第二章 實驗材料及方法
第七節、 轉染作用與報導基因分析 ( Transfection and reporter gene assay )
利用p38 MAP kinase 基質 [activating transcription factor (ATF)-2] 來檢測 adiponctin 是否經由 p38 的磷酸化 ( Raingeaud J et al., 1995 )。將人類前列腺腫
再 吸 乾 殘 餘 的 PBS 緩 衝 液 。 加 入 含 有 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride ( PMSF ) 之 1× cell lysis buffer ，置於冰上作用五分鐘，再以細胞刮勺 ( scraper ) 將細胞刮下，在冰上 sonicate 震盪細胞 5 秒/次，共四次。以 4 0C 13,200 rpm 離 心 10分鐘，吸取上清液至另一微量離心管，加入 20 μl Immobilized Phospho-p38 MAPK ( Thr180/Tyr182 ) Monoclonal Antibody Beads ，於 4 0C 搖晃隔夜。以 4
0C 13,200 rpm 離心 30 秒，以 1× lysis buffer 清洗兩次，再用 1× kinase buffer 清洗兩次後，加入 50 μl 1× kinase buffer ，加入 1μl ATF-2 fusion protein 與 1μl ATP ，以上過程皆在冰上操作，之後於乾浴鍋上培養 30 0C 30分鐘，最後加 入 25 μl 3× SDS sample buffer，震盪均勻後，13,200 rpm 離心 30 秒，接著進行 Western Immunoblotting 實驗。
第九節、流式細胞儀分析 ( Flow cytometric analysis )
將人類前列腺癌細胞株 PC3 先分盤培養於 6 孔盤內，待細胞長約九分滿
後，吸掉培養液。以 PBS 緩衝液清洗，吸乾殘餘的 PBS 緩衝液，再以 37 0C 的 Trypsin 將細胞自培養盤中分離。接著使用含 75% 酒精溶液固定細胞至隔夜，
固定完畢後用 PBS 緩衝液清洗，並將細胞培養在 α2、α5、αν、β1、β3 integrin 的 mouse anti-human antibody 或 rabbit anti-human antibody ( 1:100 ) 之一級抗 體，室溫靜置培養 1 小時後。7,500 rpm 離心 5 分鐘，吸掉一級抗體，用 PBS 緩衝液清洗， 7,500 rpm 離心 5 分鐘，吸掉上清液，並將細胞與接有 fluorescein isothiocyanate-conjugated 的 goat anti-mouse secondary IgG 或 goat anti-rabbit secondary IgG ( 1:100; Leinco Tec., St Louis, MO ) 室溫下避光培養 45 分鐘後，
7,500 rpm 離心 5 分鐘，吸掉二級抗體，加入 500 μl PBS 緩衝液，然後進行流 式細胞技術進行實驗，使用 FACSCalibur and CellQuest software ( BD Biosciences, San Jose, CA ) 分析 ( Tang CH et al., 2006 )。
第十節、Total RNA 萃取 ( Total RNA isolation )
將細胞培養於 6 孔培養皿中，待細胞長約九分滿後，吸掉培養液，以冰的 PBS 緩衝液清洗，再吸乾殘餘的 PBS 緩衝液，分別加入 500μl 的 TRIzol reagent ( Invitrogen Corpoation, California, USA )，搖晃均勻置於冰上 5 分鐘，待 細胞完全溶解，將細胞刮下，移至另一微量離心管中。室溫下靜置 5 分鐘再加 入100μl 氯仿 ( chloroform ) 劇烈振盪 1 分鐘，靜置於室溫 3 分鐘，於 4 0C 以 12,000 rpm 離心 15 分鐘，樣品會形成 phenol-chloroform，中間白色層以及上 面透明水層。 RNA 大部分留在水層，小心將水層轉移到新的微量離心管，加 偵測 RNA 吸光值( UV/Visible spectrophotometer DU-800, Beckman Coulter )。
第十一節、反轉錄聚合酶連鎖反應 ( RT-PCR )
第十二節、即時定量聚合酶連鎖反應 ( Real-time Polymerase Chain Reaction, Real-time PCR )
