中 華 大 學 碩 士 論 文

中 華 大 學 碩 士 論 文

題目：熱壓印奈米溝槽技術及其在小鼠

成肌細胞貼附生長之應用

系 所 別：機械與航太工程研究所 學號姓名：M09308032 曹雄程 指導教授：馬廣仁 博士

共同指導教授：簡錫新 博士

中華民國 九十五 年 七 月

中文摘要

本研究利用熱壓印(Hot Embossing)的方法，使 PMMA 與 PS 高分 子材料製成的試片經由轉印得到奈米溝槽結構，培養小鼠成肌細胞

(C2C12)於試片上並觀察細胞排列與生長的情形，藉此探討奈米結構對 於細胞貼附生長的影響，同時探討熱壓印過程中，溫度、壓力與持壓 時間等參數對於試片表面形貌的影響。

研究結果顯示熱壓印於 PMMA 材料的最佳參數為 150℃，壓印 壓力為 400 Kg；PS 材料的最佳參數為 130℃，壓印壓力為 500 Kg。

當壓印的溫度與壓力太低時，壓印出的表面溝槽並不完整。當 PMMA 壓印溫度高於 170℃與 PS 壓印溫度高於 150℃時，材料表面開始會產 生氣泡並發生嚴重的變形。此外，過高的壓印壓力容易造成試片表面 的破損。

U 型溝槽試片有利於引導細胞沿著溝槽方向貼附與生長，V 型溝 槽試片該現象並不明顯；主要是因為 U 型溝槽深寬比較大，且溝槽 凸起處面積較寬，有足夠的空間能讓細胞碰觸與移動。

關鍵字: 熱壓印、奈米溝槽、小鼠成肌細胞(C2C12)

Abstract

This study aims to investigate the effect of nano-grooved surface of material on the alignment and growth of myoblasts (C2C12).

Nano-grooved surface was fabricated on PMMA and PS polymer materials by using hot embossing method. The effects of working pressure, temperature and time duration on the surface morphologies of polymer materials are studied.

The optimum hot embossing conditions for PMMA and PS materials are the pressing temperature at 150℃ under a load of 400 Kg and 130℃under a load of 500 Kg respectively.

Hot embossing at a lower temperature and pressure

will lead to a blurred nano-grooved structure.

Hot embossing at temperatures higher than 170℃and 150℃ for PMMA and PS materials respectively, bubbles and severe distortion can be observed on the surface of the samples. Higher working pressure will cause damage on the nano-grooved surface.

The

U-grooved surface is more favorable to guide cell growth along the grooved direction comparing to

V-grooved surface, which is due to the

U-grooved surface

having a higher aspect ratio structure and providing sufficient contact area for the cell attachment and movement.

Keywords: hot embossing, nano-grooved surface, myoblasts (C2C12)

誌 謝

感謝研究所這兩年來細心教導我的指導教授 馬廣仁老師以及共 同指導教授 簡錫新老師，謝謝您們這段時間的督導與教誨，讓我在 求學的過程中受益良多，以至於能順利完成碩士學位，在此獻上我最 誠摯的謝意。同時感謝食品所 黃效民博士，由於您的指導與協助使 得我能順利地完成細胞培養方面的實驗。也感謝口試期間淡江大學 趙崇禮博士與中正理工學院 陳大同博士對本論文的悉心指導，使得 本論文內容更為完善。

此外，研究所求學期間，特別感謝雲鵬、

志曄

、柏青、泓均、偉 達、勝程、文豪等多位學長在課業與實驗上的指點與協助，還要感謝 文斌、建煌、信偉、信富等同學與書瑋、柏民、孟澤、彥明等學弟在 課業與生活上的相互扶持，使我在研究所的日子裡能順心順意。

