本實驗是使用熱壓印技術製備實驗所需溝槽試片，並且利用 PECVD 電漿技術處理實驗試片，來改變材料表面的親水性質。與食 品研究所合作培養所需的小鼠成肌細胞(C2C12)，將細胞放置於熱壓印
後的試片基板表面上進行細胞貼附生長的實驗。利用實驗觀察的結果 來探討表面微結構與表面改質對於細胞貼附生長的影響。
3-1 實驗流程
3-2 實驗設備
3-2.1 改變表面結構與性質之設備 (一) 熱壓轉印機台 (Hot Embossing)
利用簡單的熱壓印技術來壓印製成具有奈米結構的溝槽於材料 基板表面上，藉此改變基板表面的微結構型態。 如圖 3-1 所示。
圖3-1 熱壓轉印機台 (Hot Embossing)
(二) 電漿輔助化學氣相沈積設備 (PECVD)
PECVD 是以射頻(Radio Frequency)電源來提供 RF 電磁波，將回 應的氣體解離進而產生電漿。此電漿設備能在不改變材料本體的狀態 下，均勻的改變材料表面的化學特性與樣貌。本實驗是以改變材料表 面的親水性為主要目的。 如圖 3-2 所示。
圖 3-2 電漿輔助化學氣相沈積設備 (PECVD)
3-2.2 觀察分析表面結構與成肌細胞生長狀態之設備 (一) 掃描式電子顯微鏡 (S.E.M.)
掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope)是由接收材料 表面經由外加高能電子撞擊後所釋放出的電子作為顯像的依據，因為 含有景深的特性，對於材料表面三度空間之微架構的觀察，提供了非 常真實且方便的研判。本實驗是以SEM 作為觀察壓印母模板表面微 結構及試片上溝槽的方向性為主要目的。如圖3-3 所示。
圖 3-3 掃描式電子顯微鏡 (S.E.M.)
(二) 倒立式光學顯微鏡
倒立式光學顯微鏡其主要構造與一般光學顯微鏡相同，只是物鏡 與照明裝置顛倒。因為此設置的關係，物鏡與目鏡之間的工作距離拉 長，可直接將培養皿放置於顯微鏡操作台上進行顯微注射等工作。本 實驗是以觀察熱壓完後材料表面巨觀結構和成肌細胞的貼附與生長 為主要目的。如圖3-4 所示。
圖3-4 倒立式光學顯微鏡 (三) 相位差顯微鏡 (P.C.M.)
相位差顯微鏡(Phase Contrast Microscope)主要是利用相位差法的 光學顯微鏡。此儀器含有特定相位差物鏡、相位差聚光鏡與單色濾光 鏡。根據實驗標本的要求選擇適當的相位差物鏡。本實驗是以觀察成 肌細胞的貼附情況與判別試片溝槽方向，並且將觀察結果與其他顯微 鏡的結果相互比較為主要目的。如圖3-5 所示。
圖3-5 相位差顯微鏡 (P.C.M.) (四) 原子力顯微鏡 (A.F.M.)
原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope)含有微小探針通常是黏
貼在一懸臂式的彈簧片上，當探針頭接近待測材料表面時，因為力場 的關係而產生作用力(凡德瓦力)，造成彈簧片微小偏折。此儀器主要
是利用分子間的凡德瓦力作用來呈現材料的表面特性。本實驗是以 A.F.M.做為探測壓印母模板與試片溝槽的深度與形狀為主要目的。如 圖3-6 所示。
圖 3-6 原子力顯微鏡(A.F.M.)
