3-1 試藥
3-1-1 合成BMIM-Cl與BMIM-PF6
1-chlorobutane 99 %,C4H9Cl,GR grade(Janssen Chimica, Geel, Belgium) 1-methylimidazole 99 %,C4H6N2,GR grade(Acros, Geel, Belgium)
Ethyl Acetate,CH3COOC2H5,HPLC/spectro grade(Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA)
Potassium hexafluorophosphate 99 %,KPF6,GR grade(showa, Tokyo, Japan)
Magnesium sulfate anhydrous 99 %,MgSO4,GR grade(showa, Tokyo, Japan)
3-1-2 配製緩衝溶液的試劑
Hydrochloric Acid, HCl, GR grade(Showa, Tokyo, Japan)
Sodium hydroxide, 96 %,NaOH, GR grade(Showa, Tokyo, Japan) Glycine, C2H5NO2, GR grade(Riedel-de Haen, Seelze, Germany) Citric acid,100 %, HOC(COOH)(CH2COOH) 2 (Anhydrous, powder),ACS grade(Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA)
Sodium citrate,99.6 %, HOC(COONa)(CH2COONa) 2、2H2O, ACS grade(Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA)
Acetic Acid,CH3COOH, HPLC/spectro grade(Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA)
Sodium acetate,98.5 %, CH3COONa, GR grade(Showa, Tokyo, Japan) Sodium dihydrogenphosphate anhydrous, 98.0 %,NaH2PO4, GR
grade(Showa, Tokyo, Japan)
Tris(hydroxymethyl)aminomethane,(HOCH2)3CNH2, ACS grade (TEDIA, Fairfield, OH, USA)
Sodium hydrogen carbonate, 99.5 %,NaHCO3,GR grade(Showa, Tokyo, Japan)
Sodium chloride, NaCl, GR grade(Showa, Tokyo, Japan)
Potassium chloride, KCl, GR grade(Riedel-deHaen, Seelze, Germany)
3-1-3 蛋白質分子
Lysozyme from hen egg white, M.W.14400 pI=10.7 (Sigma, St. Louis, MO, USA)
Albumin from egg white, M.W.44300 pI=4.3 (Sigma, St. Louis, MO, USA)
Hemoglobin from bovine serum, M.W.64500 pI=6.8 (Sigma, St. Louis, MO, USA)
Cytochrome c from horse heart, M.W.12361,pI=10.5 (Sigma, St. Louis, MO, USA)
Procion Blue MX-R, C23H14Cl2N6O8S2,(Fluka, Buchs SG, Switzerland)
實驗中使用的水為Milipore Milli-Q(Bedford, MA, USA) 所製造之去 離子水
3-2 儀器
(1)紫外光-可見光光譜儀 UV-Visible Spectrophotometer, Hewlett Packard 8453(Waldronn, Germany)
(2)高效能液相層析管柱:Reverse-Phase HPLC Column,Vercopak Inertsil 7 octadecyl silica-3(ODS-3)
(3)梯度幫浦:梯度控制器 LabGrad 是由 Lab Alliance 公司製造，結合 series Ⅲ pump,最多可做四種動相組成的混合梯度
3-3 實驗流程
3-3-1 合成IL BMIM-PF659
1. 取 0.3 莫耳 1-chorobutane(31.3 ml)和 0.3 莫耳 1-methylimidazole (23.9 ml)，放入設有迴流裝置的 250 ml 圓底瓶混合攪拌，並加溫 至80℃，持續 48~72 hr，直至生成金黃色黏稠狀液體，
1-butyl-3methylimidazolium chloride, BMIM-Cl。
2. 倒入 250 ml 分液漏斗，加入 50 ml 乙酸乙酯搖晃洗濯後，靜置分 層，取出下層液體置於小圓底瓶。
3. 將所得金黃色黏稠狀液體加熱至 100℃攪拌隔夜，去除乙酸乙酯。
4. 取 0.3 莫耳KPF6 加入150 ml去離子水中，攪拌至完全溶解。
5. 將所得金黃色黏稠狀液體加入裝有KPF6溶液的燒杯中，以磁石攪 拌3 小時。
6. 攪拌後，將上述水層倒出，並加入去離子水攪拌再將水層倒出，
再加入新的去離子水攪拌並倒出，重覆此步驟直至水層呈中性。
7. 將上層水溶液倒出後，加入硫酸鎂除水，再用濾紙過濾 8. 所得即為 1-butyl-3-methyl imidazolium hexafluorophosphate,
