放至具有奈米溝槽的母模板於下平台中央，設定壓力為400Kg，持壓 時間為90 秒，接著壓印。結果發現 PMMA 試片外觀並無明顯的改變，
而且試片表面出現了干涉條紋，只是此條件的干涉條紋並不是特別的 清楚易見，後來改變溫度為130℃，持壓 90 秒，壓力固定不變，結 果發現壓印後的試片表面干涉條紋有較前者明顯；為了探討溫度高低 對於PMMA 材料的影響，所以試著把下平台溫度調高。將溫度調高 至150℃，壓力不變仍然維持在 400Kg，持壓時間 90 秒，壓印出來 的結果比130℃的試片還好，且表面干涉條紋分佈均勻，如圖 4-1 所 示。後來經培養細胞後證實，此數據為本論文實驗PMMA 材料壓印 最佳參數。只是此最佳參數壓印結果仍有一缺點，就是壓印後材料表 面會有些微的凸起，依照判斷可能是因為熱壓程序結束的瞬間，壓力 與熱對材料表面產生了應變而造成此現象。為了改善此現象，改採用 分段壓印，設定兩段式壓力與壓印時間，以避免瞬間的熱應變造成表 面凸起。接著持續將下平板溫度升高至160℃，此時可觀察到 PMMA 試片表面開始有小氣泡的產生，如圖4-2 所示。其主要原因是因為材 料本身具有吸濕性，當表面溫度瞬間昇高時，內部殘留水分來不及蒸 發所造成。當溫度高於170℃時材料整體開始有嚴重的軟化變形現 象，初步探討可能是因為壓印溫度已經高於PMMA 材料的玻璃轉移 溫度(Tg)太多，因此造成 PMMA 材料整體開始產生軟化變形的現象。
本實驗的另一壓印基板材料為聚苯乙烯(PS)，因為本身為熱塑性 材料且具有高於100℃的玻璃轉移溫度，所以很適合作為熱壓印的試 片材料。實驗起初溫度也是設定為 100℃，壓力為 400Kg，持壓時間 90 秒，不過壓印出來的結果並不是太好，表面的干涉條紋分佈不平 均，如圖4-3 所示，接著將溫度提高為 130℃，其餘壓印參數不變，
得到了干涉條紋分佈均勻的試片，如圖4-4 所示。如果將溫度提高至 150℃以上時，PS 材料開始有軟化變形與小氣泡產生的現象。
當溫度過高時，PMMA 與 PS 材料均會有軟化變形的現象產生，
如圖4-5,4-6 所示。也由於高溫使材料軟化，使得試片與母模板之間 貼合的更為緊密，當脫模時，非常不容易自然脫模，容易使脫模後的 試片表面奈米溝槽斷裂，影響誘導細胞成方向性貼附排列的行為，如 圖4-7 所示。同時還會造成母模板表面有沾黏甚至破損的現象產生，
如圖4-8 所示，影響往後試片的壓印結果。
圖 4-1 PMMA 材料壓印後，表面出現干涉條紋
圖 4-2 PMMA 材料於高溫時，材料表面產生小氣泡
圖 4-3 PS 材料壓印溫度過低時，造成表面干涉條紋分佈不均
圖 4-4 壓印後 PS 材料表面干涉條紋均勻分佈
圖 4-5 PMMA 材料高溫下軟化變形
圖 4-6 PS 材料高溫下軟化變形且有小氣泡的產生
圖 4-7 脫模不良導致壓印試片表面微結構破損影響細胞生長
圖4-8 高溫壓印脫模，造成母模板表面沾黏與破損 4-1.2 壓力對於 PMMA 與 PS 材料表面的影響
壓力條件對於本論文熱壓印實驗而言也是一項很重要的實驗參 數，實驗壓力設定範圍為 400Kg~1100Kg，主要目的在於觀察壓力的 大小對於PMMA 與 PS 兩種高分子在壓印時材料表面的影響。在固 定材料壓印溫度的條件下，壓印PMMA 材料溫度為 150℃，PS 材料 溫度則為130℃，分別以不同的壓力數值壓印。經由熱壓印實驗結果 可觀察到，當壓力數值到達700Kg 時，PMMA 材料表面開始有破損 與凹陷的現象產生，如圖4-9,4-10 所示，當壓力數值越高時，材料表 面破損的現象也跟著越嚴重。但是PS 材料在 700Kg 壓印時，卻不會 有表面破損的現象產生，且壓印後的表面干涉條紋分佈均勻。直到壓
力高於1000Kg 時，PS 材料表面才會開始產生些微的破損現象，如圖 4-11 所示。為了更了解壓力對 PMMA 材料的影響，後續實驗試著採
用較厚的PMMA 材料，其厚度約為 0.35cm (原 PMMA 材料厚度約為 0.2cm)，壓印結果發現，當壓力數值為 500Kg 時，PMMA 材料表面 就開始有破損的現象產生，且壓力越高破損現象越為嚴重。由此結果 觀察我們可知，當材料的厚度越厚時，所能承受的壓力負載較低，又 因為材料有室溫潛變的特性，所以隨著負載加大、時間增長會導致應 力開裂，因此材料表面有破損的現象。為了改善此現象，我們只能選 擇較薄的基板，且用較低的壓力數值來壓印。
4-1.3 持壓時間對於 PMMA 與 PS 材料表面的影響
除了壓力會影響材料表面破損外，持壓時間的長短也會影響到材
料壓印後的結果。本論文熱壓實驗所設定的持壓時間範圍為