最後要感謝我的家人與女友對我的支持、鼓勵與關心，讓我能無 後顧之憂地全力衝刺完成我的學業。僅將此論文獻給每一位曾給予我 幫助與支持的師長與朋友們，謝謝。

目 錄

中文摘要--- I 英文摘要--- II 誌謝--- III 目錄--- IV 表錄--- VII 圖錄--- VIII

一、前言--- 1

二、文獻回顧--- 3

2-1 奈米圖案轉印技術(Nanoimpring Technique)--- 3

2-1.1 熱壓型奈米轉印技術--- 4

2-1.2 奈米圖案轉印技術所面臨的問題--- 5

2-2 細胞在基板上的貼附作用(Cell Adhesion on the Substrate)--- 8

2-2.1 細胞外間質(Extracellular Matrix)--- 8

2-2.2 整連蛋白(Integrin)--- 10

2-2.3 細胞骨架系統(Cell Cytoskeleton System)--- 12

2-3 細胞的貼附行為(Cell Attachment)--- 18

2-3.1 細胞運動特性(Cell Motility)--- 19

2-4 影響細胞生長行為的方法--- 21

2-4.1 表面化學改質的影響--- 22

2-4.2 表面微結構的影響--- 23

三、實驗設備與步驟--- 30

3-1 實驗流程--- 30

3-2 實驗設備--- 31

3-2.1 改變表面結構與性質之設備--- 31

3-2.2 觀察分析表面結構與成肌細胞生長狀態之設備--- 32

3-2.3 細胞培養之設備--- 35

3-3 細胞培養實驗--- 37

3-3.1 前置處理之儀器與材料--- 37

3-3.2 活化冷凍細胞--- 39

3-3.3 細胞計數--- 40

3-3.4 小鼠成肌細胞培養--- 40

3-4 熱壓印實驗--- 41

3-4.1 實驗試片的準備--- 41

3-4.2 實驗試片的前置處理--- 42

3-4.3 熱壓印處理--- 45

四、結果與討論--- 47

4-1 熱壓參數對於材料表面的影響--- 47

4-1.1 溫度對於 PMMA 與 PS 材料表面的影響--- 47

4-1.2 壓力對於 PMMA 與 PS 材料表面的影響--- 53

4-1.3 持壓時間對於 PMMA 與 PS 材料表面的影響--- 54

4-2 等方向奈米溝槽對於小鼠成肌細胞 C2C12貼附生長的影響--- 57

4-2.1 U 型與 V 型奈米溝槽對於細胞貼附生長的影響--- 57

4-2.2 基板表面親水性對於細胞貼附生長的影響--- 67

五、結論--- 73

六、參考文獻--- 76

表 錄

表 2-1 細胞外間質的組成成份--- 9

表 2-2 重要的細胞貼附分子--- 19

表 3-1 電漿實驗參數表--- 46

表 3-2 熱壓實驗參數表--- 46

圖 錄

圖 2-1 熱壓型奈米轉印技術--- 4

圖 2-2 壓印平行度不佳--- 6

圖 2-3 壓印壓力不均勻--- 7

圖 2-4 整連蛋白的基本構造--- 11

圖 2-5 Integrin 與 RGD Sequence 結合--- 11

圖 2-6 細胞骨架系統的三種組成構造--- 12

圖 2-7 各種細胞的細胞骨架構造與功能--- 13

圖 2-8 微管的主要構造圖--- 14

圖 2-9 微絲的主要構造圖--- 15

圖 2-10 中間絲的主要構造圖--- 16

圖 2-11 數種中間絲蛋白質的結構--- 17

圖 2-12 Myosin 延著肌動蛋白絲的移動機制--- 20

圖 2-13 細胞移動機制之步驟--- 21

圖 2-14 自組裝技術原理--- 23

圖 2-15 等方向性溝槽--- 25

圖 2-16 不同表面粗糙度的基板--- 26

圖 2-17 各種細胞貼附於粗糙的表面--- 27

圖 2-18 針狀陣列--- 29

圖 2-19 柱狀陣列--- 29

圖 2-20 凹型孔洞--- 29

圖 2-21 凸型孔洞--- 29

圖 2-22 蜂槽型孔洞--- 29

圖 3-1 熱壓轉印機台(Hot Embossing)--- 31

圖 3-2 電漿輔助化學氣相沈積設備(PECVD)--- 32

圖 3-3 掃描式電子顯微鏡(S.E.M.)--- 32

圖 3-4 倒立式光學顯微鏡--- 33

圖 3-5 相位差顯微鏡(P.C.M.)--- 34

圖 3-6 原子力顯微鏡(A.F.M.)--- 34

圖 3-7 無菌操作平台--- 35

圖 3-8 離心機--- 35

圖 3-9 水浴槽--- 36

圖 3-10 培養箱--- 36

圖 3-11 培養瓶--- 37

圖 3-12 培養基 90% (D-DMEM) + 10% (FBS)--- 38

圖 3-13 Trypsin-EDTA--- 38

圖 3-14 計數器與血球計數盤--- 38

圖 3-15 可調式微量吸管--- 39

圖 3-16 電動吸量分注器--- 39

圖 3-17 PMMA 平板--- 42

圖 3-18 PMMA 小方格--- 42

圖 3-19 PS 製成的培養皿--- 43

圖 3-20 PS 小方格--- 43

圖 3-21 U 型溝槽母模板--- 44

圖 3-22 V 型溝槽母模板--- 44

圖 3-23 U 型母模板溝槽示意圖--- 44

圖 3-24 V 型母模板溝槽示意圖--- 44

圖 3-25 熱壓印流程示意圖--- 45

圖 4-1 PMMA 材料壓印後，表面出現干涉條紋--- 49

圖 4-2 PMMA 材料於高溫時，材料表面產生小氣泡--- 50

圖 4-3 PS 材料壓印溫度過低時，造成表面干涉條紋分佈不均--- 50

圖 4-4 壓印後 PS 材料表面干涉條紋均勻分佈--- 51

圖 4-5 PMMA 材料高溫下軟化變形--- 51

圖 4-6 PS 材料高溫下軟化變形且有小氣泡的產生--- 52

圖 4-7 脫模不良導致壓印試片表面微結構破損影響細胞生長--- 52

圖 4-8 高溫壓印脫模，造成母模板表面沾黏與破損--- 53

圖 4-9 壓印壓力過大造成 PMMA 試片表面嚴重破損--- 55

圖 4-10 壓印壓力過大造成 PMMA 試片凹陷--- 55

圖 4-11 壓印壓力大於 1000Kg 時，造成 PS 試片表面破損--- 56

圖 4-12 溫度過低且持壓時間過短，造成表面干涉條紋分佈不均勻 --- 57

圖 4-13 AFM 探測下 V 型母模板溝槽圖形--- 59

圖 4-14 AFM 探測下 U 型母模板溝槽圖形--- 59

圖 4-15 SEM 觀察下 V 型溝槽圖形 (30K)--- 60

圖 4-16 SEM 觀察下 V 型溝槽圖形 (60K)--- 60

圖 4-17 SEM 觀察下 U 型溝槽圖形 (30K)--- 61

圖 4-18 SEM 觀察下 U 型溝槽圖形 (60K)--- 61

圖 4-19 正常小鼠成肌細胞排列方式--- 62

圖 4-20 利用 SEM 拍攝正常小鼠成肌細胞排列方式--- 62

圖 4-21 正常小鼠成肌細胞分化時，樣貌如樹枝狀--- 63

圖 4-22 小鼠成肌細胞於 U 型溝槽上貼附排列的情況--- 63

圖 4-23 利用 SEM 拍攝小鼠成肌細胞在 U 型溝槽上貼附排列的情況 --- 64

圖 4-24 小鼠成肌細胞於 U 型溝槽試片上分化時具有同方向性排列 --- 64

圖 4-25 利用 SEM 拍攝小鼠成肌細胞成形時仍能保持同方向排列 --- 65

圖 4-26 小鼠成肌細胞於 V 型溝槽上貼附排列的情況--- 65

圖 4-27 熱壓轉印後 V 型溝槽基板示意圖--- 66

圖 4-28 細胞在溝槽凸起處上所能碰觸的空間之示意圖--- 66

圖 4-29 PMMA 材料表面未經任何改質處理，其接觸角為 65°--- 69

圖 4-30 PS 材料表面未經任何改質處理，其接觸角為 64°--- 69

圖 4-31 經電漿處理後 PS 材料的培養皿底盤，其接觸角為 45°--- 70

圖 4-32 PMMA 經氬電漿處理後，其接觸角變為 49°--- 70

圖 4-33 PMMA 經氧電漿處理後，其接觸角變為 47°--- 71

圖 4-34 經氬電漿處理後，細胞貼附排列的情況--- 71

圖 4-35 經氧電漿處理後，細胞貼附排列的情況--- 72

第一章 前言

近年來，奈米科技的研究受到全世界的重視，其中奈米圖案轉印 技術為最受矚目的項目之一，其應用範圍廣泛，可用於生醫工程上，

像是生物晶片的微流道系統和微感測器等等。隨著生活品質的改善，

人類對於健康問題變的相當重視。因此，生醫材料(Biomaterials)與組 織工程(Tissue Engineering)的發展也逐漸成為大家熱門研究的方向。

隨著生醫技術的發達，許多材料與裝置的問題也相繼被發現，像 是生物相容性(Biocompatibility)、免疫排斥反應(Immunological

Rejection)、血栓鈣化(Thrombus & Calcification)…等等材料上所面臨 的問題。我們希望這些外來物質在植入人體後與我們身體組織不會有 免疫排斥的現象，但這理念目前仍很難實現，主要是因為人類大部分 的細胞都具有貼附性，而細胞的貼附行為是影響生物相容與細胞生長 的重要因素，如何使細胞貼附生長在高分子材料上，在基板上進行增 生並且使細胞能夠貼附在材料表面上，是我們必須去克服的問題。

由於人工器官所使用的材料不能完全被我們人體所接受，容易造 成免疫排斥、血栓鈣化等現象，一般來說，要避免這些有害的現象，

使用自體本身組織細胞來修補我們損壞器官無疑是最佳的解決辦 法；所以本論文以熱壓印奈米溝槽並將細胞體外培養使組織再生的理 念為實驗主軸，希望藉著表面微結構的改變與表面化學改質來影響細

胞生長的機制，讓細胞能成有規律性的同方向排列，進而培養出能組 成人體器官的組織細胞，像是培養出有同一方向性的成肌細胞進而得 到整齊的肌肉束，以作為肌肉萎縮的修補。

表面微結構對於細胞的貼附生長具有重要的影響性，不同的材料 表面微結構，像是針狀/柱狀微陣列、奈米孔洞、等方向性的微結構 與不同深寬比的微結構等等。這些微結構都會間接影響到細胞貼附與 生長的行為，所以探討材料表面的微結構與細胞貼附生長之間的相關 聯性，以利於我們培養理想的組織細胞，達到組織修補或再生的理念。

本研究是以小鼠的成肌細胞(C2C12)作為細胞培養實驗的主體，由

於成肌細胞原本的排列方向是呈現雜亂四射的形態，我們希望藉由像 是使用熱壓印(Hot Embossing)技術使材料表面轉印產生奈米結構或 者利用電漿(Plasma)表面改質處理來改變材料表面的化學特性等等，

觀察細胞是否能貼附在材料面上並且能成等方向性的生長排列，來探 討細胞貼附與材料表面微結構及表面改質兩者之間的影響。

第二章 文獻回顧

2-1 奈米圖案轉印技術 (Nanoimpring Technique)

隨著生活品質的提高，人們對於週遭用品逐漸講求精細與攜帶方 便為主要需求。因此奈米科技的研究開始受到全世界的重視，其中奈 米圖案轉印技術為奈米產業製造技術中最受矚目的項目之一，此轉印 技術最早是在1995年由Stephen Y. Chou[1,2]教授所提出，他的構想主 要是源自於印刷術中壓印(Imprint)的概念，希望能將具有奈米圖案的 模版經由高溫高壓的機械力以等比例的壓印複製奈米圖案於光阻矽 基板上。由於此技術不受到光學微影繞射的限制並且具有加工速度 快、解析度高與成本便宜等優點，所以目前廣泛的應用在生物晶片與 微流道裝置、光學組件、電子元件、儲存光碟片等方面。也因為其應 用範圍廣泛，因此更被譽為可以改變未來世界的科技之一，所以特別 受到現代人的重視與研究[5]。

自1995年發表以來，各種創新研究的技術也相繼公開發表，目前 此技術主要可分為四大類[3]：

(1) 熱壓型奈米轉印技術 (Hot Embossing Nanoimprint Lithography) (2) 軟微影蝕刻技術 (Soft Lithography)

(3) 紫外光硬化奈米轉印技術 (UV-Cured Nanoimprint Lithography) (4) 雷射輔助直接轉印技術 (Laser-Assisted Direct Imprint)

2-1.1 熱壓型奈米轉印技術

此為最早發展的奈米轉印技術，由Stephen Y. Chou教授所提出的 概念，其原理如下：

先將母模板(Master)或模具(Mold)刻上欲製作的圖案，將其放置 於待壓印之基板(Substrate)的成形材料(Resist)上，加熱至材料本身的 玻璃轉移溫度(Tg)點後，將母模板直接壓於成形材料之中，在高溫高 壓的環境下維持一段時間，讓成形材料能充分的填入母模板上的微結 構，然後再執行降溫與脫模的動作，便完成熱壓轉印成形的步驟，最 後再將成形材料所殘留的部份利用蝕刻去除，即完成整個奈米轉印程 序[4]。如圖2-1所示。

圖 2-1 熱壓型奈米轉印技術[4]。

目前熱壓印的缺點在於母模板在高溫高壓的環境下，其與高分子 材料之間會有熱膨脹的問題，因此會造成轉印後成品尺寸的誤差以及 脫模不易等問題。若需要大量生產，則必須考慮到大面積轉印時表面 的均勻性和高溫所造成的熱變形效應。

2-1.2 奈米圖案轉印技術所面臨的問題[4~8]

