流後，由不知老鼠組別之助理人員觀察並記錄動物行 為。SD 大鼠神經狀態的評估是依據 Bederson et al.(1986) (33)神經學檢查 分級表，如下(圖 3.3)：
(1)第 0 級：輕拉起大鼠尾巴懸空，正常大鼠會呈雙臂向前伸展，沒 有神經方面缺陷，為 0 分。
(2)第一級：將大鼠懸空，會使左側前肢屈曲，紀錄為 1 分。
(3)第二級：將大鼠懸空，左側前肢屈曲且掌指抓力減弱，對外力阻 抗降低，但行進時不會向左側偏轉(non-circling)，記錄為 2 分。
(4)第三級：除第二級症狀外，大鼠步行無法保持直線，行進時會向 左痲痺肢環繞(circling)，記錄為 3 分。
3.4.2.3 腦梗塞面積的測定
腦切片的製造、染色與梗塞面積的測定如同上述。
實驗 B
3.4.2.4 實驗分組：
另取２４隻 300-350 公克的 SD 大鼠，隨機分為四組，每組六隻如下
(1)假手術組(S)：將動物兩側總頸動脈及右側中大腦動脈暴露，但不 阻斷血流。
(2)控制組(C)：將動物兩側總頸動脈及右側中大腦動脈血流 90 阻斷 分鐘後，放開再灌流 24 小時，將動物犧牲取腦。
(3)實驗組(P-200)：如同控制組，但腦血流阻斷前 30 分鐘，由腹腔 注射槐花水萃取物 200 mg/kg。
(4)對照組(PBS)：如同控制組，但腦血流阻斷前 30 分鐘，由腹腔注 射 PBS 水溶液。
3.4.2.5 免疫組織化學染色分析
再灌流 24 小時後，以水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射將大鼠麻醉，
然後用碎冰將鼠頭包埋，降低鼠腦溫度來防止腦蛋白質變性，並迅速 以 0.9% NaＣl 溶液，進行心臟灌流，待鼠腦部血液灌流乾後，再以 4%
paraformaldehyde (Merck，Germany) 300 ml 經心臟灌流固定腦組織 約 10-20 分鐘，至實驗鼠四肢均僵硬時取腦。取出鼠腦再度置入裝滿 4% para-formaldehyde 之大試管內，4℃下靜置三天，待鼠腦完全固定 後將 4% paraformaldehyde 倒除，換裝 30 % Sucrose 4℃下靜置四天，
至鼠腦沈入試管底後取出鼠腦，放入塑膠鼠腦模型切盒中冠切，選取 腦囪門前 1.00 ㎜，兩耳間 10.00 ㎜處至腦囪門後 4.30 ㎜，兩耳間 4.70
㎜處之腦組織(Bregma 1.00 mm，Interaura 10.00 mm 至 Bregma-4.30 mm，Interaural 4.70 mm)，即相當於實驗 A 腦冠狀切片第 3 片至第 5 片之間，將冠切選取之腦組織以前朝上後向下的方位置入由鋁薄紙做 成之小圓盒中，以組織包埋劑(tissue freezing medium，Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC)包埋，再置入於-80℃冰箱中貯存 備 用 。 將 冰 存 之 鼠 腦 包 埋 組 織 以 冷 凍 切 片 機 (cryotat ， shanddn Scientific LTd.,UK)，進行厚度 20μm 之冠狀切片，並將切取之冠狀 切片平舖於 gelatin coated 之玻片上。4 組共 24 隻實驗鼠腦組織固定 選取前囪門後 0.92 ㎜，兩耳間前 8.08 ㎜，(Bregam-0.92 mm，Interaural 8.08 mm)之腦冠狀切片進行 ED1, IL-1β, Apoptosis 之免疫組織化學 染色。
(1) ED1 免疫活性細胞測定：
將選取之玻片置於 37℃恆溫箱中 10 分鐘去除水份，將烘乾之玻片
saline ， Sigma) 的 染 缸 中 潤 濕 ， 接 著 將 玻 片 架 放 入 內 裝 有 3 % H2O2/methanol 之染缸中 15 分鐘去除內生性之 peroxidase，再次以 DPBS 洗清，將玻片擦拭後平放於染色盒上以 10 %正常動物血清(10% Normal animal serum，LsAB kit，Zymed，San Francisco，CA)室溫下共同培 養 20 分鐘，再加入 ED1 (1：500; Serotec Ltd.)初級抗體培養 30 分鐘，
然後將玻片放回玻片架，放入內裝有 DPBS 的染缸中清洗三次，每次三 分鐘;隨後玻片稍擦拭平放於染色盒加入 biotinylated 二級抗體。室溫 下 培 養 10 分 鐘 ， 重 覆 上 述 步 驟 再 加 入 Streptavidin-peroxidase complex 培養 10 分鐘，與 DAB (Liquid DAB Substrate kit，Zymed，
San Francisco，CA，USA)呈色反應一分鐘，以水洗清終止反應，最後 以 hematoxylin (Harris hematoxylin solution，Merck，Germany)做 背景染色(counter stain)，以拭鏡紙壓乾，再以封片膠(Histological Mounting Medium Permount Sp15-500，New Jersey，USA)封片。
將染色封片完成之玻片置於顯微鏡(Zeiss Axioskop，Germany)連接 數位像機(Nikon E950，Japan)定距以 400X 拍照，經 optia imagine 電 腦圖像處理及分析照像，於 400X 下固定位置，即梗塞之核心區，固定 面積(1 ㎜ 2)進行 ED1 免疫活性細胞之定量分析。
(2) IL-1β免疫活性細胞測定：
步驟如同 ED1 染色，使用 IL-1β(1：400; Endogen Ltd.)初級抗體。
(3) Apoptosis 細胞測定： 除內生性之 peroxidase，以 TBS 清洗，再將玻片擦拭後平放於染色盒中 加入 1X TdT (terminal deoxynucleotldyl transferase) equilibration buffer 於室溫下培養 30 分鐘，隨後擦拭多餘的 1X TdT equilibration buffer，加入 TdT labeling reaction mixture，每片玻片蓋上 parafilm paper，染色盒中保持濕潤，於 37℃恆溫箱中培養 30 分鐘後將 parafilm paper 移去，取出玻片以 TBS 清洗，隨後加入 stop buffer solution 於 室溫下 5 分鐘，再以 TBS 清洗，隨後加入 blocking buffer 於室溫下 10
3.4.2.6 統計分析
所得資料的分析方法如同上述。
第四章 結 果
Lucigenin-CL counts，Sham 組為 39038.97 ± 16667.91，control 組為 45588.75 ± 21888.99，SM30 組為 45196.88 ± 33064.88，SM15 組 為 46361.77 ± 17411.41，PBS 組為 34725.25 ± 12764.73，它們之間沒 有統計上的差異(all P > 0.05,圖 4.3)。Luminol-CL counts，Sham 組 為 397672.87 ± 164862.77，control 組為 483805.63 ± 94962.39，SM30 組為 197470.03 ± 83656.73，SM15 組為 343199.72 ± 93402.79，PBS 組為 616331.22 ± 138568.87，SM30 組比 control 組低( P < 0.01, 圖 4.3)。另外，SM30 組和 SM15 組的 lunminol-CL count 也比 PBS 組低 (P
< 0.001, P < 0.05, 圖 4.3)。