3-2.3 細胞培養之設備 (一) 無菌操作平台
目的是維持一個無菌的操作空間，避免培養細胞時，所培養的細 胞受到外來的物質污染，導致菌種不純或細胞死亡。如圖3-7 所示。
圖3-7 無菌操作平台 (二) 離心機 (Centrifuge)
試管放入離心管並以離心力將試管內的物質沈澱進而造成細胞 與培養基(Medium)分離的儀器，如圖 3-8 所示。較常用於懸浮性細胞 (Suspension Cell)。
圖 3-8 離心機
(三) 水浴槽 (Water Bath)
將槽內水溫維持在適合細胞生長的 37℃，當細胞進行解凍時，
可將冷凍試管放入水槽中快速解凍。如圖3-9 所示。
圖3-9 水浴槽 (三) CO2培養箱 (Incubator)
以微電腦系統監控並利用紅外線感測來控制 CO2的濃度與箱內
溫度，使濃度與溫度不受到外界溼度的影響，藉此來控制細胞培養過 程中的環境溫度(恆溫 37℃)和調節 CO2的濃度大小以穩定培養基內 的酸鹼(PH)值。如圖 3-10 所示。
圖 3-10 培養箱
3-3 細胞培養實驗
3-3.1 前置處理之儀器與材料
(1) 冷凍細胞保存試管：C2C12 (Mouse muscle myoblast) (2) 培養瓶 (T75,T25 flask) (圖 3-11)
(3) 培養基：90% (D-DMEM) + 10% (FBS) (圖 3-12) (4) 抑制劑：trypsin-EDTA (圖 3-13)
(5) 冷凍保護劑：DMSO
(6) 血球計數盤 + 蓋玻片+ 計數器 (圖 3-14) (7) 細胞計數染劑：trypan blue
(8) 無菌磷酸生理緩衝液：PBS
圖3-11 培養瓶 (T25,T75 Flask)
圖3-12 培養基 90% (D-DMEM) + 10% (FBS)
圖3-13 Trypsin-EDTA
圖 3-14 計數器與血球計數盤
3-3.2 活化冷凍細胞
先將冷藏的培養基(Medium)(圖)取出並放置恆溫 37℃的水浴槽 中回溫，回溫後以70%的乙醇(ethanol)擦拭，將培養基移至無菌操作 平台內。從液態氮桶中取出冷凍細胞試管，立即放入37℃的水浴槽 (Water Bath)中快速解凍，輕輕搖晃試管使試管內的溶液能完全融
化，並以70% ethanol 擦拭試管外部，然後移至無菌操作平台內。使 用可調式微量吸管(Pipetman)(圖 3-15)取出 0.9ml 解凍的細胞懸浮液，
緩慢加入有培養基的培養瓶(Flask)內，均勻混合後，放入 CO2培養箱 內培養。另外，是否要去除冷凍保護劑(DMSO)，依細胞種類而異，
一般而言，大部分的細胞都不需要立即去除，如果真的要立即去除冷 凍保護劑，則將解凍後的細胞懸浮液加入含有培養基的離心試管內，
並且使用離心機以1000rpm 的轉速，離心五分鐘，使用電動吸量分注 器(Pipetboy)(圖 3-16)吸取出上方溶液，並加入新的培養基，混合均勻 後，放入CO2培養箱內培養。
圖3-15 可調式微量吸管 圖 3-16 電動吸量分注器
3-3.3 細胞計數
使用 Pipetman 吸取 50μl 的細胞懸浮液與 50μl trypan blue 等體積 溶液混合均勻於1.5ml 小離心試管內。在血球計數盤上蓋上蓋玻片，
然後取約15μl 的混合液加於血球計數盤上的凹槽內，放置於倒立試 顯微鏡下觀察，如果細胞是活的則不染色，反之，死的細胞則呈現暗 藍色。依細胞計數的計算法來推算細胞的存活數量，以判別培養基細 胞含量是否適合繼續培養。
3-3.4 小鼠成肌細胞培養
一般而言，細胞的培養方法就細胞特性可分為貼附式細胞
(Adhesion Cell)與懸浮式細胞(Suspension Cell)兩種。本實驗所培養的 小鼠成肌細胞(C2C12)屬於貼附型的細胞。
實驗剛開始我們必需先將原本 T75 Flask 內的舊培養基吸掉，然 後使用無菌磷酸生理緩衝液(PBS)洗滌細胞，避免瓶內殘留舊的細胞 代謝物質。接著加入2ml 的 trypsin-EDTA 溶液，目的是為了能切斷 細胞使其不能附著於flask 表面上，並使細胞呈現懸浮的狀態。使用 倒立式顯微鏡觀察，當細胞呈現圓粒狀時，表示已脫落分離表面，此 時吸掉瓶內的trypsin-EDTA 溶液，然後輕輕拍打培養瓶身，使細胞 自瓶壁脫落，接著加入適量的新鮮培養基，用pipetboy 吸管上下吸放 數次，以打散成團的細胞塊，混合均勻後，將溶液放進離心試管內離
心(轉速 1000rpm , 5 分鐘)，把細胞與培養基分離。我們可以用 1：2 的比例來稀釋，並移至新的培養瓶內。放入恆溫37℃、5% CO2培養 箱中，進行48~72 小時的細胞培養。
