研究架構與動機

前列腺癌又名攝護腺癌，幾乎所有前列腺癌都是發生在腺體細胞。前列腺癌 細胞對於雄性激素相當敏感，而病患治療首選為荷爾蒙療法也就是阻斷雄性激素 -睪丸酮對前列腺癌細胞的作用，進而達到抑制癌細胞的增生及轉移的效果。但 仍 有 出 現 荷 爾 蒙 療 法 失 效 的 情 況 ， 稱 為 非 雄 性 激 素 依 賴 型 之 前 列 腺 癌 Androgen-independent prostate cancer ( AIPC )。

PC3 和 DU145是前列腺癌典型的人類前列腺腫瘤細胞株。文獻指出PC3 細 胞比中度轉移能力DU145細胞具有高度的轉移能力 ( Alimirah F et al., 2006 )。

PC3細胞株取得於具非雄性激素依賴型高度骨轉移的前列腺癌。PC3細胞有低 testosterone-5-alpha 並且表現 PSA (攝護腺特異性抗原）( Pulukuri SM et al., 2005 )。而LNCaP細胞源自於淋巴結轉移之雄性激素敏感的人類前列腺腫瘤細胞。

我們進一步地假設由 adipocyte 所分泌之 adiponectin 可能具有調節人類前 列 腺 癌 細 胞 的 移 動 能 力 及integrin 參 與 轉 錄 調 控 的 表 現 。 也 進 一 步 探 討 adiponectin 對於不同之人類前列腺腫瘤細胞的移行能力。在本篇研究中，我們 發現 adiponectin 會增加人類前列腺癌細胞的移動能力及 α5β1 integrins 的表 現。此外，AdipoR 接受器、p38、AMPK、及 NF-κB 的訊號傳遞路徑參與在由 adiponectin 調控增加前列腺癌細胞的轉移過程當中。

第二章、材料與方法 (Materials and Methods)

第一節、材料

化學藥品有機溶劑、實驗器材及設備大部分購自於以下廠商:

Anti-mouse and anti-rabbit IgG-conjugated horseradish peroxidase、 rabbit polyclonal antibodies specific 如 β-actin、 p-p38、 p38、 IKK、 p-IκBα、 IκBα 和 p65 購 自於Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, CA, USA )。Rabbit polyclonal antibody specific 如 AMPKα phosphorylated Thr¹⁷²、IKKα/β phosphorylated Ser^180/181、p65 phosphorylated Ser⁵³⁶ 與 AMPKα 購 自 於 Cell Signaling 與 Neuroscience ( Danvers, MA )。PDTC、TPCK、SB203580、5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR) 、 Compound C 和 adenosine-9-β-D-arabino-furanoside ( AraA ) 購自於 Calbiochem ( San Diego, CA )。Mouse monoclonal antibody specific 如 α2、 α5、β1、β3、α2β1 以及 α5β1 integrin 購自於 Chemicon ( Temecula, CA )。Human full-length adiponectin ( Cat. No. 1065-AP ) 購自於 R&D Systems ( Minneapolis, MN ) NF-κB luciferase plasmid 購自於 Stratagene ( La Jolla, CA )。IKKα ( KM ) 和 IKKβ ( KM ) mutants 由 Dr. H. Nakano ( Juntendo University, Tokyo, Japan ) 提供。p38 dominant negative mutant 由 Dr. J.

Han ( South-western Medical Center, Dallas, TX ) 提供。Luciferase assay kit 購自 於 Promega ( Madison, MA ) 。 其 他 化 學 藥 品 有 機 溶 劑 大 部 分 購 自 於 Sigma-Aldrich ( St. Louis, MO )。

第二節、細胞株 ( Cell line )及細胞培養 ( Cell culture ) 一、細胞株

本實驗室所採用的人類正常前列腺細胞株 ( PZ-HPV-7 ) 與人類前列腺癌細 胞株 ( PC3 、DU145、LNCaP clone FGC )，購自食品工業發展研究所之生物資 源保存及研究中心 ( BCRC )，菌種中心編號 BCRC 60136 ( PZ-HPV-7 )、BCRC 60122 ( PC-3 ) 、BCRC 60348 ( DU 145 )、BCRC 60088 ( LNCaP clone FGC )。

