Adiponectin 引發人類前列腺腫瘤細胞轉移
先 前 研 究 指 出 adiponectin 能 刺 激 人 類 腫 瘤 細 胞 的 轉 移 和 侵 入 ( Spyridopoulos TN et al., 2007；Bråkenhielm E et al., 2004；Bub JD et al., 2006)。
本研究中，我們選用三株不同的人類前列腺腫瘤細胞株 ( PC3、DU145 及
LNCaP ) 進行 adiponectin 與人類前列腺腫瘤細胞轉移的關係。我們分別給予細 胞不同濃度之adiponectin，而依濃度增加造成 androgen-independent 的前列腺腫 瘤細胞 ( PC3、DU145 ) 移行，也直接影響了 androgen-dependent 的前列腺腫瘤 細胞移行 ( LNCaP )；在濃度 0.3 μg/ml 時，PC3 的移行能力表現有顯著的差異 (Fig.5)。
Adiponectin 造成人類前列腺腫瘤細胞移行與增加 α5β1 integirn 表現有關 先前的研究顯示，人類腫瘤細胞中有明顯的 integrins 表現 ( Wei Y et al., 2007 )。於是我們假設 integrins 可能參與在 adiponectin 影響前列腺腫瘤細胞的轉 移過程中。流式細胞技術分析 ( Flow cytometric analysis ) 與即時定量聚合酶連 鎖反應 ( qPCR ) 顯示，adiponectin 誘導了細胞表面上 α5β1 integrins 表現，而 在 α2、αν、β1、β3 及 α2β1 integrins 則沒有顯著的影響 ( Fig. 6A &6 B )。用 anti-α5β1 單株抗體 ( mAb ) ( 10 μg/ml ) 處理細胞 30 分鐘後進行細胞移行實驗 ( Migration assay ) ，實驗結果顯示抑制由 adiponectin 誘導的腫瘤細胞轉移 ( Fig.6C )。以上結果提出 adiponectin 是經由調控增加 α5β1 integrins 的表現來增 加前列腺腫瘤細胞的轉移。
AdipoR1/R2 接受器的參與和人類前列腺腫瘤細胞的轉移有關
之前報告指出，AdipoR1 大量表現於骨骼肌，AdipoR2 則主要表現於肝臟 ( Yamauchi T et al., 2003 )。然而 AdipoR1/R2 接受器在人類前列腺腫瘤細胞的表 現不是很明瞭。我們經由即時定量聚合酶連鎖反應來檢測前列腺腫瘤細胞之
比人類正常前列腺細胞 PZ-HPV-7 來的顯著；LNCaP 則是 AdipoR2 接受器表現 ( Fig.8A；上欄處)。接著我們直接檢測 p38 激酶活性對 adiponectin 的反應；藉 由偵測出p38 激酶之其中一種基質 [activating transcription factor (ATF)-2] 的磷 酸化表現顯示 adiponectin 的確增加了 p38 的活性 ( Fig.8A；下欄處)。當給予 前列腺癌細胞 ( PC3、DU145 及 LNCaP ) p38 抑制劑 ( SB203580；10 μM ) ( Fig.8B )；或是轉染 PC3 細胞之 p38 mutant 24 小時後 ( Fig.8C )，進行細胞移 行實驗、流式細胞技術分析 ( Fig.8D ) 及即時定量聚合酶連鎖反應 ( Fig.8E )，
可觀察到前列腺癌細胞株 PC3 的移行能力及 α5β1 的向上調節作用皆有顯著的 抑制現象。因此 p38 活化參與在 adiponectin 所調節細胞移行與 integrin 表現 中。研究顯示adiponectin 會透過 AMPK 的活化增加脂肪酸的氧化作用 ( Tomas
到前列腺腫瘤細胞 PC3 的移行能力及 α5β1 的向上調節作用皆有顯著的抑制 adiponectin 的作用之中。為了研究 p38 與 AMPK 上下游關係，給予細胞之 p38 抑制劑 ( SB203580；10 μM )，很明顯地抑制了 adiponectin 誘導的 AMPK 活性；
