背景與理論介紹 - 應用親和性染料於離子液體中進行蛋白質液相╱液相萃取

2-1 離子液體

2-1-1 離子液體的介紹

廣義地說，離子液體(ILs)是一種熔點低於 100℃的低溫熔融鹽類，亦可說是液體狀的離子鹽類，或是液體狀的電解質。室溫型離子液體(Room-Temperature Ionic Liquids, RTILs)則是指在室溫下即可呈現液態的有機熔融鹽類；由於其特殊的物性、化性、以及組成的多變性，使得離子液體在有機合成、綠色化學、以及分析化學等方面，都成為熱門的研究主題。

常見的室溫離子液體，大多是由具有氮或磷原子和不對稱取代烷基的陽離子(e.g., N,N-dialkylimidazolium、N-alkylpyridinium、

Alkylammonium、Alkylphosphonium，結構如下圖 1)¹，

N N

PF6^﹣、AlCl4^﹣、Al2Cl7^﹣)所構成的。改變陽離子與陰離子的組成，可得到具有不同性質的離子液體；或是單純改變陽離子上的烷基類型，

也可影響有機物在離子液體中的溶解度。例如1-octene對於不同的 tri-n-alkylmethylammonium tosylate melts（），其溶解度隨著n變大而增加²；而在利用冠狀醚（crown ether）萃取鹼金屬到

1-alkyl-3-methyl-imidazolium hexafluorophosphate（CnMIM-PF6）時，

其萃取效果隨著烷基碳鏈長度增加而愈好³。不同的取代烷基可由 alkylation reagent 經反應而得，不同形式的陰離子則可藉由簡單的離子交換步驟得到，如下圖2：⁴

表一、數種RTILs 的結構、性質以及其用途。

2-1-2 離子液體的特性

離子液體是熔融態的有機鹽類，熔點低、在室溫下的揮發性很低、不易燃、有高導電度、具有範圍很廣的黏性與工作範圍（亦即熔點、沸點差異大）、並可與不同類型的化合物進行媒合作用(solvation interaction)。

離子液體具有許多性質而適合做為研究電化學的溶劑，例如與水溶液相較時，有較寬廣的電位窗（potential window）及導電度。在選擇一溶劑來當電化學的探討時，最先考慮的是此溶劑的電位窗是否合適，而電位窗主要決定於溶劑本身是否容易被還原或氧化，就離子液體來說，其電化窗的負電位受限於組成中陽離子的還原電位，而正電位則受限於陰離子的氧化電位，目前文獻報導中具有最寬廣電位窗的離子液體⁶為［C3H7(CH3)3N］［(CF3SO2)2］，用玻璃碳電極掃描時，其電位窗可達5.7 V。

離子液體的密度與陽離子團的大小較有關，一般而言，陽離子團愈大，密度相對減小；至於離子液體的黏度主要取決於要取決於離子液體分子間形成氫鍵的趨勢，及凡得瓦耳力的強弱而定；離子液體的熔點則與陽離子的對稱性、陰離子團大小有關⁴^、⁵。

雖然離子液體的結構與其性質之間的關聯性，尚未被完全了解，

但是化學家利用empirical solvent polarity scales此種方式研究，初步顯

示大部分的離子液體擁有與與短碳鏈醇類相似的極性⁷^、⁸。然而，不同陰、陽離子所構成的離子液體，其疏水性與親水性並不盡相同。舉 BMIM-PF6與BMIM-Cl為例，此兩化合物以相同陽離子與不同陰離子化合，BMIM- PF6與水不互溶，具有相當的疏水性，而BMIM-Cl卻可與水以任何比例互溶，具有相當的親水性。研究結果顯示，離子液體的陰離子主要決定與水的互溶性，但陽離子則會影響疏水性的程度⁸^、