即時聚合酶連鎖反應 ( Real-time Polymerase Chain Reaction, Real-time PCR ) 的原理為在進行 PCR 時同步偵測 PCR 產物隨著反應增加的狀況 ( 即為“real time” ) 利用所偵測到的產物回推樣品中原始基因之表現量。Real-time PCR 可分 為兩大方式：TaqMan 及 SYBR® GreenERTM ( Invitrogen, Carlsbad, CA )。本研 究使用相對定量 SYBR® GreenERTM 的原理是先設計一個 primer，而此 primer
是設計在我們要的一段 DNA 序列中，可以用來與單股 DNA 黏合，藉由
SYBR® GreenERTM qPCR SuperMix 在 PCR 過程時，與 DNA 序列黏合的 primer，隨著 PCR 產物的增加，信號也隨著增強，因此可做相對定量的分析。
將 cDNA 取 10~100ng、SYBR® GreenERTM qPCR SuperMix 取 10 μl、10μM primer 取 0.8μl ， 接 著 以 DEPC 水 加 至 20 μl 後 ， 將 樣 本 放 置 Applied Biosystems 7900 ( ABI prism 7900, CA, USA ) 進行相對定量分析。TaqMan real-time PCR 是用帶有螢光標記及螢光接受體的探針 ( probes ) : α2、α5、αν、β1、
第三章、實驗結果 (Result)
Adiponectin 引發人類前列腺腫瘤細胞轉移
先 前 研 究 指 出 adiponectin 能 刺 激 人 類 腫 瘤 細 胞 的 轉 移 和 侵 入 ( Spyridopoulos TN et al., 2007；Bråkenhielm E et al., 2004；Bub JD et al., 2006)。
本研究中，我們選用三株不同的人類前列腺腫瘤細胞株 ( PC3、DU145 及
LNCaP ) 進行 adiponectin 與人類前列腺腫瘤細胞轉移的關係。我們分別給予細 胞不同濃度之adiponectin，而依濃度增加造成 androgen-independent 的前列腺腫 瘤細胞 ( PC3、DU145 ) 移行，也直接影響了 androgen-dependent 的前列腺腫瘤 細胞移行 ( LNCaP )；在濃度 0.3 μg/ml 時，PC3 的移行能力表現有顯著的差異 (Fig.5)。
Adiponectin 造成人類前列腺腫瘤細胞移行與增加 α5β1 integirn 表現有關 先前的研究顯示，人類腫瘤細胞中有明顯的 integrins 表現 ( Wei Y et al., 2007 )。於是我們假設 integrins 可能參與在 adiponectin 影響前列腺腫瘤細胞的轉 移過程中。流式細胞技術分析 ( Flow cytometric analysis ) 與即時定量聚合酶連 鎖反應 ( qPCR ) 顯示，adiponectin 誘導了細胞表面上 α5β1 integrins 表現，而 在 α2、αν、β1、β3 及 α2β1 integrins 則沒有顯著的影響 ( Fig. 6A &6 B )。用 anti-α5β1 單株抗體 ( mAb ) ( 10 μg/ml ) 處理細胞 30 分鐘後進行細胞移行實驗 ( Migration assay ) ，實驗結果顯示抑制由 adiponectin 誘導的腫瘤細胞轉移 ( Fig.6C )。以上結果提出 adiponectin 是經由調控增加 α5β1 integrins 的表現來增 加前列腺腫瘤細胞的轉移。
AdipoR1/R2 接受器的參與和人類前列腺腫瘤細胞的轉移有關
之前報告指出，AdipoR1 大量表現於骨骼肌，AdipoR2 則主要表現於肝臟 ( Yamauchi T et al., 2003 )。然而 AdipoR1/R2 接受器在人類前列腺腫瘤細胞的表 現不是很明瞭。我們經由即時定量聚合酶連鎖反應來檢測前列腺腫瘤細胞之
比人類正常前列腺細胞 PZ-HPV-7 來的顯著；LNCaP 則是 AdipoR2 接受器表現 ( Fig.8A；上欄處)。接著我們直接檢測 p38 激酶活性對 adiponectin 的反應；藉 由偵測出p38 激酶之其中一種基質 [activating transcription factor (ATF)-2] 的磷 酸化表現顯示 adiponectin 的確增加了 p38 的活性 ( Fig.8A；下欄處)。當給予 前列腺癌細胞 ( PC3、DU145 及 LNCaP ) p38 抑制劑 ( SB203580；10 μM ) ( Fig.8B )；或是轉染 PC3 細胞之 p38 mutant 24 小時後 ( Fig.8C )，進行細胞移 行實驗、流式細胞技術分析 ( Fig.8D ) 及即時定量聚合酶連鎖反應 ( Fig.8E )，
可觀察到前列腺癌細胞株 PC3 的移行能力及 α5β1 的向上調節作用皆有顯著的 抑制現象。因此 p38 活化參與在 adiponectin 所調節細胞移行與 integrin 表現 中。研究顯示adiponectin 會透過 AMPK 的活化增加脂肪酸的氧化作用 ( Tomas
