第一節 實驗目的
利用高油實驗飼料配方來配製15 % 米麩油含量飼料餵養第 2 型糖尿 病大鼠，以腹腔注射葡萄糖耐受試驗 ( intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT )，來評估米麩油對第 2 型糖尿病大鼠體內胰島素敏感性是否有改 善，及探討攝取米麩油對體內脂質與葡萄糖代謝相關酵素的蛋白質及 mRNA 表現。
第二節 實驗材料與方法
一、實驗材料製備
米麩油由築野食品工業株式會社 ( Tsuno food inductrial company, Japan )。
二、實驗設計 (一) 實驗流程：
25 隻七週齡的 Wistar 品系雄鼠，購自樂斯科動物中心，體重為 200 ± 10 g，先以 Rodent Laboratory Chow 5001 餵養至八週齡，再進行為期兩週 的糖尿病誘發，直至十週齡確定糖尿病誘發成功時，將糖尿病大鼠隨機 分組，進行四週實驗。於實驗開始，先自尾靜脈抽取禁食血液，四週實 驗結束後犧牲大鼠取腹腔動脈血、肝臟及腓腸肌。流程圖如下：
(二) 實驗分組 商業囓齒配方飼料 ( Rodent Laboratory Chow 5001 )，自由飲水。實驗期 間，每天給予25 g 實驗飼料及自由飲水。
三、糖尿病誘發
與實驗一的誘發步驟相同。以0.9 % ( W/V ) 生理食鹽水分別配製 nicotinamide solution ( 100 mg/mL ) 及 STZ solution ( 50 mg/mL，須當場配
分組
製，要避光冰浴 )，進行注射前須先用乙醚麻醉 Wistar 大鼠，注射程序先 以腹腔注射nicotinamide ( 150 mg/kg BW )，15 分鐘後再以腹腔注射 STZ，
劑量為45 mg/kg BW。隔一天後，重覆上述注射程序，即完成兩階段誘發。
誘發期間自由進食商業囓齒配方飼料 ( Rodent Laboratory Chow 5001 )，自 由飲水，兩週後測禁食血糖值，當大鼠禁食血糖平均值大於180 mg/dL，
即認定為第2 型糖尿病誘發成功。
四、腹腔注射葡萄糖耐受試驗 ( Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT )
先採集糖尿病大鼠禁食血液後，以腹腔注射葡萄糖液( 0.5g glucose/kg BW )，於注射後第 15、30、60、90、120、180 分鐘採集尾靜脈血液。測 量七個時間點的血漿葡萄糖及胰島素濃度。之後以時間點為橫軸，葡萄糖 或胰島素濃度為縱軸畫出濃度曲線，可用於計算出葡萄糖與胰島素濃度曲 線下面積。
五、樣本採集和前處理
在實驗的第四週實驗期滿後，將 Wistar 大鼠禁食 12 小時，隔天自腹 腔注射5 % sodium pentobarbital，待老鼠麻醉後進行解剖，取出肝臟、肌 肉。血液收集至含有抗凝血劑 ( EDTA ) 之微量離心管，於 3000 × g 下離 心10 分鐘，用微量分注器 ( micropipette ) 將血漿再分裝至新的微量離心 管，儲存於-80℃冷凍櫃，留待日後分析。取出之肝臟、肌肉以 0.9 %生理 食鹽水清洗，再以吸水紙拭乾、稱重後以鋁箔包裹，迅速置於液態氮中 急速冷凍，以夾鏈袋密封，儲存於-80℃冷凍櫃，留待日後分析。
六、檢測項目
(一) 血漿部份: 葡萄糖濃度、胰島素濃度、三酸甘油酯濃度、游離脂肪酸
濃度、總膽固醇濃度、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇濃 度、脂肪酸組成，方法步驟同實驗一。
(二) 臟器部份: 肝臟三酸甘油酯及膽固醇含量，方法步驟同實驗一。
(三) 葡萄糖代謝相關酵素 mRNA 及蛋白質表現量分析:
肌肉部份insulin receptor；肝臟部份: glucokinase、PEPCK、G6Pase。
(四) 肝臟膽固醇及脂質代謝酵素 mRNA 及蛋白質表現量分析
膽固醇及脂質代謝酵素包括:肝臟的 HMG-CoA reductase、cholesterol 7α-hydroxylase、LDL-receptor、fatty acid synthase、acetyl-CoA
carboxylase、acetyl-CoA oxidase。
(五) 轉錄因子的 mRNA 及蛋白質表現量分析
肝臟部份: sterol regulatory element binding protein-1c/2
( SREBP-1c/2 )、carbohydrate response element binding protein ( ChREBP )、