自從1995年發表此概念後，便開啟了奈米圖案轉印技術研究的熱

潮，為了能獲得較完整的奈米微結構圖案，許多問題待去探討與解 決，以下為目前轉印技術在發展上所面臨的問題，其整理如下：

(1) 成形材料

成形材料的選擇必須考慮其是否具有充填性，且壓印成形後材 料的穩定性，像是吸濕性、收縮性與抗壓強度等，這些特性都會影響 到壓印後的品質。許多文獻指出，黏度越低的材料其成形所需的溫度 及壓力就越低，則成形容易，但是穩定性與強度則變差。另外，使用 較低玻璃轉移溫度的成形材料，可以降低溫度所造成的熱效應。

(2) 溫度的控制

由於高分子材料對溫度的敏感性較高，不同溫度下的材料特性像 是黏滯性、流動性與收縮率等等都會不相同，因此影響到材料能否充 分地填入具有奈米微結構的母模板裡。一般而言，高分子材料需加熱

到玻璃轉移溫度(Tg)以上才能開始進行轉印的程序。當轉印大面積

時，如果溫度控制不完善則無法控制整體的均溫性，將會導致材料表 面多處具有不同的材料物理特性。

(3) 壓印壓力與平行度

轉印製程中，欲將具有奈米圖案的母模板均勻地壓印於基板的成

形材料上，整體的壓印深度必須均勻，即母模板與基板之間的平行度 (Parallelism)要好，整體壓印的壓力必須平均分佈。當欲壓印的面積

增大時，平行度不良容易造成壓印深度不齊且微結構與基板之間不平 行，如圖2-2所示。另外，壓印的過程中，壓印力的分佈也是影響壓

印結果的重要關鍵，當壓印力分布不均時，容易使表面的微結構變 形，無法達到設計之需求，如圖2-3所示。

圖 2-2 壓印平行度不佳[7]。

圖 2-3 壓印壓力不均勻[7]。

(4) 脫模形式

當壓印完成後，脫模為確保壓印成品完整性的重要步驟，如果脫 模的方式不正確，將會導致已壓印完成的成品表面微結構破損，同時 高分子材料也較容易沾黏於母模板上。一般造成母模板與材料之間脫 模不易的原因可分為物理模式與化學模式兩大類。

物理模式：材料與母模板之間的成形收縮以及平行度差異太大造 成微結構之間產生機械互鎖(Interlock)的行為。

化學模式：材料與母模板之間的化學鍵結造成沾黏的現象，目前 已有文獻研究以電漿沉積(Plasma Deposition)或自組裝(Self-Assembly) 的方式將母模板表面覆蓋一層抗沾黏的單分子層。

(5) 模具的使用壽命

目前模具的製作大多採用電子束微影蝕刻技術(E-Beam

Lithography)，其優點為不需使用任何光罩即可製備所需的奈米圖

案，缺點為製作成本高且加工的速度慢，並不適合做為量產成形。模 具在壓印過程中須經過高溫、高壓及冷卻等環境條件，因此模具所產 生的內應力影響著所能使用的壽命。此外，抗沾黏層的破損也是間接 影響模具使用壽命的一大因素。

2-2 細胞在基板上的貼附作用 (Cell Adhesion on the Substrate) 細胞間具有貼附性，它們彼此間會因為基板的一些外在環境因 素，像是表面的粗糙度、表面的官能基、表面微結構與表面化學改質 等，而影響到其貼附與生長的反應。細胞在貼附的過程中，蛋白質的 受體與配體會相互結合形成鍵結，這些鍵結會穿過細胞外間質

(Extracellular Matrix, ECM)到達細胞骨架(Cell Cytoskeleton)。這種蛋 白質鍵結的方式，不但可以影響細胞的運動，也可以定出細胞外間質 分子的方向，這些細胞分子會與細胞骨架系統相互結合反應，進而影 響到細胞的貼附。

2-2.1 細胞外間質 (Extracellular Matrix)

細胞外間質是在組織細胞周遭很容易觀察到的物質，細胞在發育

與生長機能的運作時需與環境週遭的分子相互作用才能有好的效 果，細胞外間質的組成分子就是負責調節功能的其中之一[9]。在組 織中，除了血液以外的所有組織成份幾乎都含有細胞外間質，其中以 結締組織中的含量最為多。細胞外間質主要是由多種大型生物分子所

組成的網絡狀結構，其成份含有纖維蛋白{膠原蛋白(Collagen)、彈性 蛋白(Elastin)}、糖蛋白{纖連蛋白(Fibronectin)、層黏連蛋白

(Laminin)}、蛋白多醣三大類[10,11]。如表 2-1 所示。

表2-1 細胞外間質的組成成份[11]。

細胞外間質是影響細胞生長與機能運作過程中的重要物質，其中 主要的作用影響性為[12]:

(1) 影響細胞形態穩定的作用 (2) 促進細胞遷移的作用

(3) 調節細胞增殖與分化的作用

因為細胞外間質的特殊結構，使得細胞具有支撐與貼附的特性。

另外，經由整連蛋白(Integrin)與相關訊息之間的傳遞進而會影響 到細胞的移動(Movement)、生長(Proliferation)、分化(Differentiation) 與破損(Disruption)等行為。同時也會誘發細胞骨架(Cell Cytoskeleton) 進行重組的動作。

2-2.2 整連蛋白 (Integrin)

整連蛋白是屬於內在膜蛋白質(Integral Membrane Proteins, IMP)

系列的一種，它具有影響胚胎發育、保持組織完整、白血球細胞的循 環供給與吞噬作用(Phagocytosis)、傷口的瘉合(Wound Healing)與血管 新生(Angiogenesis)等方面的影響，同時也是在脊椎動物細胞與細胞貼 附之間的主要受體(Receptor)[13,14]。

整連蛋白是一種異源二聚體(Heterodimeric)的結構，主要由一個 α 次體與一個 β 次體所組成。兩者都是屬於糖蛋白類(Glycoproteins)，

且含有一個長的細胞外區域(Extracellular Domain)與一個短的胞質尾 區(Cytoplasmic Tail)。目前已知有 16 種 α 次體與 8 種 β 次體，排列組 合可形成至少22 種不同的 Heterodimeric 受體[13,15]。如圖 2-4 所示。

許多種類的整連蛋白會與細胞外間質上的RGD 結合並且操控著細胞 的貼附、延展、分化、遷移與細胞週期等功能。如圖2-5 所示[16]。

當Integrin與細胞外間質結合後，兩者會相互聚集並且與一些骨 架細胞內蛋白(Intracellular Proteins)結合，同時形成一個黏附點(Focal

Adhesions)，黏附點的組成可視為整合引導細胞與細胞外基質的一個 巨型蛋白質複合體，不僅可以促進細胞骨架的形成，來提供細胞附著 與支撐的機械性，也可以傳遞一些訊號，進一步地調節許多重要的細 胞功能，像是細胞的增殖、遷移、與存亡[17]。

圖2-4 整連蛋白的基本構造[13]。

圖2-5 Integrin 與 RGD Sequence 結合[16]。

2-2.3 細胞骨架系統 (Cell Cytoskeleton System) [18-21]

細胞骨架存在於所有的真核細胞(Eukaryotes)中，是由蛋白質分 子所構成的三維空間纖維網狀組織，為一種動態的構造，細胞骨架主 要的作用在於維持細胞型態、促進胞內蛋白質的合成、支撐細胞內的 胞器並且幫助其運動與產物養分的運輸、細胞內外相關訊息的傳遞 等。此外，當細胞進行有絲分裂時，細胞骨架能幫助染色體分離或者 是細胞分裂。對於細胞基因的表現和調節，細胞骨架也同樣扮演著重 要的角色。

細胞骨架主要是由微管(Microtubules)、微絲(Microfilament)、中 間絲(Intermediate Filament)三種構造所組成的複雜網絡系統。如圖2-6, 圖2-7 所示。三種構造的組成與特性如下：

圖 2-6 細胞骨架系統的三種組成構造[22]。

圖 2-7 各種細胞的細胞骨架構造與功能[13]。

1. 微管 (Microtubules) [19,23-25]

在哺乳類動物中，除了紅血球以外，所有的細胞都存在有微管，

其為一外徑約24 nm的中空管狀構造，管壁的厚度約為5 nm，主要是 由13個微管蛋白原纖維(Protofilaments)平行排列而成，經由MTOC (Microtubule Organizing Center)向外放射出去。每個微管蛋白原纖維 是由 α 與 β 微管蛋白(Tubulins)次體所組成。如圖2-8所示。每個次 體會和兩個GTP相結合，一個可以解離成GDP，另一個則無法解離，

並以頭尾相連接(Head-to-Tail)的方式形成絲狀的微管蛋白原纖維。α 與 β-tubulins兩者為分子量相同的三維結構，所以可以緊密的排列結

合著。此外，微管是一種不對稱的極性構造，含有正端(Plus End)與 負端(Minus End)，微管的負端被埋於中心粒(Centrosome)中，正端則

游離於細胞質內並且向細胞表面延伸。可藉由負端來行去聚合作用 (Depolymerization)，正端則是持續聚合(Polymerization)來維持結構的 穩定。

