第六節 含植物性雌激素測試物對 HAEC 細胞 MCP-1 分泌量之影響
一、 對巨噬細胞膽固醇、脂質堆積之影響
動脈粥狀硬化的發生過程是一連串複雜的生化反應， LDLR
(LDL-receptor), LXRα, PPARs (α,γ), CD-36 彼此間 cross-talk 的基因表現與膽固醇代 謝、動脈粥狀硬化有關 (Kaul, 2001)。巨噬細胞會經由清除者受器將 oxLDL 攝入，
於細胞內堆積成膽固醇酯，不斷累積膽固醇酯的巨噬細胞最終會形成泡沫細胞，
且清除者受器會高度表現於動脈粥狀硬化損傷處 lipid-laden 的巨噬細胞上 (Nakata
et al., 1999)。CD36 與 scavenger receptor class A (SR-A) 為巨噬細胞中主要負責攝
入修飾型脂蛋白的主要受器，兩者可共同負責 75~90％acetylated 及 oxidized LDL 之降解與攝入 (Kunjathoor, et al.2002)，且缺乏 CD36 的monocyte-derived-macrophages 與正常細胞相比，會減少 40~50％與細胞結合的 oxLDL (Nozaki et al., 1995)。LDL 氧化時會形成一種氧化的磷脂質，與 CD36 有高 度親和力 (Podrez, E. A. et al., 2002)。CD36 表現下降時，會減少巨噬細胞對 oxLDL 的攝入，減緩泡沫細胞生成，而有助於減緩動脈粥狀硬化 (Janabi et al., 2000)。
Kaempferol、rhamnocitrin 及 aged garlic extract 皆可顯著抑制與 oxLDL 共同培養之 PMA-differenitiated THP-1 macrophages 上 CD36 的表現，且皆可抑制巨噬細胞對 oxLDL 之攝入 (Ide, N., Keller, & Weiss, 2006; Tu et al., 2007)。本研究欲檢視各種含 植物性雌激素活性之測試物質，是否也可以透過減少 CD36 mRNA 表現，減少巨 噬細胞對 oxLDL 之攝入，下降細胞內總膽固醇量，進而延緩泡沫細胞形成。
Oil-Red-O 能對膽固醇酯、中性脂肪進行染色，可用以觀察巨噬細胞內脂質堆 積情形 (Kruth, 1984)，Rahaman 等人 (2006)與 Pordez 等人(2000)亦應用此法作為 判斷泡沫細胞生成的依據。由本次染色結果發現苜蓿芽乙酸乙酯萃物之吸光值顯 著高於 oxLDL treatment，茉莉甲醇萃物則顯著低於 oxLDL treatment，故推測在本 實驗條件下，苜蓿芽乙酸乙酯萃物會增進細胞內脂質、膽固醇酯的堆積，可能促 進泡沫細胞生成，而茉莉甲醇萃物則能抑制細胞內脂質、膽固醇酯的堆積，具有 減緩泡沫細胞生成的潛力。
然而，Oil-red-O 除了能對膽固醇酯進行染色，也會染到中性脂肪。因此，為 了辨別細胞內膽固醇之堆積是否確實增加，便檢測了巨噬細胞內總膽固醇濃度。
在本實驗模式下，oxLDL 確實能引起巨噬細胞內總膽固醇堆積，顯著增加了 1.5 倍之多。在本實驗所有測試物中，以 enterolactone、sesamin、茉莉甲醇萃物及菊花 甲醇萃物能有效抑制細胞內總膽固醇量。比較 Oil-red-O staining 和膽固醇堆積量的 結果發現，sesamin、山藥乙酸乙酯萃物及茉莉甲醇萃物之 Oil-red-O 染色與細胞內 膽固醇量趨勢相符。由此，我們推測 sesamin 及茉莉甲醇萃物具有減緩泡沫細胞生 成的潛力。
為了探究測試物能降低細胞內膽固醇堆積的可能原因，我們分析測試物對於 巨噬細胞 CD36 mRNA 表現的影響。結果發現，在培養 16 小時後，enterolactone、
genistein、茉莉及菊花甲醇萃物可顯著抑制 CD36 mRNA 表現，而培養 48 小時後，
enterolactone、sesamin 及 genistein 亦能顯著抑制 CD36 mRNA。所以我們推測 enterolactone、sesamin、茉莉甲醇萃物及菊花甲醇萃物，能夠經由抑制 CD36 表現 而減少細胞內膽固醇堆積。
數個臨床試驗研究發現，每日補充 flaxseed 的飲食（30-50g/day），對於血脂正 常或過高的受試者，皆可發揮有益的功效，可下降血清總膽固醇及 LDL-C (Cunnane
et al., 1995; Lucas et al., 2002; Patade et al., 2008)，而有助於延緩動脈粥狀硬化。另