均屬於非雄性激素敏感之貼附型細胞，LNCaP clone FGC 則屬於雄性激素敏感之 半懸浮型細胞。人類正常前列腺細胞株 PZ-HPV-7 培養於含有 5 ng/ml human recombinant epidermal growth factor 和 50 μg/ml bovine pituitary extract 的 Keratinocyte-serum free medium。人類前列腺癌細胞株 PC3 、LNCaP clone FGC 培養於含有 10% 胎牛血清 ( FBS, Invitrogen Corpoation, California, USA ) 和 1

% P/S ( penicillin/streptomycin ) ( Invitrogen Corpoation,California, USA ) 的 RPMI-1640 培養液。人類前列腺癌細胞株 DU145 培養於含有 10% 胎牛血清 ( FBS, Invitrogen Corpoation, California, USA ) 和 1 % P/S ( Invitrogen Corpoation, California, USA ) 之 MEM 培養液。

二、細胞培養

將細胞培養於10 cm 培養皿 ( Corning ) 中，待細胞長至八分滿，吸掉培養 液並以 PBS ( phosphate-buffered saline；含有 137 mM NaCl 、2.7 mM KCl、10 mM NaHPO4 及 2 mM KH2PO4 ) 清洗，藉由 Trypsin-EDTA (含有 0.5 % Trypsin、EDTA-4Na 及 NaCl ) ( Invitrogen Corpoation, California, USA ) 作用使細 胞懸浮，吸掉 TE，加入 5 ml 培養液中和 TE，並將細胞打散，並取出適當量

儲存於 -20 ⁰C 備用。

再以 TBS-T 洗 4 次，每次 15 分鐘。

取出 PVDF 稍微瀝乾，加上顯影劑 ( western blotting luminnol reagent，取 buffer A 及 buffer B 以 1：1 的比例混合) 均勻，再均勻加於轉印紙上，將轉印 紙放入底片夾，以感光底片感光至Band 出現。

Western blotting所需配置之Buffer 組成如下：

SDS-PAGE：

10% Resolving gel (5ml) 5% Stacking gel (3ml)

1.9ml H2O 1.75ml H2O

1.7ml 30% acrylamide mix 0.65ml 30% acrylamide mix 1.3ml 1.0 M Tris (pH6.8) 0.5ml 1.0 M Tris (pH6.8) 0.05ml 10% SDS 0.01ml 10% SDS

0.05ml 10% ammonium persulfate 0.01ml 10% ammonium persulfate 0.002ml TEMED 0.002ml TEMED

Buffer 製備:

sample buffer (5x)： Lysis buffer：

7.81 ml stacking buffer (0.5mM

Tris-HCl ,PH=6.8) 50mM Tris pH7.5

2.5 g SDS 150mM NaCl

14.36 ml glycerol 10mM EDTA 6.25 ml 2-mecaptoethanol 1% NP-40

2 mg bromophenol blue 0.25% deoxycholate

加二次水至50ml

RIPA buffer： TBS-T (20X)：

1ml lysis buffer 48.46g Tris

50mM PMSF 0.5M EDTA

50mM Na3Vo4 58.44g Nacl (PH=7.5) 10μg/ml Aprotinin 加去離子水至1L。

1mM NaF

Running buffer(10x)： Transfer buffer(10x)：

30.2g Tris-base 30g Tris 140g Glycine 144g Glycine

10g SDS 加去離子水至1L。

加去離子水至1L。

第六節、細胞移行能力分析 ( Migration assay )

利用雙層通透性的培養盤 transwell ( Costar, Corning Life Sciences, Acton, MA；pore size, 8-µm )。以細胞穿過多碳膜能力的不同，來分析比較藥物對細胞 遷移能力的影響。