圖 2-8 微管的主要構造圖[24]。

細胞中微管的主要功能為：支撐穩定細胞的結構、構成鞭毛與紡 錘體、固定胞器的位置、影響胞器與胞內物質間的移動等。胞器與細 胞內的大分子傳遞，主要是藉由微管上各種具專一性的移動蛋白 (Motor Proteins)來進行傳遞動作，藉由移動蛋白可運輸像是氣泡 (Vesicles)、溶體(Lysosome) 、粒線體(Mitochondrion)與染色體 (Chromosome)等胞器。

2. 微絲 (Microfilament) [13,27-29]

微絲普遍的存在於真核細胞中，主要是由直徑約8 nm的肌動蛋白 絲(Actin Filament)所組成的雙螺旋結構。如圖2-9所示。微絲會結合肌 球蛋白(Myosin)、肌動蛋白(Actin)、結合蛋白(Association Protein)三個

化學成分來組成化學機械系統，產生機械運動。所以微絲可以確定細 胞的表面特徵並且使細胞能夠產生運動及收縮的行為。

圖2-9 微絲的主要構造圖[26]。

微絲與微管相同也具有正端和負端兩個極性構造，雖然兩端均能

行聚合或去聚合等作用，但是聚合作用仍主要進行於正端，去聚合作 用則主要於負端進行。聚合作用主要是藉由ATP水解所產生的能量，

使細胞聚合或去聚合作用能達到一個動態平衡的狀態。

細胞中，微絲除了參與形成肌原纖維和微絨毛等穩定構造外，還 具有以下功能：

(1) 形成應力纖維(Stress Fiber) (2) 細胞的變形運動

(3) 細胞質分裂

(4) 支撐作用與訊息傳導

總而言之，微絲具有許多的功能與作用，而且不同的細胞會呈現

不同的表現，在肌肉細胞內可組成肌絲或收縮蛋白，在非肌性細胞內 則會行支撐作用、訊息的傳導與非肌性的運動。

3. 中間絲 (Intermediate Filament) [13,28,30,32]

中間絲又稱為中間纖維，是一個中空的骨架結構，直徑介於微管 與微絲之間，約為10 nm 左右，其分布大都於細胞質內。如圖2-10所

示。它是細胞骨架中最穩定的成分，可行支撐作用並且使細胞具有張 力與抗剪應力，但是不具有任何的極性構造。

圖 2-10 中間絲的主要構造圖[31]。

中間絲是一種型態非常相似且化學組成差異明顯的蛋白質，其主

要成分都較微管與微絲複雜。根據組織的免疫性可分為五類：角蛋白 (Keratin)、波形絲蛋白(Vimentin)、結蛋白(Desmin)、神經絲蛋白 (Neurofilament Protein)、膠質纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein)等。如圖2-11所示。

圖 2-11 數種中間絲蛋白質的結構[32]。

總結以上三種組成成分(微管、微絲、中間絲)的論點可知，細胞 骨架系統其功能與作用包含如下：

(1) 維持細胞的基本型態 (2) 參與蛋白質的合成

(3) 可協助細胞間養分的傳遞與運輸 (4) 調控細胞週期，影響細胞的生長 (5) 基因的表達與訊息的傳遞

所以細胞骨架無疑是影響細胞生長、分化、死亡的重要構造。

2-3 細胞的貼附行為 (Cell Attachment)

一般的細胞都具有貼附生長的特性，在生長的過程中，不論是在 天然的細胞外間質或者是人工合成的骨架材料，絕大多數的細胞都會 先貼附於基材表面上，然後再開始進行延展與繁殖的活動。許多研究 認為細胞的貼附行為主要是受細胞外間質的影響所造成，它可以影響 到細胞的型式、組織的形貌與生長條件。但是有學者發現，含有血清 (Serum)的標準細胞培養基(Culture Medium)，它會引導細胞陣列成型 並且讓細胞可以與活的有機體(In Vivo)之間相互連結，同時允許細胞 貼附於玻璃(In Vitro)基材表面[37]。此外，引導細胞的貼附行為主要 也受到多種受體(Receptors)與細胞外間質的交互作用所影響，目前研

究發現已有多種蛋白質的序列可以與受體相互結合，例如整連蛋白 (Integrin)，並且可以有效的增進細胞與基質之間的貼附行為，這些含 有特定蛋白質序列的分子，我們可稱之為細胞貼附分子(Cell Adhesion Molecules)，是組織工程上重要的成分。表2-2為目前幾種重要的配體 (Ligand)與其所存在的蛋白質序列[33]。

除了上敘外，有研究發現v-Src同樣可以調控著細胞的貼附行為 與移動性，當將一正常的纖維母細胞(Fibroblast)注入Src後，可以觀察 到細胞內的肌動蛋白骨架與細胞外間質之間的連結變得更為緊密，並 且會抑制到細胞的移動力。這表示著Src會減弱整連蛋白與骨架之間

的連結，藉此來調控細胞的貼附與移動性。所以我們可以了解到它與 細胞之間的貼附與移動行為，有著密不可分的關係存在[38-39]。

表2-2 重要的細胞貼附分子[33]。

2-3.1 細胞運動特性 (Cell Motility) [34-36]

細胞的運動機制主要是由機動蛋白(Motor Protein)所主導，並且 需要酵素的輔助，將化學能轉換成機械能。肌凝蛋白(Myosin)一般被

認為是影響細胞膜運動時能量轉換最主要的物質，Myosin會藉由水解 ATP來轉換化學能成為機械能，假如肌動蛋白絲(Actin Filament)分佈 的方向性對於肌凝蛋白分子的連結是有益的話，則Myosin將會沿著纖 維的方向來滑動。當分子的兩尾端移動受到限制時，機械力會導致兩 平行肌動蛋白絲的移動方向相反。如圖2-12所示。另外，當細胞附著

在細胞外間質時，細胞表面的整連蛋白會受到細胞外間質的刺激而開 始產生聚集的現象，這個動作會使得許多與細胞移動相關的結構蛋白 與訊息分子被聚集於某一特定區域，這個特定區域的結構就是我們前 面所提到的黏附點(Focal Adhesion)。當細胞移動時，細胞的前端會因 為肌動蛋白的聚合作用(Actin Polymerization)而將偽足(Lamellipodia)

向前延伸，此時細胞新接觸的細胞外間質區域會產生新的黏附點。再 者，細胞尾端會因為肌動球蛋白(Actomyosine)產生的收縮力，使得尾 端的黏附點與接觸面產生分離，因而使細胞能夠向前行進。如圖2-13 所示。

圖2-12 Myosin 延著肌動蛋白絲的移動機制[35]。

圖 2-13 細胞移動機制之步驟[36]。

2-4 影響細胞生長行為的方法

二十世紀初以來，有許多研究顯示，材料除了生物相容性外，材 料本身的表面特性也會影響到細胞的一些行為。一般材料的表面特型 可以區分為物理與化學兩大類，這些特性包括：表面的方向性

(Orientation)、粗糙度(Roughness)、奈微米結構(Nano-Micro

Structured)、電漿改質(Plasma)、表面幾何(Surface Geometry)、自我 組裝(Self-Assembly)等等。這些表面特性會直接或間接的影響到細胞 的移動(Movement)、貼附(Adhesion) 、分化(Differentiation)與生長 (Proliferation)等行為。

2-4.1 表面化學改質的影響

表面化學改質主要是利用化學的方式去改變材料表面的特性，其 主要方式有電漿表面改質與自組裝(Self Assembly)技術等等，利用不 同的表面化學特性，來改變細胞貼附生長的行為。

1. 電漿表面改質 (Plasma Surface Modification)[70-71]

電漿屬於物質中的第四態，其內在的離子可以激發一些能量與基 板表面起反應，使材料表面發生物化的改變，因此做到表面改質的效 果。利用電漿表面改質主要是因為其具有處理細微基板材料與不改變 主體只改變表面特性與形貌的能力，同時具有清潔基板表面有毒物質 以達到殺菌的效果，所以廣泛被應用於一些生醫材料的處理。目前還 可以透過電漿處理的方式濺鍍一些利於細胞生長行為的物質，來增加 細胞貼附的能力。

2. 自組裝技術 (Self Assembly)[72-73]

自組裝系統是近幾年來在材料科學與物理化學界中廣被研究的 技術，主要是利用分子間特殊的交互作用及其專一的特性，產生自我 排列的現象。當材料表面具有一些特殊活性基團時，將基板浸泡在適 當的溶液下，此時材料表面活性基團的分子會與基板接觸並相互作 用，使基團顯露於表面，達到表面改質的效果，且分子間也會彼此相 互作用，因此排列形成一個整齊的結構。如圖2-14所示。

圖 2-14 自組裝技術原理[72]。

2-4.2 表面微結構的影響

細胞的生長與材料表面的微結構探討，早在二十世紀初期就有學 者發現並加以研究探討，當時只是藉由培養細胞時，觀察到細胞對於 某些材料表面的結構好像會直接或間接的影響到細胞生長的行為，並 無確切的研究發現。接著數十年的時間，許多專家學者近一步地藉著 培養不同的細胞來討論這兩者之間的關係。