外，使用 hamster 卵巢切除小鼠的研究指出，飼料中添加有 flaxseed 的組別，可避 免血漿總膽固醇升高，並可減少脂肪條面積及損傷之發生 (Lucas et al., 2004)。而 flaxseed 於腸胃道經腸內菌代謝後產生 enterolactone，進入血液循環。本研究發現，enterolactone 能透過抑制 16 小時及 48 小時之 CD36 mRNA 表現，而減少細胞內總 膽固醇堆積量，有助於減少泡沫細胞生成，推測能幫助減少脂肪條面積，而與以 上研究結果相符。
山藥 (Dioscorea rhizome) 能顯著降低高血脂兔子的 thoracic aorta 的
atherosclerotic lesion (Chang WC, 2005)。本研究發現山藥乙酸乙酯萃物能顯著增加 細胞內總膽固醇量，但是由於 CD36 mRNA 表現量並未上升，所以可能透過別的 機轉。由於本實驗條件並沒有加入 apoAⅠ或 HDL，所以 free cholesterol 並無法透
過 ABCA1 的作用排出。山藥乙酸乙酯萃物促進細胞內總膽固醇量，可能是經由其 他的途徑，例如促進 SR-A 的表現或胞飲作用而來。就我們這個細胞實驗模式，與 Chang et al. (2005)的動物實驗結果似乎不符合，可能是因為動物實驗以山藥粉餵 食，山藥粉中含有能降血脂的膳食纖維及皂素等物質，所以達到減少動脈損傷的 乙酯的極性）被巨噬細胞所攝入，而染到較多的中性脂肪，導致Oil-red-O staining 吸 光值較高的現象。本實驗室日前發現，以苜蓿乙酸乙酯萃物餵食apoE-/-小鼠，具有 膽固醇進行染色 (Kruth, 1984)，所以推測 genistein 可能會影響中性脂肪的堆積或 膽固醇的酯化。研究發現 genistein (100µM) 能減少 HepG2 細胞內膽固醇酯化達 56
％，但是對 acyl-CoA: cholesterol acyltransferase （ACAT）沒有影響 (Borradaile et
al., 2002)。故我們推測投予 genistein 使得巨噬細胞內膽固醇酯的含量降低，而膽
固醇酯的生成與 foam cell 形成有顯著相關，所以 genistein 是否具 anti-atherogenic 潛力可從此方向進行評估。ABCA1 在 lipid-loaded 巨噬細胞上會被引起高度表現 (Langmann, T. et al.,
1999)，是促進膽固醇排出的主要路徑。ABCA1 是一種細胞膜上的脂質傳送蛋白 (transporter)，能促進磷脂質及未酯化的膽固醇排出至 apoA-Ⅰ，以形成 pre-β-HDL (Cuchel & Rader, 2006)。ABCA1 的高度表現 (over-expression)可以避免斑塊的發生 與形成，因此可知 ABCA1 對巨噬細胞膽固醇調節是一個很重要的因素 (Van Eck et
al., 2005)。
本研究發現 enterolactone、sesamin、genistein 及茉莉甲醇萃物在刺激 16 小時的 ABCA1 mRNA 表現量有顯著下降，但是所有測試物對於 48 小時的 ABCA1 mRNA caspases 及細胞激素，而形成急性或慢性的發炎反應，最著名的即是 caspase-1 與 IL-1β。Inflammasomes，細胞質內的多種蛋白複合體，作用如同活化 caspase 的支 架，最近被認為是調節宿主先天免疫及發炎反應的重要機制 (Johnston, Rahman, &
McFadden, 2007)。
許多研究指出，oxLDL 會刺激動脈內 O2¯ 形成，增加細胞氧化壓力，活化 MAPK pathway 及轉錄因子 NFκB，且刺激其調節的基因表現，尤其是促發炎因子的基因，
包含 IL-1β、TNFα、MCP-1 等 (Brand et al., 1997; Thomas et al., 1994)。其中 Oxysterols 及 25-hydroxycholesterol 的成分會引起巨噬細胞大量分泌 IL-1β 並刺激其 mRNA 表現 (Rosklint et al., 2002)。不斷分泌的 TNFα 及 IL-1β 會加重動脈內膜的 發炎反應，使內皮細胞及平滑肌細胞受到損傷，且轉變巨噬細胞功能而促進動脈 粥狀硬化生成 (Ross, 1999)；所以抑制發炎反應可以減緩動脈粥狀硬化。
雌激素可抑制 NFκB 活化及其下游 pathway，有助延緩動脈粥狀硬化進程 (White, 2002)。Hamalainen 等人 (2007) 指出，植物性雌激素 genistein 能透過抑制