結果與討論 - 應用親和性染料於離子液體中進行蛋白質液相╱液相萃取

從文獻中得知，已有關於利用離子液體BMIM-PF6直接萃取雙股 DNA³⁸，或是在離子液體中加入冠狀醚作為萃取劑，與生物分子（胺基酸⁶¹、蛋白質³⁹^、⁴⁰等）螯合後，將其由水相轉移至離子液體相中，

這些液相/液相萃取方面的研究。本實驗一開始嘗試利用未加入任何萃取劑的離子液體BMIM-PF6來萃取溶菌酶，發現並無法達到萃取的效果。

由於染料在親和性管柱層析法中，常應用來作為與蛋白質結合的配體（ligand）⁵⁴，而且親和性染料的種類繁多，提供了多樣性的選擇。

於是本研究便試著尋找出可溶解並穩定存在於離子液體中的染料，作為蛋白質的萃取劑。實驗發現，藍色染料Procion Blue MX-R可成功的溶解於離子液體Bmim-PF6中，並可用來萃取溶菌酶。

將純離子液體BMIM-PF6、1 mg/ml的萃取相與 0.5 mg/ml的染料水溶液分別以甲醇稀釋20 倍，量測其UV-Vis吸收光譜。如圖 9 所示，

350 nm以下的吸收是由離子液體BMIM-PF6所貢獻。比較Procion Blue MX-R溶於水相與離子液體相中的UV-Vis吸收光譜圖，發現其最大吸收波長與吸收光譜圖形皆無變化（λmax＝375 nm、587 nm、625 nm），

可知Procin Blue MX-R經過長時間的攪拌與加水清洗的步驟後，並不會產生分解斷鍵的現象，而可穩定存在於離子液體相中。

定量實際溶於離子液體相中染料濃度的方法，是將不同已知濃度

的dye/IL 以甲醇稀釋後，量測其 UV-vis 吸收光譜圖，取其在 587 nm 的最大吸收值對濃度作校正曲線，如圖10 所示。將使用去離子水清洗完成的萃取相加入相同比例的甲醇稀釋 20 倍（1 ml dye/IL + 19 ml 甲醇），量測其在587 nm 的吸收值。即可由校正曲線方程式反推求得 Procion Blue MX-R 溶在離子液體中的含量。

300 400 500 600 700 UV-visible 吸收光譜圖

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

4-2 比較萃取時間對萃取率的影響

如圖11 所示，在室溫下以磁石攪拌 20 分鐘即可達到萃取率極大值，顯示在本研究30 分鐘的攪拌時間條件下，足以使萃取充分達到平衡。

0 10 20 30 40 50 60

0 10 20 30 40 50 60 70 80

ef fe cie n cy (%)

time(min)

圖 11、攪拌時間對萃取率的影響

4-3 萃取溶菌酶

如圖12、表二所示，當離子液體相中 Procion Blue MX-R 的含量增加，正向萃取率隨之提高，最高可達到65 %。隨著蛋白質濃度增加，正向萃取率下降，由此可知每單位的Procion Blue MX-R 對蛋白質進行親和力結合的能力有限。

圖13、表三為反向萃取的結果，如圖所示，最高可達到 40 %的總回率。

另外，可以發現以 2 mg/ml與 3 mg/ml兩種濃度配製的萃取相，

經過去離子水清洗的步驟後，兩者實際存在於離子液體相中的量並無明顯差異（見圖14、表四）；換句話說，Procion Blue MX-R在離子液體BMIM-PF6中的溶解度有限，即使加入大量，當濃度達到飽和後，

大部分未溶解的染料粉末都會被清洗掉，所以接下來的的實驗皆以2 mg/ml的萃取相來進行。

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

表二、不同染料濃度含量的萃取相對不同濃度的溶菌酶水溶液進行正向萃取的結果

efficiency(%)

conc. of dye(mM) 0.57 1.09 2.54 2.67 conc. of

lysozyme(mg/L)

200 21.1 46.2 59.8 66.9

500 20.0 18.5 34.5 46.4

1000 16.8 18.5 30.7 16.4

表三、不同染料濃度含量的萃取相進行反向萃取的結果

total recovevry(%)

conc. of dye(mM) 0.57 1.09 2.54 2.67 conc. of

lysozyme(mg/L)