到前列腺腫瘤細胞 PC3 的移行能力及 α5β1 的向上調節作用皆有顯著的抑制 adiponectin 的作用之中。為了研究 p38 與 AMPK 上下游關係，給予細胞之 p38 抑制劑 ( SB203580；10 μM )，很明顯地抑制了 adiponectin 誘導的 AMPK 活性；
進一步地給予細胞之 AMPK 抑制劑 ( AraA；0.5 mM ) 或 ( Compound C；
10μM )，並不會影響 adiponectin 所增加 p38 kinase activity。因此，p38 可能作 為上游因子傳遞訊號給下游因子AMPK。以上結果指出，p38 及 AMPK 訊號傳 遞路徑參與調控由adiponectin 誘導的前列腺腫瘤細胞轉移。
NF-κB 訊號路徑參與調控由 adiponectin 誘導 integrin 的向上調節與細胞的移 行能力
之前研究指出，在人類腫瘤細胞的轉移和侵入中，與 NF-κB 轉錄因子的活
化參與有關 ( Boukerche H et al., 2007 )。為了進一步證明 NF-κB 訊號傳遞路徑 參與在由 adiponectin 調控增加前列腺腫瘤細胞的轉移中；我們給予細胞 NF-κB 抑制劑 ( PDTC；60μM ) 或 IκBα protease 抑制劑 ( TPCK；3μM ) 30 分鐘後。
(Fig.10A) 顯示由 adiponectin 誘導的前列腺腫瘤細胞的移行被抑制了；此外，
給予細胞 ( PDTC；60μM ) 或 ( TPCK；3μM ) 進行流式細胞技術分析及即時定 量聚合酶連鎖反應，顯示也拮抗了 adiponectin 誘導 α5β1 integrin 向上調節的作 用 ( Fig.10B & 10C )。以上結果指出 NF-κB 活化參與 adiponectin 誘導腫瘤細 胞移行以及 α5 和 β1 integrins 表現。
我們接下來研究 adiponectin 誘導 NF-κB 活化的上游因子與前列腺腫瘤細胞移 行的關係。首先依時間點給予 adiponectin 刺激細胞誘導了 IKKα/β 磷酸化 ( Fig.10D；上欄處)。另一方面依不同時間點給予 PC3 細胞之 adiponetin 後，也 使得 IκBα 的磷酸化隨著時間而增加 ( Fig.10D；中欄處)。先前的研究顯示 p65 Ser536 磷酸化增加 NF-κB 的轉錄活化能力 ( Madrid LV et al., 2001；Viatour P et
al., 2005 ) 。並且 p65 Ser536 磷酸化專一性的抗體也用來驗證 p65 Ser536 的磷酸 化。因此，依不同時間點給予 PC3 細胞之 adiponetin 後，造成了 p65 Ser536 的磷酸化隨著時間而增加 ( Fig.10D；下欄處)。接著將 IKKα 或 IKKβ mutant 轉 染 PC3 細胞 24 小時後，進行細胞移行實驗；可觀察到 IKKα 或 IKKβ mutant 明 顯地抑制前列腺腫瘤細胞 PC3 的移行能力 ( Fig.10E )。這些結果顯示 IKKα 與 IKKβ 參與 adiponectin 作用之中。更進一步地，觀察 NF-κB 之活化作用，將 κB-luciferase 轉染入 PC3 細胞 24 小時，作為 NF-κB 活性的指示因子。給予 PC3 細 胞 之 adiponetin ，κB-luciferase 的 活 性 會 增 加 ； 此 外 給 予 Compound C ( 10μM )、 AraA ( 0.5 mM )、 SB203580 ( 10μM )、 PDTC ( 60μM ) 及 TPCK ( 3μM )，皆能降低由 adiponetin 所誘導的 NF-κB 活性 ( Fig.11A )。將 PC3 細胞 一 同 轉 染 IKKα、IKKβ 或 p38 mutant 也能抑制 NF-κB 促進因子的活性 ( Fig.11B )。綜合以上結果顯示，活化 p38 和 AMPK 參與在 adiponetin 所增加 NF-κB 的活化中。
第四章、討論 (Discussion)
前列腺是男性生殖系統中的一個器官，屬外分泌腺，位在膀胱的下方，直腸 胞的移行能力。在這裡我們發現 adiponecin 促進 androgen-independent ( PC3 、 DU145 ) 和 androgen-dependent ( LNCaP ) 的前列腺腫瘤細胞的轉移。許多研究 初步的數據提出 adiponectin 具有抗癌的作用 ( Dieudonne MN et al., 2006 )，而 具有較低的 adiponectin 卻被指出具有增加胃癌、大腸癌、乳癌和內皮細胞癌的 風險 ( Dal Maso L et al., 2004 ; Ishikawa M et al., 2005 ; Kadowaki T et al., 2005) 。 因 此 ， 由 我 們 的 結 果 發 現 ， 不 論 是 androgen-dependent 或 androgen-independent 的細胞中，adiponectin 都可以促進細胞之移行。