就目前表面微結構的類型來區分，我們大致可分成三大類：微結 構的方向性、表面的粗糙度與奈微米陣列/孔洞等。不同的結構條件 對於細胞的生長會有不同的影響，像是內皮細胞的增生、纖維母細胞 的遷移、血管細胞的新生、傷口的修補、醫療裝置植入等等，希望藉 此來增加材料植入人體後的免疫反應與生物相容性[40][41][42]。

1. 微結構的方向性 (Orientation)

具有方向性的溝槽結構，如圖 2-15 所示，早於 1912 年就由學者 Harrison[43]發現，他從培養細胞的結果當中意外發現等方向表面微

結構造成細胞貼附與排列的改變，因此推論其可能相關的影響性。

Brunette et al.[44]是第一位使用微製造(Microfabricated)加工基板來培 養細胞的人，他證實微結構對於細胞生長具有影響性。P. Clark et al.[45]利用雷射蝕刻技術製作出超細微(Ultrafine)的等方向結構，其溝 槽深度範圍大約為100~400nm，寬度約為 260nm，並且將不同的細胞 培養在此細微的結構上。他發現不同的細胞對於微結構的生長反應有 所不同，他認為微結構的型態能改變細胞並且控制細胞的貼附行為，

同時他也認為微溝槽的深度較為寬度或間距對於細胞的貼附行為更 為重要。Wòjciak-Stothard et al.[46]利用深度為 30~282nm 的等方向性 溝槽培養鼠類的巨噬細胞(Murine Macrophages)，並且觀察出不同深

度對於細胞生長的影響，他發現並不是越深的溝槽對於細胞的生長就 有越好的效果，但是深度確實影響到了細胞的貼附生長行為。Steven Lenhert et al.[47]使用 LB(Langmuir-Blodgett)薄膜蝕刻技術製作具有

等方向性的溝槽，其溝槽深度約50~150nm，在溝槽上培養小牛骨膜 的成骨細胞(Osteoblast)，他觀察到成骨細胞隨著培養時間與溝槽深度 的改變，細胞會呈現很明顯的方向性的排列，但是並非絕大部分的細

胞都能有效的排列，深度越深，細胞越能與溝槽成等方向的排列。同 時他還觀察到，在細胞貼附的過程中，不僅成骨細胞會方向性排列，

連細胞骨架內的肌動蛋白、整連蛋白、輔肌動蛋白等的排列方向也都 會呈現規則性的排列。F. Yang et al.[48]利用 L 型-聚乳酸[Poly(L-lactic acid)]及電紡織法(Electrospinning)技術製作奈/微米纖維支架並培養神 經幹細胞(NSCs)，經實驗觀察發現，細胞的延展與生長都會順著纖維 支架的方向，但是纖維直徑的大小並沒有明顯地影響到細胞排列的方 向性。此外，奈米支架的細胞分化率比微米支架高。Bangshang Zhu et al.[49]利用 YAG 雷射製作方向性溝槽，將神經膠腫瘤細胞(C6 glioma cell)培養於表面具有微溝槽的 PS 基板上，經由觀察發現，具有規律 性的奈米結構，會引導細胞排列與同方向性生長。Daniela C. Popescu et al.[50]則是將肌肉細胞(C2C12)培養於 POEGMA 上並觀察，皆得到 了微結構方向性影響細胞生長行為的結果。

圖 2-15 等方向性溝槽[51][52]。

2. 表面的粗糙度 (Roughness) [53~59]

所謂的Roughness一般是指材料表面未經過任何標準化的處理，

不規則的粗糙表面通常會增進細胞與材料表面的貼附。另外，表面的 粗糙度對於一些黏附性較高的細胞，像是成肌細胞(Myoblast)、纖維 母細胞(Fibroblast)、成骨細胞(Osteoblast)、上皮組織細胞(Epithelial Tissue Cell)等的生長、遷移與分化都會有一定的影響，早期學者藉由 不同的粗糙度表面來觀察基板對於細胞所造成的影響，近年來，許多 學者更是嘗試使用多種改變表面粗糙度的方法，像是雷射蝕刻、砂紙 研磨、電漿表面處理等來製作各式各樣粗糙度的基板，並且觀察基板 表面對於細胞的影響性，最後都證實了表面的粗糙度會直接或間接地 影響到細胞的生長、遷移、分化與貼附等行為。

圖2-16 不同表面粗糙度的基板[57]。

圖2-17 各種細胞貼附於粗糙的表面[58]。

3. 奈微米陣列/孔洞 (Nano-Micro Scale Array & Cavities)

表面微陣列與孔洞結構，其目的與表面粗糙度相似，主要是希望 藉由不同的陣列形狀或者孔洞，像是針狀(Needle)或者是柱狀(Pillar) 的陣列表面與凹凸型或者蜂巢(Honeycomb)形狀的孔洞，如圖

2-18~2-22所示，使得表面會產生不同的表面粗度值，與表面粗糙度 不同的是在於其具有較規則性的表面形狀。

就微陣列的部分，Craighead et al.[60]與Turner et al.[61]等多位學 者主要是把LRM55細胞與初期星型膠質細胞(Primary Astrocytes)培養 在矽基製程(Silicon-Based)的柱狀陣列上，經由他們的觀察，得知細

胞在貼附生長時，喜歡在柱狀基板表面勝過於平坦的基板表面。

Rovensky et al.[62]則是培養老鼠的纖維母細胞於矽柱狀陣列基板 上，柱高約為65~90μm，經由多次觀察，他發現到柱的高低會影響到 纖維母細胞的延展(Spread)與生長等行為。Wen-Ta Su et al.[63]等人同 樣是使用矽柱狀陣列基板，直徑約為1~3μm，柱高約為1~10μm，用

來培養老鼠的骨髓間質細胞(Bone Marrow Stromal)，他們驗證了 Rovensky的說法，證實高度確實會影響到細胞的貼附、延展與生長等

行為，同時他們也發現到，越密集的陣列基板對於細胞的生長分布效 果有越好的趨勢。

就孔洞的部份，Zinger et al.[64]等人使用具有直徑10~100μm等等 不同孔洞的表面，用來培養人體的骨骼細胞(MG63 Cells)，經由觀察，

他發現到細胞的生長貼附行為會隨著孔洞的大小而改變，他觀察到細 胞於直徑30μm 或 100μm時，細胞有較好的貼附與生長，於10μm時，

細胞則沒有較明顯的改變。當細胞培養多天時，較平坦的基板，細胞 生長的情形沒有比具有孔洞的基板好，這證實了表面粗糙度對於細胞 生長行為的影響。Yuqing Wan et al.[65]利用聚苯乙烯(PS)製成基板來 培養成骨細胞，其孔洞的直徑約為0.45~2.2μm，經由觀察，他發現到 細胞有明顯的貼附情形，卻沒有明顯的增生跡象，因此說明了細胞並 非完全會隨著孔洞的大小而改變，可能會隨著細胞本身特性而間接的 去影響到細胞與基板間的交互作用。Hiroshi Sunami et al.[66]，Masaru Tanaka et al.[67]與Yukako Fukuhira et al.[68]等多位研究人員，利用類

似蜂巢結構的孔洞來培養各式不同的細胞，像是纖維母細胞、肝細胞 (Hepatocyte)等等，且利用不同的高分子材料來製作基板，經由觀察，

他們發現到培養於蜂巢孔洞的細胞都較培養於一般平坦的細胞有明

顯增生的現象，且貼附性越好的細胞有越明顯的趨勢。

就前面幾大項而言，雖然不同的細胞對於不同的粗糙度、孔洞與

高度皆有不相同的影響結果，但就細胞的貼附與生長整體而言，表面 微結構對於細胞確實具有很大的影響性。

圖 2-18 針狀陣列[69]。 圖 2-19 柱狀陣列[63]。

圖 2-20 凹型孔洞[64]。 圖 2-21 凸型孔洞[65]。

圖 2-22 蜂巢型孔洞[66]。

第三章 實驗設備與步驟

本實驗是使用熱壓印技術製備實驗所需溝槽試片，並且利用 PECVD 電漿技術處理實驗試片，來改變材料表面的親水性質。與食 品研究所合作培養所需的小鼠成肌細胞(C2C12)，將細胞放置於熱壓印

後的試片基板表面上進行細胞貼附生長的實驗。利用實驗觀察的結果 來探討表面微結構與表面改質對於細胞貼附生長的影響。

3-1 實驗流程

3-2 實驗設備

3-2.1 改變表面結構與性質之設備 (一) 熱壓轉印機台 (Hot Embossing)

利用簡單的熱壓印技術來壓印製成具有奈米結構的溝槽於材料 基板表面上，藉此改變基板表面的微結構型態。 如圖 3-1 所示。

圖3-1 熱壓轉印機台 (Hot Embossing)

(二) 電漿輔助化學氣相沈積設備 (PECVD)

PECVD 是以射頻(Radio Frequency)電源來提供 RF 電磁波，將回 應的氣體解離進而產生電漿。此電漿設備能在不改變材料本體的狀態 下，均勻的改變材料表面的化學特性與樣貌。本實驗是以改變材料表 面的親水性為主要目的。 如圖 3-2 所示。

圖 3-2 電漿輔助化學氣相沈積設備 (PECVD)

3-2.2 觀察分析表面結構與成肌細胞生長狀態之設備 (一) 掃描式電子顯微鏡 (S.E.M.)

掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope)是由接收材料 表面經由外加高能電子撞擊後所釋放出的電子作為顯像的依據，因為 含有景深的特性，對於材料表面三度空間之微架構的觀察，提供了非 常真實且方便的研判。本實驗是以SEM 作為觀察壓印母模板表面微 結構及試片上溝槽的方向性為主要目的。如圖3-3 所示。

圖 3-3 掃描式電子顯微鏡 (S.E.M.)

(二) 倒立式光學顯微鏡

倒立式光學顯微鏡其主要構造與一般光學顯微鏡相同，只是物鏡 與照明裝置顛倒。因為此設置的關係，物鏡與目鏡之間的工作距離拉 長，可直接將培養皿放置於顯微鏡操作台上進行顯微注射等工作。本 實驗是以觀察熱壓完後材料表面巨觀結構和成肌細胞的貼附與生長 為主要目的。如圖3-4 所示。

圖3-4 倒立式光學顯微鏡 (三) 相位差顯微鏡 (P.C.M.)

相位差顯微鏡(Phase Contrast Microscope)主要是利用相位差法的 光學顯微鏡。此儀器含有特定相位差物鏡、相位差聚光鏡與單色濾光 鏡。根據實驗標本的要求選擇適當的相位差物鏡。本實驗是以觀察成 肌細胞的貼附情況與判別試片溝槽方向，並且將觀察結果與其他顯微 鏡的結果相互比較為主要目的。如圖3-5 所示。

圖3-5 相位差顯微鏡 (P.C.M.) (四) 原子力顯微鏡 (A.F.M.)

原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope)含有微小探針通常是黏

貼在一懸臂式的彈簧片上，當探針頭接近待測材料表面時，因為力場 的關係而產生作用力(凡德瓦力)，造成彈簧片微小偏折。此儀器主要

是利用分子間的凡德瓦力作用來呈現材料的表面特性。本實驗是以 A.F.M.做為探測壓印母模板與試片溝槽的深度與形狀為主要目的。如 圖3-6 所示。

圖 3-6 原子力顯微鏡(A.F.M.)

3-2.3 細胞培養之設備 (一) 無菌操作平台

目的是維持一個無菌的操作空間，避免培養細胞時，所培養的細 胞受到外來的物質污染，導致菌種不純或細胞死亡。如圖3-7 所示。

圖3-7 無菌操作平台 (二) 離心機 (Centrifuge)

試管放入離心管並以離心力將試管內的物質沈澱進而造成細胞 與培養基(Medium)分離的儀器，如圖 3-8 所示。較常用於懸浮性細胞 (Suspension Cell)。

圖 3-8 離心機

(三) 水浴槽 (Water Bath)

將槽內水溫維持在適合細胞生長的 37℃，當細胞進行解凍時，

可將冷凍試管放入水槽中快速解凍。如圖3-9 所示。

圖3-9 水浴槽 (三) CO2培養箱 (Incubator)

以微電腦系統監控並利用紅外線感測來控制 CO2的濃度與箱內

溫度，使濃度與溫度不受到外界溼度的影響，藉此來控制細胞培養過 程中的環境溫度(恆溫 37℃)和調節 CO2的濃度大小以穩定培養基內 的酸鹼(PH)值。如圖 3-10 所示。

圖 3-10 培養箱

3-3 細胞培養實驗

3-3.1 前置處理之儀器與材料

(1) 冷凍細胞保存試管：C2C12 (Mouse muscle myoblast) (2) 培養瓶 (T75,T25 flask) (圖 3-11)

(3) 培養基：90% (D-DMEM) + 10% (FBS) (圖 3-12) (4) 抑制劑：trypsin-EDTA (圖 3-13)

(5) 冷凍保護劑：DMSO

(6) 血球計數盤 + 蓋玻片+ 計數器 (圖 3-14) (7) 細胞計數染劑：trypan blue

(8) 無菌磷酸生理緩衝液：PBS

圖3-11 培養瓶 (T25,T75 Flask)

圖3-12 培養基 90% (D-DMEM) + 10% (FBS)

圖3-13 Trypsin-EDTA

圖 3-14 計數器與血球計數盤

3-3.2 活化冷凍細胞

先將冷藏的培養基(Medium)(圖)取出並放置恆溫 37℃的水浴槽 中回溫，回溫後以70%的乙醇(ethanol)擦拭，將培養基移至無菌操作 平台內。從液態氮桶中取出冷凍細胞試管，立即放入37℃的水浴槽 (Water Bath)中快速解凍，輕輕搖晃試管使試管內的溶液能完全融

化，並以70% ethanol 擦拭試管外部，然後移至無菌操作平台內。使 用可調式微量吸管(Pipetman)(圖 3-15)取出 0.9ml 解凍的細胞懸浮液，

緩慢加入有培養基的培養瓶(Flask)內，均勻混合後，放入 CO2培養箱 內培養。另外，是否要去除冷凍保護劑(DMSO)，依細胞種類而異，

一般而言，大部分的細胞都不需要立即去除，如果真的要立即去除冷 凍保護劑，則將解凍後的細胞懸浮液加入含有培養基的離心試管內，

並且使用離心機以1000rpm 的轉速，離心五分鐘，使用電動吸量分注 器(Pipetboy)(圖 3-16)吸取出上方溶液，並加入新的培養基，混合均勻 後，放入CO2培養箱內培養。

圖3-15 可調式微量吸管 圖 3-16 電動吸量分注器

3-3.3 細胞計數

使用 Pipetman 吸取 50μl 的細胞懸浮液與 50μl trypan blue 等體積 溶液混合均勻於1.5ml 小離心試管內。在血球計數盤上蓋上蓋玻片，

然後取約15μl 的混合液加於血球計數盤上的凹槽內，放置於倒立試 顯微鏡下觀察，如果細胞是活的則不染色，反之，死的細胞則呈現暗 藍色。依細胞計數的計算法來推算細胞的存活數量，以判別培養基細 胞含量是否適合繼續培養。

3-3.4 小鼠成肌細胞培養

一般而言，細胞的培養方法就細胞特性可分為貼附式細胞

(Adhesion Cell)與懸浮式細胞(Suspension Cell)兩種。本實驗所培養的 小鼠成肌細胞(C2C12)屬於貼附型的細胞。

實驗剛開始我們必需先將原本 T75 Flask 內的舊培養基吸掉，然 後使用無菌磷酸生理緩衝液(PBS)洗滌細胞，避免瓶內殘留舊的細胞 代謝物質。接著加入2ml 的 trypsin-EDTA 溶液，目的是為了能切斷 細胞使其不能附著於flask 表面上，並使細胞呈現懸浮的狀態。使用 倒立式顯微鏡觀察，當細胞呈現圓粒狀時，表示已脫落分離表面，此 時吸掉瓶內的trypsin-EDTA 溶液，然後輕輕拍打培養瓶身，使細胞 自瓶壁脫落，接著加入適量的新鮮培養基，用pipetboy 吸管上下吸放 數次，以打散成團的細胞塊，混合均勻後，將溶液放進離心試管內離

心(轉速 1000rpm , 5 分鐘)，把細胞與培養基分離。我們可以用 1：2 的比例來稀釋，並移至新的培養瓶內。放入恆溫37℃、5% CO2培養 箱中，進行48~72 小時的細胞培養。

3-4 熱壓印實驗

3-4.1 實驗試片的準備

(一) 聚甲基丙烯酸甲酯 (PolymethylMethacrylate, PMMA)

聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)又稱為有機玻璃或是壓克力，主要是 由甲基丙烯酸甲酯單體(MMA)所聚合而成的高分子材料，分子量約 為50~100 萬。具有高透明度、耐候性、低價格、可塑性高易於機械 加工等優點，是經常用來替代玻璃的材料，對於溶液的酸鹼性也有一 定的穩定性。因為PMMA 具有良好的生物相容性與耐老化的特性，

所以目前在生醫材料上普遍應用於牙齒的填補材料、人工關節、人工 腎臟、隱形眼鏡等等。此外，可以利用PMMA 熱塑性材料來製作生 物晶片中的微流道系統。本研究就是利用PMMA 材料可塑性的優 點，使用熱壓印機台壓製具有溝槽區域的試片，觀察成肌細胞能否有 方向性的貼附。

(二) 聚苯乙烯 (Polystyrene, PS)

聚苯乙烯(PS)是一種無色透明的熱塑性高分子材料，本身具有高

於100 度的玻璃轉移溫度，且具有良好的剛性、透光性、絕緣性與耐 腐蝕性，材料容易加工成型，通常製作於日常用品、實驗容器與醫療 器材等方面。本實驗是使用由聚苯乙烯所製成的培養皿(Cell Culture Dish)並加工製程實驗所需的實驗試片。