peroxisome proliferator activated receptor-α ( PPAR-α )，肌肉部份:
peroxisome proliferator activated receptor-γ ( PPAR-γ )。
1. 大鼠肝臟組織蛋白質萃取
參考Davidson 等人的方法 ( Davidson and Arion, 1987 )，再經修飾而 成。依所分切的大鼠肝臟重量，分別加入肝臟十倍體積冰過的均質液於 2mL 微量離心管 ( eppendorf ) 中，均質液配方為 50 mM Tri-HCl，pH 7.4、
300 mM sucrose、100 mM KCl、1 mM EDTA、β-mercaptoethanol 0.7μL/mL 及5μL/mL protease inhibitors。先將 2mL 微量離心管插於裝有碎冰的燒杯 上降溫，之後取100 mg 肝臟組織，並加入 1mL 冰過的均質液置於微量離 心管中，然後利用均質機 ( Polytron PT 1200 C ) 以固定 1200 rpm 轉速均 質40 秒，完成後將組織均質液移至 1.5 mL 微量離心管，使用冷凍離心機 以12000 rpm，4℃離心 40 分鐘。收集上清液 ( 組織蛋白質萃取液 ) 分裝
於微量離心管，置於碎冰上保持低溫，避免蛋白質變性及分解。 μg/mL、40 μg/mL 的蛋白質定量標準溶液，與 coomassie brillian blue G 250
反應30 分鐘後，測吸光值作出濃度標準曲線。之後將組織蛋白質萃取液
與染料反應後測吸光值，並比對蛋白質定量濃度標準曲線，算出萃取液蛋 白質濃度。
3. 蛋白質表現分析:
利用西方墨點法 ( Western blot )：取組織蛋白質液 20-30 μg，與 electrophoresis loading dye 均勻混合後，於 95℃煮沸 3 分鐘，然後置於碎 冰上急速冷卻，接著使用60 及 90 伏特電壓以 10 或 12 % SDS-PAGE gel
接著使用Enhanced Chemiluminescence System ( ECL )，標定膜上的蛋白 質。將已被標定之PVDF 膜，置於 X-ray 軟片下感光後，以顯影劑和定影
劑將X 光片上的影像呈現，使用影像分析軟體掃瞄，便可將 X 光片上的 不同蛋白質的表現量數據化。
使用的抗體包括:
(1) 一級抗體 ( primary antibody ) :
Goat anti-PEPCK antibody ( NP_002582.2, Acris Inc., DE )
Mouse monoclonal anti-PPAR-α antibody ( ab2779, Abcam Inc., UK ) Mouse monoclonal anti-PPAR-γ antibody ( ab41928, Abcam Inc., UK ) Rabbit polyclonal anti-ChREBP antibody ( ab30681, Abcam Inc., UK ) Rabbit polyclonal anti-GAPDH antibody ( ab9485, Abcam Inc., UK )
Rabbit polyclonal anti-fatty acid synthase antibody ( ab3844, Abcam Inc., UK ) Rabbit polyclonal anti-glucokinase antibody ( ab37796, Abcam Inc., UK ) Rabbit polyclonal anti-HMG-CoA reductase ( #07-457, Upstate Inc., UK ) Rabbit polyclonal anti-insulin receptor ( phospo tyrosine 972 ) antibody ( ab5678, Abcam Inc., UK )
Rabbit polyclonal anti-LDL receptor antibody ( ab30532, Abcam Inc., UK ) Rabbit polyclonal anti-SREBP1 antibody ( ab28481, Abcam Inc., UK ) Rabbit polyclonal anti-SREBP2 antibody ( ab30682, Abcam Inc., UK )
Rabbit monoclonal anti-acetyl-CoA carboxylase ( ab45174, Abcam Inc., UK ) (2) 二級抗體 ( secondary antibody )
