第三章 材料與方法
第二節 實驗設計
一、 實驗動物：
由樂斯特實驗動物繁殖中心購得正常 Wistar 大白鼠，於中國 醫藥大學動物中心飼養，室溫控制在 22±2 ℃、相對濕度為 65±5
﹪，並且於半日照環境下，任其自由飲水和餵食標準飼料。適應 一週後，進行實驗探討。
二、 大鼠足三里定穴與雙側足三里電針之實驗模型：
1. 採用先前文獻發表的取穴方法 17，先將大鼠仰臥於解剖板
上，四肢予與活固定，足三里則位於小腿脛前肌 (anterior
tibia muscle)與脛骨間近膝側上 1/6 的位置，依人類同身寸
法相對比例位置取穴之，穴位圖如圖3.2 足部三陽經穴取穴
圖 64。
2. 針具採用 0.5 寸 30 號針 (宇光公司)，垂直刺入肌肉層約
2-5 mm。
3. 電 針 機 為 韓 氏 電 針 儀 （Han’s Healthronic Likon, Taipei,
側，負極接於左側；非穴區則將正極接在右側小腿外側腓
腸肌的上端，負極接於其下端，刺激參數為頻率 15 Hz、電
流10 mA、電針時間 60 min。
圖 3.2 以 Wistar 鼠探討電針雙側足三里改善葡萄糖耐量機轉的動 物穴位圖（Romita VV et al., Brain Res 1997）。
三、 靜脈注射葡萄糖耐受試驗（ivGTT)的血糖檢測試驗：
1. 先將正常雄性 Wistar 鼠絕食 12 小時以上，用 Pentobarbital (40
mg/Kg，i.p，旭富製藥）麻醉後抽血，以 0.5 ml 針筒內含 heparin，
由股靜脈採血0.3 - 0.5 ml 當起始樣本 0 min。
2. 打入葡萄糖（1 mg/Kg，i.v）到大鼠的股靜脈作靜脈注射葡萄糖
耐受試驗。每15 min、 30 min、 60 min、 90 min 各以 0.5 ml
針筒內含heparin，由股靜脈採血，0.3 - 0.5 ml。分別為樣本 15
min、 樣本 30 min、樣本 60 min、樣本 90 min 。
3. 兩組各樣本皆置試管（eppendorff tube）中，輕搖冰上保存。
4. 全部樣本離心 13000 rpm，5 min。
5. 取上清液血清，存放於 -20 ℃中，待測。
四、 實驗步驟：
實驗一：電針對葡萄糖耐量之影響。
1. 將正常雄性 Wistar 鼠絕食 12 小時以上，用 Pentobarbital (40 mg/Kg，i.p）麻醉後隨機分成兩組一組電針組、一組不電針組 同時做靜脈注射葡萄糖耐受試驗（ivGTT）。
2. 電針組，在打入葡萄糖（1 mg/Kg，i.v）後並同時針刺雙側足 三里，加電針機持續刺激。刺激頻率15 Hz 、強度 10 mA ， 刺激時間為60 min。不電針組不做針刺與加電針機。
3. 利用兩組血糖變化量評估電針改善大鼠葡萄糖耐量。
實驗二：不同阻斷劑 Atropine、L-NAME 與 HC-3 對電針改善葡萄糖耐 量之影響。
甲、 個別阻斷劑在電針對葡萄糖耐量效應之影響：
1. 將正常雄性Wistar 鼠絕食 12 小時以上，用 Pentobarbital (40 mg/Kg，i.p）麻醉後，分別加打 Atropine （0.1 mg/kg，
i.p）、L-NAME （10 mg/kg，i.p）或 HC-3（0.1 mg/kg，
i.p ）。
2. 隨機分成兩組一組電針組、一組不電針組同時做ivGTT。
3. 電針組，在打入葡萄糖（1 mg/Kg，i.v）後並同時針刺雙
側足三里，加電針機持續刺激。刺激頻率 15 Hz 、強度 10 mA ，刺激時間為 60 min。不電針組不做針刺與加電 針機。
4. 利用兩組血糖變化量評估個別阻斷劑在電針對葡萄糖耐 量效應之影響。
乙、 合併兩種不同阻斷劑在電針對葡萄糖耐量效應之影響：
1. 將正常雄性Wistar 鼠絕食 12 小時以上，用 Pentobarbital (40 mg/Kg，i.p）麻醉後，同時打 Atropine（0.1 mg/kg，
i.p）與 L-NAME（10 mg/kg，i.p）或 L-NAME（10 mg/kg，
i.p）與 HC-3（0.1 mg/kg，i.p）。
2. 隨機分成兩組一組電針組、一組不電針組同時做ivGTT。
3. 電針組，在打入葡萄糖（1 mg/Kg，i.v）後並同時針刺雙 側足三里，加電針機持續刺激。刺激頻率 15 Hz 、強度 10 mA ，刺激時間為 60 min。不電針組不做針刺與加電 針機。
4. 利用兩組血糖變化量評估合併不同阻斷劑在電針對葡萄 糖耐量效應之影響。
實驗三：利用測定FFA 評估電針對胰島素敏感度之影響。
甲、 電針在ivGTT 下對 FFA 值之影響：
1. 將正常雄性Wistar 鼠絕食 12 小時以上，用 Pentobarbital (40 mg/Kg，i.p）麻醉後隨機分成兩組一組電針組、一組
不電針組同時做ivGTT。
2. 電針組，在打入葡萄糖（1 mg/Kg，i.v）後並同時針刺雙 側足三里，加電針機持續刺激。刺激頻率 15 Hz 、強度 10 mA ，刺激時間為 60 min。不電針組不做針刺與加電 針機。
3. 利用檢測兩組血清中 FFA 變化量評估電針對胰島素敏感 度之影響。
乙、 阻斷劑對於電針在 ivGTT 下對 FFA 值效應之影響：
1. 將正常雄性Wistar 鼠絕食 12 小時以上，用 Pentobarbital (40 mg/Kg，i.p）麻醉後，同時打 Atropine（0.1 mg/kg，
i.p）與 L-NAME（10 mg/kg，i.p）。
2. 隨機分成兩組一組電針組、一組不電針組同時做ivGTT。