3-4 熱壓印實驗
3-4.1 實驗試片的準備
(一) 聚甲基丙烯酸甲酯 (PolymethylMethacrylate, PMMA)
聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)又稱為有機玻璃或是壓克力，主要是 由甲基丙烯酸甲酯單體(MMA)所聚合而成的高分子材料，分子量約 為50~100 萬。具有高透明度、耐候性、低價格、可塑性高易於機械 加工等優點，是經常用來替代玻璃的材料，對於溶液的酸鹼性也有一 定的穩定性。因為PMMA 具有良好的生物相容性與耐老化的特性，
所以目前在生醫材料上普遍應用於牙齒的填補材料、人工關節、人工 腎臟、隱形眼鏡等等。此外，可以利用PMMA 熱塑性材料來製作生 物晶片中的微流道系統。本研究就是利用PMMA 材料可塑性的優 點，使用熱壓印機台壓製具有溝槽區域的試片，觀察成肌細胞能否有 方向性的貼附。
(二) 聚苯乙烯 (Polystyrene, PS)
聚苯乙烯(PS)是一種無色透明的熱塑性高分子材料，本身具有高
於100 度的玻璃轉移溫度，且具有良好的剛性、透光性、絕緣性與耐 腐蝕性，材料容易加工成型，通常製作於日常用品、實驗容器與醫療 器材等方面。本實驗是使用由聚苯乙烯所製成的培養皿(Cell Culture Dish)並加工製程實驗所需的實驗試片。
3-4.2 實驗試片的前置處理 (1) PMMA 試片
實驗材料為 10cm × 8.4cm × 0.2cm 的 PMMA 平板，將平板切割 成1.2cm × 1.2cm 的小方格，如圖 3-17,3-18 所示。當要使用之前，
將試片外圍的膜紙撕除，然後利用乙醇清潔試片表面灰塵，並且使用 無塵紙擦拭，防止乙醇風乾後所遺留下的水痕與空氣中的微塵附於試 片表面上影響實驗結果。最後以去離子水清洗試片表面，擦乾後將材 料放至於防潮箱中保存，以供熱壓印實驗使用。
圖3-17 PMMA 平板 圖 3-18 PMMA 小方格
(2) Polystyrene 試片
實驗材料為實驗室裡常見的培養皿(Petri Dishes)，如圖 3-19 所 示，由於培養皿底盤表面經由電漿處理後親水性高，所以我們將培養 皿底盤切割出，加工製作成實驗所需的試片，試片的大小為1.8cm × 1.8cm ×0.1cm 的小方格，如圖 3-20 所示。其保存方法與 PMMA 相同，
以備熱壓實驗使用。
圖 3-19 PS 製成的培養皿 圖 3-20 PS 小方格
(3) 母模板
母模板是由鎳金屬材料所製成，可分成 U 型溝槽與 V 型溝槽兩 種。一般U 型溝槽的深度約為 200nm，寬度約為 400nm，V 型溝槽 的深度約為50nm，寬度約為 400nm。如圖 3-21~3-24 所示。
圖 3-21 U 型溝槽母模板 圖 3-22 V 型溝槽母模板
圖3-23 U 型母模板溝槽示意圖 圖 3-24 V 型母模板溝槽示意圖
3-4.3 熱壓印處理
本實驗室的熱壓機主要可分為兩部份，一部分為熱壓印平台，另
一部分為參數控制平台，如圖3-1 所示。熱壓印平台是由兩個壓縮平 台(P1,P2)所構成，為向上壓縮的方式進行壓印。一開始我們必需設定 熱壓機上下兩平台所需要的溫度，一般我們都會固定上方平台(P1)的 溫度約為30℃，但上平台會隨著壓印次數以及下平台溫度的影響而 呈現溫度約略上升的現象，我們暫時忽略不計。下平台(P2)為主要溫
度設定區域，我們可依待壓印材料本身的熔點來決定我們所需要的溫 度範圍，就PMMA 而言，溫度設定在 100℃~160℃的範圍之間。除 了溫度的設定外，還必須設定幫浦的上升速率、壓印所需的壓力和壓 印的時間。另外，為避免壓印後材料本身產生熱應變造成試片翹曲，
所以我們會設定第兩段壓印(S2)，其實驗設定參數如表 3-2 所示。
當 P2 溫度到達所需溫度時，我們先將母模板用乙醇清洗表面灰 塵顆粒，再用無塵紙擦拭乾淨，然後放置於P2 上。將欲壓印的基板 同樣用乙醇噴灑清洗表面後，使用去離子水做二次清洗的動作，然後 用無塵紙擦拭乾淨。放置母模板上方後，即可開始壓印。
壓印完成後，讓基板與母模板自然風乾脫落，然後將具有微溝槽 的試片放置防潮箱保存，以供日後培養細胞使用。
試片成品 具有奈米圖印的母模板
設定溫度壓力參數
壓印
脫膜 基板材料
試片成品 具有奈米圖印的母模板
設定溫度壓力參數 設定溫度壓力參數
壓印 壓印
脫膜 脫膜 基板材料
基板材料
圖 3-25 熱壓印流程示意圖
表3-1 電漿實驗參數表
表3-2 熱壓實驗參數表