在進行細胞移行實驗前，細胞先用不同濃度的抑制劑前處理 30 分鐘，包括 Compound C、 AraA、 SB203580、 PDTC 或 TPCK。於 lower chamber 中置 放 300µl 含 1% FBS 及 adiponectin 的培養液，再放入 upper chamber。將約 2

校正由 adiponectin 所引起的細胞增生效應。(正確的細胞移行數量 = 計數細胞 移行的數量 / 細胞存活百分比) ( Chu CY et al., 2007；Huang YC et al., 2007 )。

第七節、轉染作用與報導基因分析 ( Transfection and reporter gene assay ) 利用 Lipofectamine 2000 ( LF2000 ; Invitrogen ) 轉染法，將 DNA 質體轉染

利用p38 MAP kinase 基質 [activating transcription factor (ATF)-2] 來檢測 adiponctin 是否經由 p38 的磷酸化 ( Raingeaud J et al., 1995 )。將人類前列腺腫

再 吸 乾 殘 餘 的 PBS 緩 衝 液 。 加 入 含 有 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride ( PMSF ) 之 1× cell lysis buffer ，置於冰上作用五分鐘，再以細胞刮勺 ( scraper ) 將細胞刮下，在冰上 sonicate 震盪細胞 5 秒/次，共四次。以 4 ⁰C 13,200 rpm 離 心 10分鐘，吸取上清液至另一微量離心管，加入 20 μl Immobilized Phospho-p38 MAPK ( Thr180/Tyr182 ) Monoclonal Antibody Beads ，於 4 ⁰C 搖晃隔夜。以 4

0C 13,200 rpm 離心 30 秒，以 1× lysis buffer 清洗兩次，再用 1× kinase buffer 清洗兩次後，加入 50 μl 1× kinase buffer ，加入 1μl ATF-2 fusion protein 與 1μl ATP ，以上過程皆在冰上操作，之後於乾浴鍋上培養 30 ⁰C 30分鐘，最後加 入 25 μl 3× SDS sample buffer，震盪均勻後，13,200 rpm 離心 30 秒，接著進行 Western Immunoblotting 實驗。

第九節、流式細胞儀分析 ( Flow cytometric analysis )

將人類前列腺癌細胞株 PC3 先分盤培養於 6 孔盤內，待細胞長約九分滿

後，吸掉培養液。以 PBS 緩衝液清洗，吸乾殘餘的 PBS 緩衝液，再以 37 ⁰C 的 Trypsin 將細胞自培養盤中分離。接著使用含 75% 酒精溶液固定細胞至隔夜，

固定完畢後用 PBS 緩衝液清洗，並將細胞培養在 α2、α5、αν、β1、β3 integrin 的 mouse anti-human antibody 或 rabbit anti-human antibody ( 1:100 ) 之一級抗 體，室溫靜置培養 1 小時後。7,500 rpm 離心 5 分鐘，吸掉一級抗體，用 PBS 緩衝液清洗， 7,500 rpm 離心 5 分鐘，吸掉上清液，並將細胞與接有 fluorescein isothiocyanate-conjugated 的 goat anti-mouse secondary IgG 或 goat anti-rabbit secondary IgG ( 1:100; Leinco Tec., St Louis, MO ) 室溫下避光培養 45 分鐘後，

7,500 rpm 離心 5 分鐘，吸掉二級抗體，加入 500 μl PBS 緩衝液，然後進行流 式細胞技術進行實驗，使用 FACSCalibur and CellQuest software ( BD Biosciences, San Jose, CA ) 分析 ( Tang CH et al., 2006 )。

第十節、Total RNA 萃取 ( Total RNA isolation )