200 20.1 22.6 31.7 40

500 10.5 13.3 20.7 33.8

1000 7.5 11.5 22.1 30.5

表四

^、

萃取相清洗前後濃度的比較

concentration of dye

before being washed

dye/IL(mg/ml) 0.5 1 2 3

dye/IL(mM) 0.78 1.57 3.14 4.71 after being washed

real conc.(mM) 0.57 1.09 2.54 2.67

0 1 2 3 4 5

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

real conc. (10-3 M)

initial conc. (10

^-3

M)

圖 14、比較離子液體相中，清洗前加入的染料含量與經過清洗後真實存在的染料含量

蛋白質的三級結構主要是受下列四種作用力的影響而能穩定存在： (1)胺基酸序列本身親疏水性的差異(hydrophobic bonds) （2）

氫鍵作用力(H-bonds) (3)雙硫鍵的存在與否(disulfide bonds) (4) 帶電荷的R’group 彼此之間的離子吸引力(salts bonds)。本實驗藉由添加鹽類改變溶液中的離子強度，產生遮蔽效應，使得蛋白質R’group 彼此之間的離子吸引力減弱，蛋白質的三級結構在鹽類存在的環境下產生變形，此時親和性染料與蛋白質之間因構形互補所貢獻的親和力，因著蛋白質的變形而減弱，蛋白質可被成功反向萃取出來。圖 15 為在 pH 7 不同 NaCl 濃度對於溶菌酶反向萃取影響的結果，發現隨著NaCl 濃度的增加，反向萃取效果增加，所以離子強度確實可影響蛋白質與親和性染料之間的親和力作用。

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0

10 20 30 40 50 60 70 80

tota l re cove ry (%)

NaCl (M)

圖 15、NaCl 濃度對溶菌酶反向萃取效果的影響

4-4 pH 值對蛋白質萃取的效應

文獻中曾經以MALDI探討蛋白質與磺酸類親和性染料之間的作用力, 提出兩者之間的主要吸弓力應為庫侖靜電力⁶⁰。由於染料上磺酸根的pKa值極低，在一般的實驗條件下，磺酸根上所帶的氫會游離，使得親和性染料本身帶有負電，可和蛋白質上的protonated site 結合(deprotonated SO3 group-NH2 terminus)。為了進一步確認親和性染料與蛋白質之間的作用力機制為何，本實驗藉由改變蛋白質正向及反向萃取時緩衝溶液的pH值，觀察其萃取率的變化。溶菌酶的等電點(pI)~11.0，在pH值為 7.0 的緩衝溶液中,是以帶正電荷的形式存在，假設Procion Blue MX-R是以負電荷形式與蛋白質互相吸引而結合，蛋白質基團上所帶的電荷隨著pH值改變而變化，在低pH值時可得到最佳正向萃取率，反之在高pH值時，由於靜電排斥力的作用，

蛋白質可脫離親和性染料而得到最好的回收效果；正向萃取的實驗結果如圖16 所示，隨著pH值的增加，溶菌酶的正向萃取率大致上是隨著pH值增大而降低，在pH值 12 時甚至沒有萃取效果，然而其變化趨勢並不完全與pH值變化吻合，在圖中可以發現，pH值 7~8 與pH值 2~3 的萃取效果相近，顯示pH值並不是影響Procion Blue MX-R與溶菌酶互相結合的唯一條件。圖17 為反向萃取的圖形，比較以無鹽類存在和添加了1M NaCl的緩衝溶液進行反向萃取的回收率效果，從實驗結

果可以發現，當沒有鹽類存在時，即使將緩衝溶液pH值提高至 12，

仍然無法將溶菌酶從萃取相中回收；而在相同 1M NaCl的條件下，溶菌酶的回收率也不如預期中會隨著pH值的增加的提升，反而隨之下降。由此推論在本實驗條件下，親和性染料Procion Blue MX-R與溶菌酶的結合作用力主要貢獻並非來自庫侖靜電力。圖18 為在不同pH值下進行萃取後，染料在水相中分布的情形；由於此類磺酸類染料的水溶性與其所帶的磺酸根基團數目以及解離程度有關，本實驗所選用的染料Procion Blue MX-R之所以能在離子液體中有良好的溶解度，除了因為其只帶兩個磺酸根基團，與常用的CB dye相比水溶性較差之外，