3. 電針組，在打入葡萄糖（1 mg/Kg，i.v）後並同時針刺雙 側足三里，加電針機持續刺激。刺激頻率 15 Hz 、強度
10 mA ，刺激時間為 60 min。不電針組不做針刺與加電 針機。
4. 檢測兩組血清中 FFA 值的變化，評估阻斷劑對於電針在
ivGTT 下對 FFA 值效應之影響。
實驗四：電針對胰島素訊號蛋白與nNOS 影響試驗。
1. 將正常雄性 Wistar 鼠絕食 12 小時以上，用 Pentobarbital (40
mg/Kg，i.p）麻醉後隨機分成兩組一組電針組、一組不電針組
同時做靜脈注射葡萄糖耐受試驗（ivGTT）。
2. 電針組，在打入葡萄糖（1 mg/Kg，i.v）後並同時針刺雙側足
三里，加電針機持續刺激。刺激頻率15 Hz 、強度 10 mA ，
刺激時間為60 min。不電針組不做針刺與加電針機。
3. 實驗 60 min 後電針組、不電針組各組取大鼠大腿腓腸肌束。
4. 離體大腿腓腸肌，骨骼肌，以均質機研磨後離心，取上清液
（supernatant），利用西方轉漬法測量 PI3-k、IRS-1、Akt1、
GLUT4、nNOS 與 Actin 的含量。
5. 比較兩組PI3-k、IRS-1、Akt1、GLUT4、nNOS 與 Actin 的相對
含量的差異，評估電針對胰島素訊號蛋白與nNOS 之影響。
五、 血糖測定 (Assay of Plasma Glucose)：
利用 Glucose UA 試劑（Glucose UA Reagent，Raichem）檢
測血清中生化指標葡萄糖（GLU）之含量，其含量採用 Roche
全自動生化儀（COBA-MIRA-PLUS，ROCHE）來進行檢測各組
樣本血清中血糖值。
六、 游離脂肪酸的測定 (Assay of Free Fatty Acid，FFA)：
1. 以 Non Esterified Fatty acid kit (購自 Randox Laboratories Canada
Ltd.) 檢測各組樣本血清中 FFA 值。
2.
自動生化儀檢測（COBASR system）:利用酵素會將實驗各組各時間點樣本血清中的FFA 轉變成 Acyl- CoA，再氧化成有色的
purple adduct，以分光光度儀（spectrophotometer, Quik-Lab,
Ames, Miles Inc., Elkhart, Ind., USA），波長 550 nm 進行比色，
再與已知濃度標準品比較求得實驗樣本中的FFA 濃度。
七、 胰島素訊號蛋白與 nNOS
之抗體
（Antibody of Insulin signalprotin and nNOS）：
IRS-1 抗體（1:200 稀釋，rabbit polyclonal antibody ）、GLUT4
抗體（1:200 稀釋，goat polyclonal antibody）、PI3-K 抗體（1:200
稀釋，goat polyclonal antibody）、Akt1 抗體（1:200 稀釋，goat
polyclonal antibody）、β-Actin 抗體（1:500 稀釋，goat polyclonal
antibody），由 Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz , Calif.購
得。nNOS 抗體（1：1000 稀釋，Mouse monoclonal antibody）
自（ZYMED Laboratories ）購得。
八、
西方轉漬法分析（Western Blotting Assay）
：1. 大鼠離體腓腸肌組織於 RIPA Lysis Buffer 裡，以均質機研磨
後，萃取出蛋白質，再以分光光度計偵測蛋白質含量。
2. 取約90 μg /μl 蛋白質在 8 % SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）
-polyacrylamide 凝膠進行蛋白質分離，以轉漬緩衝液 （20%
methanol, 25 mmol/l TRIS base and 192 mmol/l glycine）轉漬（電
流伏特90 V, 90 min）到硝化纖維膜（poly vinylidene difluoride、
PVDF）transfer membrane）上。
3. 待轉漬完成後，再將 PVDF 浸潤於含 5%的脫脂牛奶中，於室
溫下將PVDF 膜上的非特異性結合位阻斷。
4. 接著，將（poly vinylidene difluoride、 PVDF）浸潤於含 1%的
脫 脂 牛 奶 及 適 量 的 anti-IRS-1 antibody 、 anti-PI3-kinase
antibody、anti-Akt1 antibody anti-GLUT 4 antibody 與 anti-nNOS
antibody、anti-Actin antibody 等抗體中，於 4℃冰箱內緩慢振盪
隔夜。
5. 以PBST buffer 清洗 PVDF 四次，每次 10 分鐘。再將 PVDF 浸
潤於含1%的脫脂牛奶及適量的 anti-goat IgG antibody 中，於室
溫下緩慢振盪1hr。重覆以 PBST buffer 洗 PVDF 4 次，每次 10
分鐘。
6. 最 後 ， 將 PVDF 膜 上 水 漬 滴 乾 ， 加 入 ECL detection kit
（Chemiluminescence Reagent Plus），再以 X-RAY 予以壓片。