將細胞培養於 6 孔培養皿中，待細胞長約九分滿後，吸掉培養液，以冰的 PBS 緩衝液清洗，再吸乾殘餘的 PBS 緩衝液，分別加入 500μl 的 TRIzol reagent ( Invitrogen Corpoation, California, USA )，搖晃均勻置於冰上 5 分鐘，待 細胞完全溶解，將細胞刮下，移至另一微量離心管中。室溫下靜置 5 分鐘再加 入100μl 氯仿 ( chloroform ) 劇烈振盪 1 分鐘，靜置於室溫 3 分鐘，於 4 ⁰C 以 12,000 rpm 離心 15 分鐘，樣品會形成 phenol-chloroform，中間白色層以及上 面透明水層。 RNA 大部分留在水層，小心將水層轉移到新的微量離心管，加 偵測 RNA 吸光值( UV/Visible spectrophotometer DU-800, Beckman Coulter )。

第十一節、反轉錄聚合酶連鎖反應 ( RT-PCR )

第十二節、即時定量聚合酶連鎖反應 ( Real-time Polymerase Chain Reaction, Real-time PCR )

即時聚合酶連鎖反應 ( Real-time Polymerase Chain Reaction, Real-time PCR ) 的原理為在進行 PCR 時同步偵測 PCR 產物隨著反應增加的狀況 ( 即為“real time” ) 利用所偵測到的產物回推樣品中原始基因之表現量。Real-time PCR 可分 為兩大方式：TaqMan 及 SYBR® GreenER^TM ( Invitrogen, Carlsbad, CA )。本研 究使用相對定量 SYBR® GreenER^TM 的原理是先設計一個 primer，而此 primer

是設計在我們要的一段 DNA 序列中，可以用來與單股 DNA 黏合，藉由

SYBR® GreenER^TM qPCR SuperMix 在 PCR 過程時，與 DNA 序列黏合的 primer，隨著 PCR 產物的增加，信號也隨著增強，因此可做相對定量的分析。

將 cDNA 取 10~100ng、SYBR® GreenER^TM qPCR SuperMix 取 10 μl、10μM primer 取 0.8μl ， 接 著 以 DEPC 水 加 至 20 μl 後 ， 將 樣 本 放 置 Applied Biosystems 7900 ( ABI prism 7900, CA, USA ) 進行相對定量分析。TaqMan real-time PCR 是用帶有螢光標記及螢光接受體的探針 ( probes ) : α2、α5、αν、β1、

第三章、實驗結果 (Result)

Adiponectin 引發人類前列腺腫瘤細胞轉移

先 前 研 究 指 出 adiponectin 能 刺 激 人 類 腫 瘤 細 胞 的 轉 移 和 侵 入 ( Spyridopoulos TN et al., 2007；Bråkenhielm E et al., 2004；Bub JD et al., 2006)。

本研究中，我們選用三株不同的人類前列腺腫瘤細胞株 ( PC3、DU145 及

LNCaP ) 進行 adiponectin 與人類前列腺腫瘤細胞轉移的關係。我們分別給予細 胞不同濃度之adiponectin，而依濃度增加造成 androgen-independent 的前列腺腫 瘤細胞 ( PC3、DU145 ) 移行，也直接影響了 androgen-dependent 的前列腺腫瘤 細胞移行 ( LNCaP )；在濃度 0.3 μg/ml 時，PC3 的移行能力表現有顯著的差異 (Fig.5)。

Adiponectin 造成人類前列腺腫瘤細胞移行與增加 α5β1 integirn 表現有關 先前的研究顯示，人類腫瘤細胞中有明顯的 integrins 表現 ( Wei Y et al., 2007 )。於是我們假設 integrins 可能參與在 adiponectin 影響前列腺腫瘤細胞的轉 移過程中。流式細胞技術分析 ( Flow cytometric analysis ) 與即時定量聚合酶連 鎖反應 ( qPCR ) 顯示，adiponectin 誘導了細胞表面上 α5β1 integrins 表現，而 在 α2、αν、β1、β3 及 α2β1 integrins 則沒有顯著的影響 ( Fig. 6A &6 B )。用 anti-α5β1 單株抗體 ( mAb ) ( 10 μg/ml ) 處理細胞 30 分鐘後進行細胞移行實驗 ( Migration assay ) ，實驗結果顯示抑制由 adiponectin 誘導的腫瘤細胞轉移 ( Fig.6C )。以上結果提出 adiponectin 是經由調控增加 α5β1 integrins 的表現來增 加前列腺腫瘤細胞的轉移。