Goat polyclonal anti-mouse IgG ( HRP ) antibody ( #04-18-06, KPL Inc., UK ) Goat polyclonal anti-rabbiit IgG ( HRP ) antibody ( ab6721, Abcam Inc., UK ) Rabbit polyclonal anti-goat IgG ( HRP ) antibody ( ab6741, Abcam Inc., UK ) 4. 肝臟膽固醇及脂質代謝酵素 mRNA 表現量分析
(1) RNA 萃取 ( Chomczynski and Sacchi, 1987 )：
鑷子和均質管必須經過滅菌水沖洗 2 次、酒精噴 2 次、DEPC water 沖洗2 次之後，以備好的鋁箔紙秤取肝臟組織 0.05 ~0.1 克並且包裹好放置 冰上，鑷子取肝臟組織至均質管中，再小心加入1 mL Trisolution，將轉速
調至800~1000 rpm 約均質 30 秒，均質好之後加入預冷的 100 μL
chloroform，用手指輕彈 eppendorf 使其混合均勻，靜置於碎冰上 5 分鐘後，
在4℃下 12000 ×g 離心 10 分鐘。將已離心好的上清液取至新的 eppendorf
HMG-CoA reductase、CYP7A1、LDL receptor、fatty acid synthase、
acetyl-CoA carboxylase、acetyl-CoA oxidase、GAPDH 皆是透過 NCBI ( National Center for Biotechnology Information ) 基因庫查詢大鼠的實驗所 需相關基因之mRNA 序列，並且利用引子設計軟體 Primer3 找尋最恰當的 引子，透過波仕特生物科技公司 ( Protech Technology Inc., Taiwan ) 合成，
以滅菌水稀釋之後儲存於-30 °C 冰箱備用。
(4) 反轉錄聚合酶連鎖反應 ( Reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR )：
第一步驟：反轉錄作用 ( Reverse transcription, RT )
於 PCR 反應管中加入 10X MMLV-RT buffer 5 μL、0.1M DTT 5 μL、
2.5 mM dNTP 10 μL、Oligo ( dT )12-18、0.5 μL ( 0.5 μg )、sample (已測過 RNA 濃度)，最後再加入 MMLV reverse transcriptase 0.5 μL，剩餘體積為 DEPC water 使總體積為 50 μL，之後利用桌上型微量離心機將其混合均勻，再置
入聚合酶連鎖反應器 ( PCR machine ) 於 37℃下反應 60 分鐘，使單股 RNA 反轉錄成cDNA，反轉錄完成的 cDNA 儲存於-30℃冰箱備用。
第二步驟：聚合酶連鎖反應 ( polymerase chain reaction, PCR )
取 2 μL cDNA、10X Taq buffer 5 μL、2.5 mM dNTP 2 μL，以及
HMG-CoA reductase、LDL receptor、CYP7A1 等如表三的 primers 各 1 μL，
最後再加入5 unit/μL Taq enzyme 1 μL，之後加入滅菌水，使總體積為 50 μL。之後同樣使用 PCR machine 在 94℃下變性 30 秒、58℃黏合 30 秒、
72℃延伸 30 秒，共經過 35 cycles，即可得其聚合酶連鎖反應產物。
(5) 電泳分析及表現量的呈現：
取1.5克agarose粉末加入100 mL 1X TBE配製成1.5%的濃度，利用微波 爐加熱至透明樣，之後待其降溫至60-70℃後再加至凝膠槽中，然後插入齒 列，凝固之後即可使用。將製好的膠片放入橫式agarose膠電泳槽中，加入 0.5% TBE running buffer必須蓋過膠片，以DNA ladder LC當作標準品，利 用微量分注器 ( micropipete ) 取1 μL loading dye和7 μL PCR產物混合均 勻，然後緩慢注入膠片中，之後以100V伏特數，進行三十分鐘電泳即可。
利用溴化乙錠 ( ethidium bromide, EB ) 染色10分鐘、脫色8分鐘後，使用 UV影像系統拍下電泳膠片影像，予以日後用影像分析軟體Image-Pro Plus ( Media cybernetics ) 定量。標的酵素mRNA表現量以其PCR產物的表現量 與GAPDH或beta-actin ( internal control ) 的表現量的比值表示。