Adiponecin 交互作用於兩個接受器 AdipoR1 和 AdipoR2。最近被定義出 adiponecin 調 節 生 物 特 性 透 過 adiponecin 之 接 受 器 AdipoR1 和 AdipoR2 ( Yamauchi T et al., 2003 )。AdipoR1 接受器對球狀脂聯素 ( globular adiponectin ) 具有高的親合力；AdipoR1 則是對長鏈脂聯素 ( full-length adiponectin ) 有較差 的親合力，而 AdipoR2 接受器對兩種形式的脂聯素皆具有親和性 ( Yamauchi T et al., 2003 ) 。 AdipoR1 大 量 表 現 於 骨 骼 肌 ， AdipoR2 則 是 表 現 在 肝 臟
( Kawaguchi T et al., 2005 )。然而，AdipoR1 和 AdipoR2 接受器表現在人類前列 腺腫瘤細胞還不是很明瞭。我們測試了androgen-independent ( PC3、DU145 )，
androgen-dependent ( LNCaP ) 和正常前列腺細胞，這四株細胞之 AdipoR1 和 AdipoR2 mRNA 的表現量。發現四株細胞皆有表現 AdipoR1 和 AdipoR2 。 PC3 和 DU145 的 AdipoR1 表 現 量 增 加 ； LNCaP 則 是 大 量 表 現 AdipoR2。 將 人類的前列腺腫瘤細胞藉由 adiponecin 使得 integrins 表現仍大部分是未知 的。在這裡我們利用流式細胞技術分析與即時定量聚合酶連鎖反應分析發現 adiponecin 增加 α5β1 integrins 表現而 α2、αν、β1、β3 及 α2β1 integrins 則沒有 顯著的影響，所以 integrins 的轉錄調控在腫瘤細胞轉移時扮演著重要的角色。
本研究中，我們也使用了 anti-α5β1 單株抗體去觀察 α5β1 integrins 所扮演的角
可能參與在 adiponecin 誘導前列腺腫瘤細胞轉移以及 integrins 轉錄調控表現。
AMPK 是一種由催化作用的 α 與調節作用的 β 和 γ 三個次蛋白組成的 heterotrimeric serine/threonine 激酶 ( Carling D et al., 2004 )。過去研究顯示 AMPK 與 adiponectin 的代謝的作用的訊息路徑有關 ( Carling D et al., 2004 )。有 研究顯示 adiponecin 交互作用於兩個接受器 AdipoR1 和 AdipoR2，調節增加 AMPK、 PPARα 脂肪酸氧化的表現 ( Kawaguchi T et al., 2005 )。而在 C2C12 肌 導的細胞移行。確定了在由 adiponectin 調節的細胞移行和 integrin 的調節中是 經由AdipoR-AMPK-dependent p38 的活化。
許 多 報 告 指 出 NF-κB 的活化是參與在 integrins 表現和腫瘤轉移當中
proteinase 降解。最後被釋放的 NF-κB 轉錄至細胞核內，而活化反應的基因 ( Vermeulen L et al., 2003 )。在本研究中，我們發現 給予 adiponectin 刺激下的 PC3 細胞造成了 IKK、IκB 以及 p65 的磷酸化。而利用過渡性轉染作用 ( transient transfection ) κB-luciferase 來 反 應 NF-κB 活 性 ， 我 們 也 發 現 adiponectin 可增加 NF-κB 活性。在這研究當中，也發現了 adiponectin 誘導 IKK、IκBα 以及 p65 的磷酸化可被 NF-κB 抑制劑 ( PDTC ) 或 IκBα protease 抑制劑 ( TPCK ) 抑制。 IKKα 或 IKKβ mutant 也減少了由 adiponectin 增加 IKK、 IκBα 和 p65 的磷酸化。
第五章、結論 (Conclusions)
本研究首次表示了 adiponectin 調控前列腺腫瘤細胞的移行。幫助我們了解 人類前列腺細胞的轉移機制，強調其中一個機制是藉由活化AdipoR1 receptor、
AMPK、p38 和 NF-κB 訊息傳導路徑，增加 α5β1 integrins 的轉錄調控 (Fig.9)。
以上推論能需要做進一步的研究與探討，以找出其真正的機制，在未來或許可以
以上推論能需要做進一步的研究與探討，以找出其真正的機制，在未來或許可以