AdipoR1/R2 接受器的參與和人類前列腺腫瘤細胞的轉移有關

之前報告指出，AdipoR1 大量表現於骨骼肌，AdipoR2 則主要表現於肝臟 ( Yamauchi T et al., 2003 )。然而 AdipoR1/R2 接受器在人類前列腺腫瘤細胞的表 現不是很明瞭。我們經由即時定量聚合酶連鎖反應來檢測前列腺腫瘤細胞之

比人類正常前列腺細胞 PZ-HPV-7 來的顯著；LNCaP 則是 AdipoR2 接受器表現 ( Fig.8A；上欄處)。接著我們直接檢測 p38 激酶活性對 adiponectin 的反應；藉 由偵測出p38 激酶之其中一種基質 [activating transcription factor (ATF)-2] 的磷 酸化表現顯示 adiponectin 的確增加了 p38 的活性 ( Fig.8A；下欄處)。當給予 前列腺癌細胞 ( PC3、DU145 及 LNCaP ) p38 抑制劑 ( SB203580；10 μM ) ( Fig.8B )；或是轉染 PC3 細胞之 p38 mutant 24 小時後 ( Fig.8C )，進行細胞移 行實驗、流式細胞技術分析 ( Fig.8D ) 及即時定量聚合酶連鎖反應 ( Fig.8E )，

可觀察到前列腺癌細胞株 PC3 的移行能力及 α5β1 的向上調節作用皆有顯著的 抑制現象。因此 p38 活化參與在 adiponectin 所調節細胞移行與 integrin 表現 中。研究顯示adiponectin 會透過 AMPK 的活化增加脂肪酸的氧化作用 ( Tomas

到前列腺腫瘤細胞 PC3 的移行能力及 α5β1 的向上調節作用皆有顯著的抑制 adiponectin 的作用之中。為了研究 p38 與 AMPK 上下游關係，給予細胞之 p38 抑制劑 ( SB203580；10 μM )，很明顯地抑制了 adiponectin 誘導的 AMPK 活性；

進一步地給予細胞之 AMPK 抑制劑 ( AraA；0.5 mM ) 或 ( Compound C；

10μM )，並不會影響 adiponectin 所增加 p38 kinase activity。因此，p38 可能作 為上游因子傳遞訊號給下游因子AMPK。以上結果指出，p38 及 AMPK 訊號傳 遞路徑參與調控由adiponectin 誘導的前列腺腫瘤細胞轉移。

NF-κB 訊號路徑參與調控由 adiponectin 誘導 integrin 的向上調節與細胞的移 行能力

之前研究指出，在人類腫瘤細胞的轉移和侵入中，與 NF-κB 轉錄因子的活

化參與有關 ( Boukerche H et al., 2007 )。為了進一步證明 NF-κB 訊號傳遞路徑 參與在由 adiponectin 調控增加前列腺腫瘤細胞的轉移中；我們給予細胞 NF-κB 抑制劑 ( PDTC；60μM ) 或 IκBα protease 抑制劑 ( TPCK；3μM ) 30 分鐘後。

(Fig.10A) 顯示由 adiponectin 誘導的前列腺腫瘤細胞的移行被抑制了；此外，

給予細胞 ( PDTC；60μM ) 或 ( TPCK；3μM ) 進行流式細胞技術分析及即時定 量聚合酶連鎖反應，顯示也拮抗了 adiponectin 誘導 α5β1 integrin 向上調節的作 用 ( Fig.10B & 10C )。以上結果指出 NF-κB 活化參與 adiponectin 誘導腫瘤細

給予細胞 ( PDTC；60μM ) 或 ( TPCK；3μM ) 進行流式細胞技術分析及即時定 量聚合酶連鎖反應，顯示也拮抗了 adiponectin 誘導 α5β1 integrin 向上調節的作 用 ( Fig.10B & 10C )。以上結果指出 NF-κB 活化參與 adiponectin 誘導腫瘤細