9。

由於單純使用極性來解釋離子液體的特性，並無法說明為何不同組合的陰陽離子所構成的離子液體，會表現出不同的行為⁷^、¹⁰^、¹⁹^、⁵⁹，於是便有學者試著用Abraham solvation-parameter model來解釋¹⁰^、¹¹，在這個model裡，每一種媒合作用力參數都被考慮進去了，其方程式如下:

ln k = c + rR2 + sπ2H + aα2H + bβ2H +l logL

r、s 、 a 、 b 、 l分別代表離子液體與溶質的π電子和未鍵結電子的作用

力、離子液體的偶極矩（dipolarity）或極化程度（polarizability）、

氫鍵鹼度（hydrogen-bond basicity,接受氫鍵的能力）、氫鍵酸度

（hydrogen-bond acidity, 提供氫鍵的能力）、分散力（ dispersion forces）。藉由個別的作用力參數，可以較為成功地描述離子液體的

特性，有助於了解離子液體的結構與其性質之間的關聯性¹⁰，進而依研究者的期望，選擇或合成出特定性質的離子液體來作應用；所以離子液體也被稱為“設計者溶劑（designer solvents）＂¹²。

2-1-3 離子液體的應用

離子液體近年來引起熱烈的研究與討論，主因除了其多樣的性質與廣泛的應用範圍外，環保意識的覺醒，使得學者們開始致力於“綠色化學＂的發展，也是因素之一。所謂綠色化學，就是設計較安全的化學品或化學反應過程來取代危險物質的使用，或是盡可能減少與消除這些危險物質對環境的衝擊。

傳統有機溶劑(volatile organic compounds，VOCs)的高揮發性與可燃性極易造成環境污染與危險，在使用上必須加上許多安全性考量。離子液體的特性包括極低的蒸氣壓力，具熱穩定性且不可燃，以及對大部分有機或無機金屬化合物都有極佳的溶解度，傳統有機溶劑則常使化學家受限於溶解度的問題，對此，離子液體提供了一種完全不同的選擇。又由於熱穩定性佳，把產物蒸餾出來後，離子液體還可以重複使用，達到溶劑減量的目的，有效減少化學廢棄物的產生。目前離子液體在電化學、分離技術、合成化學、材料化學等方面，都有大量的應用。

早在1914 年就有人合成出在低溫時是液態的離子化合物，

ethylammonium nitrate。1948 年，Hurley和Wier發展出第一種

chloroaluminate ion形式的離子液體，並拿來當作電鍍鋁的浸漬液¹³，但是卻沒有更進一步的相關研究。直到1980 年代，Osteryoung利用 aluminum chloride 和 1-alkylpyridinium chlorides的混合物¹⁴^、¹⁵，和 Wilkes成功製備出chloroaluminate melts後¹⁶，離子液體就被大量的應用在電化學。Seddon和Hussey則開始使用chloroaluminate melts¹⁷^、¹⁸，利用其非水溶液、極性溶劑性質做過渡金屬錯合物方面的研究。

有機合成方面，離子液體具有提高有機反應選擇性和產率的特性，以及可與催化劑形成共催化劑，增加催化的活性、選擇性與穩定性等特點，例如將離子液體作為兩相催化系統（biphasic catalysis system）中的有機層，在離子液體中進行Diels-Alder反應，可選擇性地反應生成endo產物，再把催化劑從離子液體中回收，可繼續進行催化¹。有些酵素在離子液體中能保有相當好的催化活性²¹^、²²，且能在高溫時展現優良的熱穩定性²³，開拓了應用離子液體當作生化催化反應介質的新領域²⁰^、²⁴^、²⁵。

離子液體具有熱穩定性、高黏度、容易填充在管柱中等作為GC 靜相所需的條件¹⁰^、²⁶，並具有可分離極性與非極性物質的雙重性質

（dual-nature）²⁶^、²⁷；選擇適當的離子液體作靜相，甚至可有效分離

chiral alcohols、chiral sulfoxides、acetylated amines、chiral epoxides等鏡像異構物²⁸^、²⁹。

應用於質譜方面，離子液體的低蒸氣壓、可吸收雷射光而不分解、對分析物的溶解度高於一般固態基質等優點，使其可用來作為 MALDI的基質。雖然使用傳統的imidazolium-based ILs為基質無法偵測到蛋白質訊號，利用傳統MALDI基質CHCA （α