10sec~120sec，固定熱壓印材料的溫度與壓力參數，以不同的持壓時 間去觀察壓印後 PMMA 與 PS 兩種材料表面的結果。結果發現當溫度較 低時，需採用較長的持壓時間來壓印，表面的干涉條紋比較能均勻分 佈，如此才能得到較好的微溝槽試片，反之，如果溫度過低且持壓時 間過短時，則壓印出來的試片表面干涉條紋會呈現分布不均勻的現 象，不利於後續細胞培養使用，如圖4-12 所示。當溫度較高時，則 需採用較短的持壓時間，如果持壓時間過久，此時 PMMA 與 PS 材料都
會開始有軟化變形的現象，而且有些 PMMA 材料表面會有小氣孔的產 生，並不適合作為培養細胞的微溝槽試片，因此須採用短時間持壓才 能避免材料產生軟化變形，且試片表面比較不會有小氣泡的產生。
圖4-9 壓印壓力過大造成 PMMA 試片表面嚴重破損
圖 4-10 壓印壓力過大造成 PMMA 試片凹陷
圖 4-11 壓印壓力大於 1000Kg 時，造成 PS 試片表面破損
圖 4-12 溫度過低且持壓時間過短，造成表面干涉條紋分佈不均勻
4-2 等方向奈米溝槽對於小鼠成肌細胞(C2C12)貼附生長的影響 由於許多文獻討論過等方向微溝槽對於細胞的生長與貼附都有 一定的影響性，且發現不同的細胞對於不同的溝槽尺寸都有不同的影 響性，所以本論文實驗以培養小鼠的成肌細胞為主，培養於熱壓印後 表面具有奈米溝槽的試片上，並且進行討論像是溝槽尺寸、電漿表面 改質等等對於小鼠成肌細胞貼附與生長的影響。
4-2.1 U 型與 V 型奈米溝槽對於細胞貼附生長的影響
本論文實驗使用兩種表面具有奈米溝槽的母模板，一種是溝槽形
狀為V 型的奈米溝槽，另一個則為 U 型的奈米溝槽，其母模板在 A.F.M.(原子力顯微鏡)下探測出來的微溝槽圖形，如圖 4-13,4-14 所 示。V 型溝槽之間的寬度約為 400nm，深度約為 50nm，U 型溝槽之 間的寬度同樣約為400nm，深度則約為 200nm。母模板材料為鎳(Ni) 所製成，將母模板放置於基板材料上，然後使用熱壓印的方法壓製，
使基板材料表面含有奈米溝槽，然後將壓印後具有奈米溝槽的試片拿 來培養小鼠成肌細胞。
將小鼠成肌細胞培養於兩種不同溝槽的試片上，並且放置在有足
夠培養基的培養皿裡，然後將培養皿放置於環境條件為恆溫37℃和 5% CO2的培養箱裡，放置72 小時的時間培養，72 小時後以倒立式 顯微鏡來觀察小鼠成肌細胞於試片上生長的情形。
原本小鼠成肌細胞是呈現雜亂四散的方向，如圖 4-19,4-20 所 示，且細胞分化時像樹枝狀一樣，如圖4-21 所示。將細胞培養於熱 壓印的溝槽試片後，實驗觀察發現，U 型溝槽試片所培養的成肌細胞 有方向性的排列，V 型溝槽試片則是方向性排列不明顯。在倒立式顯 微鏡下觀察我們可得知，細胞放置於U 型溝槽試片上 3~5 小時後開 始有規律性的貼附排列，數小時後細胞開始增生，增生期間細胞開始 有同方向性的排列增生，直到最後成形階段，細胞都是照著試片表面 溝槽同方向性貼附生長，如圖4-22~4-25 所示。細胞於 V 型溝槽試片 上則是沒有規律性的貼附排列，與正常細胞貼附排列的情況相似，呈 現雜亂四散的樣子，其細胞規律排列生長的情況較U 型不理想，如 圖4-26 所示。由此觀察結果判斷可能是 U 型的溝槽較深，V 型的溝 槽較淺，因此U 型溝槽的深寬比較 V 型大，所以對於細胞有較好的 誘導效果，可以順著溝槽方向排列生長。另一個推論是因為轉印出來 的V 型溝槽試片其溝槽凸起處的寬度變得十分細窄，因此沒有足夠 的空間能讓細胞的觸角去碰觸與移動，導致未能獲得好的誘導效果使 細胞方向性排列。如圖4-27 所示。而 U 型溝槽試片轉印出來的溝槽 凸起處寬度並沒有很大的改變，因此細胞有好的空間能去碰觸與移 動，所以能誘導細胞呈同方向性的排列生長。
圖 4-13 AFM 探測下 V 型母模板溝槽圖形
圖 4-14 AFM 探測下 U 型母模板溝槽圖形
圖4-15 SEM 觀察下 V 型溝槽圖形 (30K)
圖4-16 SEM 觀察下 V 型溝槽圖形 (60K)
圖4-17 SEM 觀察下 U 型溝槽圖形 (30K)
圖4-18 SEM 觀察下 U 型溝槽圖形 (60K)
圖 4-19 正常小鼠成肌細胞排列方式
圖4-20 利用 SEM 拍攝正常小鼠成肌細胞排列方式
圖4-21 正常小鼠成肌細胞分化時，樣貌如樹枝狀
圖4-22 小鼠成肌細胞於 U 型溝槽上貼附排列的情況
圖4-23 利用 SEM 拍攝小鼠成肌細胞在 U 型溝槽上貼附排列的情況
圖4-24 小鼠成肌細胞於 U 型溝槽試片上分化時具有同方向性排列
圖4-25 利用 SEM 拍攝小鼠成肌細胞成形時仍能保持同方向排列
圖4-26 小鼠成肌細胞於 V 型溝槽上貼附排列的情況
圖 4-27 熱壓轉印後 V 型溝槽基板示意圖
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