3-4.2 實驗試片的前置處理 (1) PMMA 試片

實驗材料為 10cm × 8.4cm × 0.2cm 的 PMMA 平板，將平板切割 成1.2cm × 1.2cm 的小方格，如圖 3-17,3-18 所示。當要使用之前，

將試片外圍的膜紙撕除，然後利用乙醇清潔試片表面灰塵，並且使用 無塵紙擦拭，防止乙醇風乾後所遺留下的水痕與空氣中的微塵附於試 片表面上影響實驗結果。最後以去離子水清洗試片表面，擦乾後將材 料放至於防潮箱中保存，以供熱壓印實驗使用。

圖3-17 PMMA 平板 圖 3-18 PMMA 小方格

(2) Polystyrene 試片

實驗材料為實驗室裡常見的培養皿(Petri Dishes)，如圖 3-19 所 示，由於培養皿底盤表面經由電漿處理後親水性高，所以我們將培養 皿底盤切割出，加工製作成實驗所需的試片，試片的大小為1.8cm × 1.8cm ×0.1cm 的小方格，如圖 3-20 所示。其保存方法與 PMMA 相同，

以備熱壓實驗使用。

圖 3-19 PS 製成的培養皿 圖 3-20 PS 小方格

(3) 母模板

母模板是由鎳金屬材料所製成，可分成 U 型溝槽與 V 型溝槽兩 種。一般U 型溝槽的深度約為 200nm，寬度約為 400nm，V 型溝槽 的深度約為50nm，寬度約為 400nm。如圖 3-21~3-24 所示。

圖 3-21 U 型溝槽母模板 圖 3-22 V 型溝槽母模板

圖3-23 U 型母模板溝槽示意圖 圖 3-24 V 型母模板溝槽示意圖

3-4.3 熱壓印處理

本實驗室的熱壓機主要可分為兩部份，一部分為熱壓印平台，另

一部分為參數控制平台，如圖3-1 所示。熱壓印平台是由兩個壓縮平 台(P1,P2)所構成，為向上壓縮的方式進行壓印。一開始我們必需設定 熱壓機上下兩平台所需要的溫度，一般我們都會固定上方平台(P1)的 溫度約為30℃，但上平台會隨著壓印次數以及下平台溫度的影響而 呈現溫度約略上升的現象，我們暫時忽略不計。下平台(P2)為主要溫

度設定區域，我們可依待壓印材料本身的熔點來決定我們所需要的溫 度範圍，就PMMA 而言，溫度設定在 100℃~160℃的範圍之間。除 了溫度的設定外，還必須設定幫浦的上升速率、壓印所需的壓力和壓 印的時間。另外，為避免壓印後材料本身產生熱應變造成試片翹曲，

所以我們會設定第兩段壓印(S2)，其實驗設定參數如表 3-2 所示。

當 P2 溫度到達所需溫度時，我們先將母模板用乙醇清洗表面灰 塵顆粒，再用無塵紙擦拭乾淨，然後放置於P2 上。將欲壓印的基板 同樣用乙醇噴灑清洗表面後，使用去離子水做二次清洗的動作，然後 用無塵紙擦拭乾淨。放置母模板上方後，即可開始壓印。

壓印完成後，讓基板與母模板自然風乾脫落，然後將具有微溝槽 的試片放置防潮箱保存，以供日後培養細胞使用。

試片成品 具有奈米圖印的母模板

設定溫度壓力參數

壓印

脫膜 基板材料

試片成品 具有奈米圖印的母模板

設定溫度壓力參數 設定溫度壓力參數

壓印 壓印

脫膜 脫膜 基板材料

基板材料

圖 3-25 熱壓印流程示意圖

表3-1 電漿實驗參數表

表3-2 熱壓實驗參數表

第四章 結果與討論

本研究主要的目的是使用熱壓奈米圖案轉印技術，使基板表面能 被轉印出具有奈米圖案的微結構，並且將小鼠成肌細胞(C

2

C

12

)培養

於基板表面上，來觀察具有奈米尺寸的微溝槽對於小鼠成肌細胞的生 長與貼附的影響性。

4-1 熱壓參數對於材料表面的影響

由於本實驗是以熱壓印的方式製作欲培養細胞之基板，且熱壓印 的原理在於利用高溫高壓來轉印複製具有奈米圖案的溝槽於其他基 板材料上，所以熱壓印的溫度高低與壓力大小對於材料表面具有很重 大的影響性。本熱壓實驗參數針對溫度、壓力與持壓時間這三項來做 改變並且觀察討論，溫度範圍100℃ ~ 190℃，壓力範圍 400Kg ~ 1100Kg，持壓時間範圍 10 sec~120 sec。接下來分別就 PMMA 與 PS 兩 種高分子材料去探討溫度、壓力與持壓時間對於這兩種基板材料在熱 壓印時的影響與結果。

4-1.1 溫度對於 PMMA 與 PS 材料表面的影響

為了了解溫度會如何影響到材料壓印後的結果，所以最初實驗溫

度是以100℃為基準，壓印的時候上平台溫度依然維持在 30℃，然後

放至具有奈米溝槽的母模板於下平台中央，設定壓力為400Kg，持壓 時間為90 秒，接著壓印。結果發現 PMMA 試片外觀並無明顯的改變，

而且試片表面出現了干涉條紋，只是此條件的干涉條紋並不是特別的 清楚易見，後來改變溫度為130℃，持壓 90 秒，壓力固定不變，結 果發現壓印後的試片表面干涉條紋有較前者明顯；為了探討溫度高低 對於PMMA 材料的影響，所以試著把下平台溫度調高。將溫度調高 至150℃，壓力不變仍然維持在 400Kg，持壓時間 90 秒，壓印出來 的結果比130℃的試片還好，且表面干涉條紋分佈均勻，如圖 4-1 所 示。後來經培養細胞後證實，此數據為本論文實驗PMMA 材料壓印 最佳參數。只是此最佳參數壓印結果仍有一缺點，就是壓印後材料表 面會有些微的凸起，依照判斷可能是因為熱壓程序結束的瞬間，壓力 與熱對材料表面產生了應變而造成此現象。為了改善此現象，改採用 分段壓印，設定兩段式壓力與壓印時間，以避免瞬間的熱應變造成表 面凸起。接著持續將下平板溫度升高至160℃，此時可觀察到 PMMA 試片表面開始有小氣泡的產生，如圖4-2 所示。其主要原因是因為材 料本身具有吸濕性，當表面溫度瞬間昇高時，內部殘留水分來不及蒸 發所造成。當溫度高於170℃時材料整體開始有嚴重的軟化變形現 象，初步探討可能是因為壓印溫度已經高於PMMA 材料的玻璃轉移 溫度(Tg)太多，因此造成 PMMA 材料整體開始產生軟化變形的現象。

本實驗的另一壓印基板材料為聚苯乙烯(PS)，因為本身為熱塑性 材料且具有高於100℃的玻璃轉移溫度，所以很適合作為熱壓印的試 片材料。實驗起初溫度也是設定為 100℃，壓力為 400Kg，持壓時間 90 秒，不過壓印出來的結果並不是太好，表面的干涉條紋分佈不平 均，如圖4-3 所示，接著將溫度提高為 130℃，其餘壓印參數不變，

得到了干涉條紋分佈均勻的試片，如圖4-4 所示。如果將溫度提高至 150℃以上時，PS 材料開始有軟化變形與小氣泡產生的現象。

當溫度過高時，PMMA 與 PS 材料均會有軟化變形的現象產生，

如圖4-5,4-6 所示。也由於高溫使材料軟化，使得試片與母模板之間 貼合的更為緊密，當脫模時，非常不容易自然脫模，容易使脫模後的 試片表面奈米溝槽斷裂，影響誘導細胞成方向性貼附排列的行為，如 圖4-7 所示。同時還會造成母模板表面有沾黏甚至破損的現象產生，

如圖4-8 所示，影響往後試片的壓印結果。

圖 4-1 PMMA 材料壓印後，表面出現干涉條紋

圖 4-2 PMMA 材料於高溫時，材料表面產生小氣泡

圖 4-3 PS 材料壓印溫度過低時，造成表面干涉條紋分佈不均

圖 4-4 壓印後 PS 材料表面干涉條紋均勻分佈

圖 4-5 PMMA 材料高溫下軟化變形

圖 4-6 PS 材料高溫下軟化變形且有小氣泡的產生

圖 4-7 脫模不良導致壓印試片表面微結構破損影響細胞生長

圖4-8 高溫壓印脫模，造成母模板表面沾黏與破損 4-1.2 壓力對於 PMMA 與 PS 材料表面的影響

壓力條件對於本論文熱壓印實驗而言也是一項很重要的實驗參 數，實驗壓力設定範圍為 400Kg~1100Kg，主要目的在於觀察壓力的 大小對於PMMA 與 PS 兩種高分子在壓印時材料表面的影響。在固 定材料壓印溫度的條件下，壓印PMMA 材料溫度為 150℃，PS 材料 溫度則為130℃，分別以不同的壓力數值壓印。經由熱壓印實驗結果 可觀察到，當壓力數值到達700Kg 時，PMMA 材料表面開始有破損 與凹陷的現象產生，如圖4-9,4-10 所示，當壓力數值越高時，材料表 面破損的現象也跟著越嚴重。但是PS 材料在 700Kg 壓印時，卻不會 有表面破損的現象產生，且壓印後的表面干涉條紋分佈均勻。直到壓