Procion Blue MX-R在離子液體Bmim-PF⁶中能以非解離狀態穩定存在，也是使得染料傾向分布在離子液體中的原因之一。如圖18 所示，

在不同pH值下經過攪拌萃取的步驟後，離子液體相中的染料隨著pH 值提高發生解離，會傾向溶於水相中，可以觀察到水相的染料顏色逐漸加深。而親和性染料Procion Blue MX-R在離子液體Bmim-PF6中以非解離狀態穩定存在，使得染料上的磺酸根基團不帶負電，這是造成庫侖靜電力在本實驗中並非為主要作用力的主因，在此，染料的結構提供類似輔酶NAD⁺的構形，才是溶菌酶與染料之間親合力的主要來源。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

圖 18、Procion Blue MX-R 在不同 pH 值水相中的分布，

由左到右的pH 值依序為 5~10

4-5 離子液體重覆使用的效率

由於離子液體相對於傳統揮發性有機溶劑來說，具有幾乎可忽略的蒸氣壓和可以重覆使用的優點，本實驗嘗試將使用過的離子液體回收後再使用，了解其重覆使用的可行性。結果如圖19 所示，經過兩次反向萃取的步驟，總回收率可從31.7 % 提高到 45.6 % ，但仍未達到百分百，使得離子液體相中仍殘留有未被反向萃取出來的溶菌酶，且已知每單位的Procion Blue MX-R 對蛋白質進行親和性結合的能力有限，隨著使用次數的增加，離子液體對溶菌酶的萃取效率遂逐漸降低。另外，已知鹽類的存在會影響親和性染料萃取蛋白質的效率，所以在每次重覆使用萃取相之前，都會以去離子水進行清洗，再進行下一次萃取的步驟，然而此步驟並未能將萃取相中的鹽類完全清洗乾淨，這也是造成萃取效率隨著使用次數增加而降低的原因之一。

1 2 3 4 5

forward extraction total recovery

圖 19、離子液體使用次數對溶菌酶萃取效果的影響

4-6 比較不同蛋白質的萃取率

由於親和性染料是一種group-specific ligand，對蛋白質的結合並不是絕對的專一性，所以本實驗選擇了數種不同的蛋白質進行實驗，

觀察其萃取效果如何。溶菌酶（pI=10.7）、卵白蛋白（pI=4.3）、牛血紅素（pI=6.8）、細胞色素 c（pI=10.5）具有不同的 pI 值，在 pH=7 的環境下，溶菌酶與細胞色素c 皆帶正電，卵白蛋白與牛血紅素則帶負電。如圖20 所示，發現僅有溶菌酶可被成功萃取；細胞色素 c 雖然與溶菌酶帶有相同的電性，卻不與Procion Blue MX-R 親和，實驗結果再次證明庫侖靜電力並不是決定親和性染料與蛋白質之間結合與否的唯一作用力。

為了測試本實驗的選用的染料Procion Blue MX-R 在蛋白質混合物中萃取純化溶菌酶的能力，分別將卵白蛋白、牛血紅素、以及細胞色素與溶菌酶混合（皆為200 ppm），以相同實驗條件進行萃取。實驗結果如圖21、22、23 所示，在其他蛋白質存在的情況下，溶菌酶的萃取效果受到影響略為降低，而原本不與染料結合的卵白蛋白以及牛血紅素，在此卻有明顯的萃取效果；會造成這種現象的原因，是由於帶正電的溶菌酶會吸引混合溶液中帶負電的蛋白質基團，卵白蛋白與牛血紅素皆帶正電，而卵白蛋白的電性又大於牛血紅素，使得大約 55 %的卵白蛋白會受到溶菌酶的吸引而隨之萃取到離子液體相中，牛

血紅素僅有10 %左右；細胞色素 c 與溶菌酶因相同電性互斥，所以萃取結果不受影響；蛋白質之間的極性相吸也有一部分的貢獻，但較為次要。

l y s a l b h b c y t o

forward extraction total recovery

圖 20、分別對溶菌酶、卵白蛋白、牛血紅素

在文檔中應用親和性染料於離子液體中進行蛋白質液相╱液相萃取 (頁 42-63)