(六) 統計分析
數據以 mean ± SEM 使用 SAS 軟體 9.0 版本進行 Student`s t test 進行 組間差異比較。並以Paired t test 進行各組實驗前後差異，當 p＜0.05 時，
代表具有統計上的顯著性。
第三節 實驗結果
於C 組 ( p < 0.05 )。如表十九所示，經過四週實驗飼料餵養後，RO 組糖
尿病大鼠的血漿葡萄糖與胰島素濃度曲線下面積，分別比C 組顯著下降
29.8 % 與增加 133.5 % ( p < 0.05 )。
四、肝臟重量及脂質含量變化
由表十五所表示，經過四週實驗飼料餵養後，兩組的肝臟重量無顯著 差異。RO 組的肝臟三酸甘油酯及膽固醇濃度雖然分別比 C 組增加 39.5 % 及23.9 %。但是，未達到統計上的顯著差異性。
五、血漿脂肪酸與肝臟脂肪酸組成的變化 (一)禁食血漿飽和脂肪酸組成
如表十六所示，兩組糖尿病大鼠經過四週實驗飼料餵養後，糖尿病大 鼠禁食血漿飽和脂肪酸組成，RO 組的棕櫚酸 ( C16:0 ) 含量，顯著比 C 組增加15.1 % ( p < 0.05 )。而 RO 組的肉豆蔻酸 ( C14:0 ) 、硬脂酸 ( C18:0 ) 和花生酸 ( C20:0 ) 的含量，則分別比 C 組顯著降低 62.9 %、18.1 %、67.5
% ( p < 0.05 )。
（二）禁食血漿單元不飽和脂肪酸組成
如表十六所示。糖尿病大鼠經過四週實驗期後，RO 組血漿油酸 ( C18:1 ) 與總單元不飽和脂肪酸含量，分別比 C 組顯著增加 45.1 % 及 41.8 % ( p < 0.05 )。
（三）禁食血漿多元不飽和脂肪酸組成
如表十六所示。糖尿病大鼠經過四週實驗飼料餵養後，RO 組的血漿 亞麻油酸 ( C18:2 ) 及總多元不飽和脂肪酸含量，分別比 C 組顯著降低 21.5 % 及 11.1 % ( p < 0.05 )。
（四）肝臟飽和脂肪酸組成
（一）肝臟Acetyl-CoA carboxylase 的蛋白質與 mRNA 表現量
如圖八所示，RO 組的 Acetyl-CoA carboxylase 蛋白質表現量，較 C 組顯著增加171.9 % ( p < 0.05 )。如圖九所示，RO 組的 Acetyl-CoA carboxylase mRNA 表現量，也比 C 組顯著增加 101.7 % ( p < 0.05 )。
（二）肝臟Fatty acid synthase 的 mRNA 與蛋白質表現量
如圖十所示，RO 組的 Fatty acids synthase mRNA 表現量，也比 C 組 顯著增加185.8 % ( p < 0.05 )。如圖十一所示，RO 組的 Fatty acids synthase
蛋白質表現量，較C 組顯著增加 137.2 % ( p < 0.05 )。
（三）肝臟HMG-CoA reductase 的 mRNA 與蛋白質表現量
如圖十二所示，RO 組的 HMG-CoA reductase mRNA 表現量，則比 C 組顯著增加128.2 % ( p < 0.05 )。如圖十三所示，C 組與 RO 組的 HMG-CoA reductase 蛋白質表現量，兩組無統計上的顯著差異。
（四）肝臟低密度脂蛋白接受體LDL-receptor 的 mRNA 與蛋白質表現量 如圖十四所示， RO 組的 LDL-receptor mRNA 表現量，則比 C 組顯 著增加88.9 % ( p < 0.001 )。如圖十五所示，RO 組的 LDL-receptor 蛋白 質表現量，較C 組增加 53.6 %，但是未達統計上的顯著差異( p = 0.054 )。
（五）肝臟Cholesterol 7α- hydroxylase 的 mRNA 表現量
如圖十六所示，RO 組的 Cholesterol 7α- hydroxylase 的 mRNA 表現 量，比C 組顯著增加 135.5 %（p < 0.001）。
八、肝臟的糖解與糖質新生作用相關酵素mRNA 與蛋白質表現量
（一）肝臟Glucokinase 的蛋白質與 mRNA 表現量
如圖十七及圖十八所示，RO 組 Glucokinase 的 mRNA 表現量，則比 C 組顯著增加96.52 %（p < 0.05）。RO 組的 Glucokinase 蛋白質表現量，較 C 組增加23.8 %，但是無統計上的顯著性。
（二）肝臟PEPCK 的蛋白質與 mRNA 表現量
（二）肝臟PEPCK 的蛋白質與 mRNA 表現量