BMIM-PF6 。
9. 合成示意圖如圖 7。
N N
N N
PF
6-N N
Cl
-C 4 H 9 Cl
KPF 6 /H 2 O
phase separation
圖 7、Bmim-PF6的合成示意圖
3-3-2 配製萃取相
1. 以 0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml，3 mg/ml的比例，將Procion Blue MX-R粉末加入BMIM-PF6中，在室溫下攪拌24 小時使其溶解，
再加入等體積的去離子水攪拌30 分鐘，將懸浮在BMIM-PF6中未 溶解的染料粉末清洗至水層；靜置30 分鐘待澄清分層，移去水
相，加入新的去離子水清洗，重覆步驟兩次，如圖8。實際溶於
BMIM-PF6中的染料濃度，由UV-Vis spectrometer定量。
2. 定量方法；分別在 0.2、0.5、1、2 mg/ml(dye/IL)未水洗過的萃 取相中，加入相同比例的甲醇稀釋 20 倍（1 ml 萃取相 + 19 ml 甲 醇），接著測量 UV-visible 吸收值。取 587 nm 的吸收值對 dye 的 濃度作校正曲線，清洗過的萃取相中，Procion Blue MX-R 的真 實濃度即可推算得知。
washed，Procion Blue MX-R/BMIM-PF6)置入20 ml樣品瓶中，分別以 磁石攪拌5、10、20、30、45、60 分鐘，探討攪拌時間對蛋白質正向 萃取的影響。
3-3-4 萃取溶菌酶 1. 正向萃取：
用50 mM Tris-HCl (pH=7.0)緩衝溶液配製 200、500、1000 mg/L 的溶菌酶水溶液，取5 ml 溶菌酶水溶液與 5 ml 3-3-2 的萃取相置於 20 ml 樣品瓶中，在室溫下攪拌 30 分鐘後，靜置分層，取出上層水相 以HPLC 定量。
2. 反向萃取：
取出下層離子液體相3 ml 置於另一 20 ml 樣品瓶中，加入 3 ml 的1 M NaCl/50 mM Tris-HCl(pH=7.0)緩衝溶液，同樣置於室溫下攪 拌30 分鐘，靜置分層，取出上層水相以 HPLC 定量。
3-3-5 pH 值對蛋白質萃取的效應 1. 配製緩衝溶液：
0.2 M KCl/0.2 M HCl 調配 pH 範圍 1.0~2.1 0.1 M Glycine/0.2 M HCl 調配 pH 範圍 2.2~3.5
0.1 M CH3COOH/0.1 M CH3COONa調配pH範圍 3.6~5.0 0.1 M Citric acid/0.1 M Sodium citrate 調配 pH 範圍 5.1~6.0 0.1 M Tris(hydroxymethyl)-aminomethane/0.1 M HCl 調配 pH 範圍 7.0~9.0
0.05 M NaHCO3/0.1 M NaOH 調配pH範圍 10.0~11.0 0.2 M NaOH/0.2 M KCl 調配 pH 範圍 12.0~13.0 2. 配製 pH 範圍 2.0~12.0 的 200 mg/L 溶菌酶水溶液 3. 正向萃取：
將pH範圍 2.0~12.0 的 200 mg/L溶菌酶水溶液分別取 5 ml與 5 ml 3-3-2 配製的萃取相(2 mg/ml，Proncion Blue MX-R/BMIM-PF6) 置入20 ml樣品瓶中，以磁石攪拌 30 分鐘，混合完靜置分層，
取出上層水相以HPLC定量。
4. 反向萃取：
取pH 7.0 的 200 mg/L 溶菌酶水溶液 3 ml與 3 ml 3-3-2 配製的萃取 相(2 mg/ml，washed，Procion Blue MX-R/BMIM-PF6)置入20 ml 樣品瓶中，以磁石攪拌30 分鐘，靜置分層後，取出下層離子液 體相置於另一20 ml樣品瓶中，加入等體積pH範圍 2.0~12.0 的緩
相以HPLC定量。
3-3-6 離子液體重覆使用的效率
取10 ml pH 7.0 的 200 mg/L 溶菌酶水溶液與 10 ml萃取相(2 mg/ml，washed，Procion Blue MX-R/BMIM-PF6)置入20 ml樣品瓶中，
以3-3-3 相同的實驗條件進行第一次正向及反向萃取後，移除水相，
加入新的10 ml反向萃取緩衝溶液，進行第二次反向萃取，移除水相，
加入10 ml去離子水清洗萃取相。取出下層離子液體萃取相，置於另 一20 ml樣品瓶中，加入新的等體積 200 ppm 溶菌酶水溶液，接著進 行正向及反向萃取；重覆以上步驟四次，觀察離子液體重覆使用的可 行性。
3-3-7 比較不同蛋白質的萃取率
用50 mM tris (pH=7.0)緩衝溶液分別配製 200 mg/L的albumin、
hemoglobin、cytochrome c水溶液,分別取 5 ml的蛋白質水溶液與 5 ml 萃取相(2 mg/ml，washed，Procion Blue MX-R/BMIM-PF6) 置於 20 ml 樣品瓶中，以與3-3-3 相同的實驗條件進行正向及反向萃取。
3-3-8 萃取蛋白質混合物
1. 以 50 mM Tris-HCl (pH=7.0)緩衝溶液分別配製 lysozyme +
albumin、lysozyme + hemoglobin、lysozyme + cytochrome c 200 mg/L 混合蛋白質水溶液。
2. 正向萃取：
取5 ml 混合蛋白質水溶液與 5 ml 萃取相置於 20 ml 樣品瓶中，
在室溫下攪拌30 分鐘後，靜置分層，取出上層水相以 HPLC 定 量。
3. 反向萃取：
取出3 ml 下層離子液體相置於另一 20 ml 樣品瓶中，加入 3 ml 的1 M NaCl/50 mM Tris-HCl(pH=7.0)緩衝溶液，同樣置於室溫 下攪拌30 分鐘，靜置分層，取出上層水相以 HPLC 定量。
4. 比較 Procion Blue MX-R 在其他蛋白質存在下，對溶菌酶的選擇 性是否受影響。
第四章 結果與討論