力高於1000Kg 時，PS 材料表面才會開始產生些微的破損現象，如圖 4-11 所示。為了更了解壓力對 PMMA 材料的影響，後續實驗試著採

用較厚的PMMA 材料，其厚度約為 0.35cm (原 PMMA 材料厚度約為 0.2cm)，壓印結果發現，當壓力數值為 500Kg 時，PMMA 材料表面 就開始有破損的現象產生，且壓力越高破損現象越為嚴重。由此結果 觀察我們可知，當材料的厚度越厚時，所能承受的壓力負載較低，又 因為材料有室溫潛變的特性，所以隨著負載加大、時間增長會導致應 力開裂，因此材料表面有破損的現象。為了改善此現象，我們只能選 擇較薄的基板，且用較低的壓力數值來壓印。

4-1.3 持壓時間對於 PMMA 與 PS 材料表面的影響

除了壓力會影響材料表面破損外，持壓時間的長短也會影響到材

料壓印後的結果。本論文熱壓實驗所設定的持壓時間範圍為

10sec~120sec，固定熱壓印材料的溫度與壓力參數，以不同的持壓時 間去觀察壓印後 PMMA 與 PS 兩種材料表面的結果。結果發現當溫度較 低時，需採用較長的持壓時間來壓印，表面的干涉條紋比較能均勻分 佈，如此才能得到較好的微溝槽試片，反之，如果溫度過低且持壓時 間過短時，則壓印出來的試片表面干涉條紋會呈現分布不均勻的現 象，不利於後續細胞培養使用，如圖4-12 所示。當溫度較高時，則 需採用較短的持壓時間，如果持壓時間過久，此時 PMMA 與 PS 材料都

會開始有軟化變形的現象，而且有些 PMMA 材料表面會有小氣孔的產 生，並不適合作為培養細胞的微溝槽試片，因此須採用短時間持壓才 能避免材料產生軟化變形，且試片表面比較不會有小氣泡的產生。

圖4-9 壓印壓力過大造成 PMMA 試片表面嚴重破損

圖 4-10 壓印壓力過大造成 PMMA 試片凹陷

圖 4-11 壓印壓力大於 1000Kg 時，造成 PS 試片表面破損

圖 4-12 溫度過低且持壓時間過短，造成表面干涉條紋分佈不均勻

4-2 等方向奈米溝槽對於小鼠成肌細胞(C2C12)貼附生長的影響 由於許多文獻討論過等方向微溝槽對於細胞的生長與貼附都有 一定的影響性，且發現不同的細胞對於不同的溝槽尺寸都有不同的影 響性，所以本論文實驗以培養小鼠的成肌細胞為主，培養於熱壓印後 表面具有奈米溝槽的試片上，並且進行討論像是溝槽尺寸、電漿表面 改質等等對於小鼠成肌細胞貼附與生長的影響。

4-2.1 U 型與 V 型奈米溝槽對於細胞貼附生長的影響

本論文實驗使用兩種表面具有奈米溝槽的母模板，一種是溝槽形

狀為V 型的奈米溝槽，另一個則為 U 型的奈米溝槽，其母模板在 A.F.M.(原子力顯微鏡)下探測出來的微溝槽圖形，如圖 4-13,4-14 所 示。V 型溝槽之間的寬度約為 400nm，深度約為 50nm，U 型溝槽之 間的寬度同樣約為400nm，深度則約為 200nm。母模板材料為鎳(Ni) 所製成，將母模板放置於基板材料上，然後使用熱壓印的方法壓製，

使基板材料表面含有奈米溝槽，然後將壓印後具有奈米溝槽的試片拿 來培養小鼠成肌細胞。

將小鼠成肌細胞培養於兩種不同溝槽的試片上，並且放置在有足

夠培養基的培養皿裡，然後將培養皿放置於環境條件為恆溫37℃和 5% CO2的培養箱裡，放置72 小時的時間培養，72 小時後以倒立式 顯微鏡來觀察小鼠成肌細胞於試片上生長的情形。

原本小鼠成肌細胞是呈現雜亂四散的方向，如圖 4-19,4-20 所 示，且細胞分化時像樹枝狀一樣，如圖4-21 所示。將細胞培養於熱 壓印的溝槽試片後，實驗觀察發現，U 型溝槽試片所培養的成肌細胞 有方向性的排列，V 型溝槽試片則是方向性排列不明顯。在倒立式顯 微鏡下觀察我們可得知，細胞放置於U 型溝槽試片上 3~5 小時後開 始有規律性的貼附排列，數小時後細胞開始增生，增生期間細胞開始 有同方向性的排列增生，直到最後成形階段，細胞都是照著試片表面 溝槽同方向性貼附生長，如圖4-22~4-25 所示。細胞於 V 型溝槽試片 上則是沒有規律性的貼附排列，與正常細胞貼附排列的情況相似，呈 現雜亂四散的樣子，其細胞規律排列生長的情況較U 型不理想，如 圖4-26 所示。由此觀察結果判斷可能是 U 型的溝槽較深，V 型的溝 槽較淺，因此U 型溝槽的深寬比較 V 型大，所以對於細胞有較好的 誘導效果，可以順著溝槽方向排列生長。另一個推論是因為轉印出來 的V 型溝槽試片其溝槽凸起處的寬度變得十分細窄，因此沒有足夠 的空間能讓細胞的觸角去碰觸與移動，導致未能獲得好的誘導效果使 細胞方向性排列。如圖4-27 所示。而 U 型溝槽試片轉印出來的溝槽 凸起處寬度並沒有很大的改變，因此細胞有好的空間能去碰觸與移 動，所以能誘導細胞呈同方向性的排列生長。

圖 4-13 AFM 探測下 V 型母模板溝槽圖形

圖 4-14 AFM 探測下 U 型母模板溝槽圖形

圖4-15 SEM 觀察下 V 型溝槽圖形 (30K)

圖4-16 SEM 觀察下 V 型溝槽圖形 (60K)

圖4-17 SEM 觀察下 U 型溝槽圖形 (30K)

圖4-18 SEM 觀察下 U 型溝槽圖形 (60K)

圖 4-19 正常小鼠成肌細胞排列方式

圖4-20 利用 SEM 拍攝正常小鼠成肌細胞排列方式

圖4-21 正常小鼠成肌細胞分化時，樣貌如樹枝狀

圖4-22 小鼠成肌細胞於 U 型溝槽上貼附排列的情況

圖4-23 利用 SEM 拍攝小鼠成肌細胞在 U 型溝槽上貼附排列的情況

圖4-24 小鼠成肌細胞於 U 型溝槽試片上分化時具有同方向性排列

圖4-25 利用 SEM 拍攝小鼠成肌細胞成形時仍能保持同方向排列

圖4-26 小鼠成肌細胞於 V 型溝槽上貼附排列的情況

圖 4-27 熱壓轉印後 V 型溝槽基板示意圖

● ●

●

●

V型

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U型

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●

●

V型

●

U型

圖4-28 細胞在溝槽凸起處上所能碰觸的空間之示意圖

50nm

400nm

50nm

400nm

熱壓印後 V型溝槽母模板

熱壓轉印後V型溝槽基板

4-2.2 基板表面親水性對於細胞貼附生長的影響

在實驗的過程中，PMMA 材料所壓印出來的微溝槽試片雖然能 使小鼠成肌細胞呈現同方向性的貼附排列，但是當細胞成形時，細胞 卻容易漂浮於培養基上，造成實驗拍攝定位不便。反觀PS 試片上細 胞貼附情況良好而且不會造成漂浮的現象，實驗拍攝也較PMMA 試 片方便。由於肌肉細胞喜好貼附於較親水的環境裡，因此我們著手研 究PMMA 與 PS 兩種試片表面的親水性對於細胞貼附的影響。

PMMA 原本就是屬於親水性的高分子材料，在未經過任何表面 改質的狀況下，其水珠與材料表面的接觸角為 65°，如圖 4-29 所示。

而PS 材料在未經任何表面改質的狀況下，其接觸角為 64°，如圖 4-30 所示。本實驗所使用的PS 材料試片則是由培養皿底盤製成，因為培 養皿底盤需要有較高的親水性，對於細胞的培養與觀察會有較好的效 果，因此材料使用電漿表面處理讓表面親水性更好。經由親水性測 試，其表面接觸角為45°，如圖 4-31 所示。

因為實驗所使用的 PS 材料其親水性較 PMMA 的好，所以想藉

由改變PMMA 材料的親水性來觀察能否改善細胞貼附於試片上的效 果使細胞不會漂浮於培養基上，造成實驗觀察不便。

本實驗同樣使用電漿表面改質的方法，利用氧氣(O2)與氬氣(Ar) 兩種氣體來改變PMMA 材料表面的親水性。氬電漿(Ar Plasma)表面