-cyano-4-hydroxycinnamic acid)）形成的離子液體，可有效提高訊號強度、降低偵測極限³⁰；對低分子量的DNA oligomers、oligonucleotides、

peptides、small proteins，還可進一步作定量偵測³¹^、³²。

在萃取應用方面，利用crown ether可將金屬離子萃取到離子液體

中^33-35；合出具有O、S、N的離子液體當金屬螯合劑，萃取水層中的

Hg²⁺、Cd^{2+ 36}；用離子液體當介質，將金奈米及金奈米棒由水相轉移

至離子液體相³⁷；含有方盃化合物（calixarenes）的RTIL可萃取Ce⁺和 Ag^{+ 34}^、³⁵；近來，則有研究者成功應用離子液體萃取胺基酸⁶¹、雙股 DNA³⁸與蛋白質細胞色素c³⁹^、⁴⁰。

2-2 蛋白質萃取方法

近年來由於生物科技的進步，藉由DAN 重組技術及蛋白質工程，人類可以生產製造一些重要的生物分子，然而如何從細胞培養基中分離、純化及濃縮這些生物分子就成為一個重要的課題。傳統上分離生物分子的方法，是先將細胞培養基中的細胞先打碎，利用離心粗略分離雜質，然後利用層析法（chromatography）或傳統凝膠電泳

（SDS-PAGE）進行樣品的分離，可是這種方法只能分離少量的樣品，並無法分離大量的樣品。此後才漸漸發展出雙水相溶劑系統、反微胞萃取及親和管柱層析法等，能提供大量分離純化生物分子的技術。

2-2-1 雙水相溶劑系統（aqueous two phase solvent system）

雙水相溶劑系統是Albertson⁴¹於 1958 年所提出的，雙水相溶劑系統之形成為：在水溶液中加入兩種物化性質相異之高分子聚合物 (如：polyethylene glycol、Dextran)或鹽類(如：磷酸鹽、檸檬酸鹽)，

這些不同性質之大分子分別與水分子產生交互作用力而形成兩相。利用目標物與兩水相分子間不同作用力產生分配(partition)行為而達純化分離的效果。一般來說，分子在兩相的分配受許多因素影響^42-44，主要受所使用的高分子聚合物種類、緩衝溶液濃度、pH值及溫度所

決定。

以雙水相溶劑系統這種技術，可萃取分離天然物中之活性成分，

用以製備藥效確實，高度有效活性成分的天然活性組合物；此系統也已被大量應用在蛋白質和細胞的萃取分離及純化上⁴²。

2-2-2 反微胞萃取法⁴⁵^、⁴⁶

所謂反微胞萃取法，是利用界面活性劑溶於有機溶劑後形成親水端朝內的反微胞，藉由反微胞將溶於水溶液中極性大的分子萃取至有機溶劑中，然後再反萃取至另一水溶液中，以達到分離純化的目的；

反微胞萃取法除了具有分離大量樣品的能力外，分離後能保有生物分子的活性，是其最受矚目之處，因此已有文獻發表利用反微胞萃取法來分離胺基酸⁴⁷^、⁴⁸或蛋白質⁴⁵^、⁴⁶。

萃取物在水相及反微胞的分佈，會受到水溶液的狀態所影響，如 pH 值、離子種類、或離子強度（ionic strength）。此外，萃取物的性質，或是萃取時的溫度，亦會影響反微胞萃取的效率。

（1）pH 值

水溶液的pH值會影響蛋白質表面的電荷分佈（charge distribution over the protein surface），而蛋白質表面電荷與界面活性劑親水基之間的庫侖靜電力決定了反微胞萃取法的效率。使用陰離子型界面活性劑

萃取蛋白質，水溶液的pH值需要小於蛋白質的等電點（isoelectric point, pI）⁴⁹；反之，使用陽離子型界面活性劑，水溶液pH值則需要大於蛋白質等電點⁵⁰。當蛋白質處於過酸或過鹼的水溶液中，會使蛋白質變

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