進一步地給予細胞之 AMPK 抑制劑 ( AraA；0.5 mM ) 或 ( Compound C；
10μM )，並不會影響 adiponectin 所增加 p38 kinase activity。因此，p38 可能作 為上游因子傳遞訊號給下游因子AMPK。以上結果指出，p38 及 AMPK 訊號傳 遞路徑參與調控由adiponectin 誘導的前列腺腫瘤細胞轉移。
NF-κB 訊號路徑參與調控由 adiponectin 誘導 integrin 的向上調節與細胞的移 行能力
之前研究指出，在人類腫瘤細胞的轉移和侵入中，與 NF-κB 轉錄因子的活
化參與有關 ( Boukerche H et al., 2007 )。為了進一步證明 NF-κB 訊號傳遞路徑 參與在由 adiponectin 調控增加前列腺腫瘤細胞的轉移中；我們給予細胞 NF-κB 抑制劑 ( PDTC；60μM ) 或 IκBα protease 抑制劑 ( TPCK；3μM ) 30 分鐘後。
(Fig.10A) 顯示由 adiponectin 誘導的前列腺腫瘤細胞的移行被抑制了；此外，
給予細胞 ( PDTC；60μM ) 或 ( TPCK；3μM ) 進行流式細胞技術分析及即時定 量聚合酶連鎖反應，顯示也拮抗了 adiponectin 誘導 α5β1 integrin 向上調節的作 用 ( Fig.10B & 10C )。以上結果指出 NF-κB 活化參與 adiponectin 誘導腫瘤細 胞移行以及 α5 和 β1 integrins 表現。
我們接下來研究 adiponectin 誘導 NF-κB 活化的上游因子與前列腺腫瘤細胞移 行的關係。首先依時間點給予 adiponectin 刺激細胞誘導了 IKKα/β 磷酸化 ( Fig.10D；上欄處)。另一方面依不同時間點給予 PC3 細胞之 adiponetin 後，也 使得 IκBα 的磷酸化隨著時間而增加 ( Fig.10D；中欄處)。先前的研究顯示 p65 Ser536 磷酸化增加 NF-κB 的轉錄活化能力 ( Madrid LV et al., 2001；Viatour P et
al., 2005 ) 。並且 p65 Ser536 磷酸化專一性的抗體也用來驗證 p65 Ser536 的磷酸 化。因此，依不同時間點給予 PC3 細胞之 adiponetin 後，造成了 p65 Ser536 的磷酸化隨著時間而增加 ( Fig.10D；下欄處)。接著將 IKKα 或 IKKβ mutant 轉 染 PC3 細胞 24 小時後，進行細胞移行實驗；可觀察到 IKKα 或 IKKβ mutant 明 顯地抑制前列腺腫瘤細胞 PC3 的移行能力 ( Fig.10E )。這些結果顯示 IKKα 與 IKKβ 參與 adiponectin 作用之中。更進一步地，觀察 NF-κB 之活化作用，將 κB-luciferase 轉染入 PC3 細胞 24 小時，作為 NF-κB 活性的指示因子。給予 PC3 細 胞 之 adiponetin ，κB-luciferase 的 活 性 會 增 加 ； 此 外 給 予 Compound C ( 10μM )、 AraA ( 0.5 mM )、 SB203580 ( 10μM )、 PDTC ( 60μM ) 及 TPCK ( 3μM )，皆能降低由 adiponetin 所誘導的 NF-κB 活性 ( Fig.11A )。將 PC3 細胞 一 同 轉 染 IKKα、IKKβ 或 p38 mutant 也能抑制 NF-κB 促進因子的活性 ( Fig.11B )。綜合以上結果顯示，活化 p38 和 AMPK 參與在 adiponetin 所增加 NF-κB 的活化中。
第四章、討論