第四節 實驗方法
五、 細胞內膽固醇濃度測定
四 四
四、 、 、 、 細胞存活率分析 細胞存活率分析 細胞存活率分析 細胞存活率分析（ （ （ （MTT assay） ） ） ）
以 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide（MTT；SIGMA）
為受質，該受質在活細胞中會被粒腺體 dehydrogenase 還原，而產生紫色 formazan 產物。在 550 nm 有最大吸收，利用比色法來測定細胞存活率。當存活細胞越多， 100 µl isopropanol with 0.04N HCl 反應約 30 分鐘，並用 shaker 搖晃以溶解細胞，
最後送入 ELISA Reader（TELAN）以 550nm 讀取吸光值，以培養時未加入任何測
試物之細胞吸光值為對照組（100％），再以實驗組之吸光值除以對照組之吸光值， buffer，以刮杓將細胞刮下，收集於微量離心管中，以 14000g、4℃離心 10 分鐘。
離心後，取其上清液並保存於-80℃冰箱中。
2. 細胞內總膽固醇測定
使用商業試劑（Randox），將標準品序列稀釋後，從中與樣品各取出 50 µl 加入試
固醇濃度畫出標準曲線，求出膽固醇濃度（µg/µl）。最後除以各樣品之蛋白質含 量以校正。
3. 蛋白質定量
使用 Bradford method，以 Bradford (BioRad) 為蛋白質染劑，將標準品 BSA
（SIGMA）及樣品加入染劑混合均勻五分鐘後，以波長 595 nm 測定吸光值。以標
Bradford（µl） 100
總體積（µl） 500
預先在 96 well ELISA plate 上 coating capture antibody 100 µl 後，放置於 4℃
overnight，以 wash buffer 清洗掉多餘或未固定於盤底的 capture antibody，接著進 行 blocking 的步驟以降低非特異性的干擾，1 小時後以 wash buffer 清洗，再依序
加入 100 µl 的標準品及樣品培養，2 小時後以 wash buffer 清洗，加入 detection antibody 反應，1 小時後以 wash buffer 清洗，再加入 enzyme reagent（avidin-HRP）
反應，30 分鐘後以 wash buffer 清洗，以 TMB（tetramethylbenzidine）呈色系統呈 色，室溫下避光 15 分鐘，最後加入 2N H2SO4終止反應，測量 450 nm 之吸光值，
預先在 96 well ELISA plate 上 coating capture antibody 100 µl 後，放置於 4℃
overnight，以 wash buffer 清洗掉多餘或未固定於盤底的 capture antibody，接著進 行 blocking 的步驟以降低非特異性的干擾，1 小時後以 wash buffer 清洗。加入標 準品及樣品培養 2 小時，之後再加入 detection antibody 反應 2 小時，再加入 enzyme reagent（avidin-HRP）反應 45 分鐘，以 TMB 呈色，室溫下避光反應 20 分鐘，最 後加入 2N H2SO4終止酵素呈色反應，於 30 分鐘內送入 ELISA reader 讀取 450 nm
使用 6% paraformaldehyde 將細胞固定 1 小時。1 小時後，移除 6%
paraformaldehyde，再以 PBS 清洗兩次，加入 60% Oil-Red O 染劑覆蓋細胞 1 小時，
移除 Oil-Red O 染劑，以 PBS 清洗兩次。完成上述步驟後，於光學顯微鏡下觀察 及拍照，以觀察泡沫細胞生成情形。拍照完後，加入 100 µl isopropanol with 0.04N HCl 約 30 分鐘，用 shaker 搖晃以溶解細胞，最後送入 ELISA Reader（TELAN）以 500nm 讀取吸光值，以培養時未加入任何測試物之細胞吸光值減掉 blank (without cells)後之吸光值為對照組(control)，再以實驗組 (oxLDL treatment, chemicals &
extracts) 吸光值減掉 blank 之吸光值除以對照組，計算出相對之吸光倍數。
Triton X 100 in 0.1M Tris buffer, pH=8.0)，以螢光光度計（TEKON Technologies）
讀取 Ex 485/Em 530 螢光強度。
養 72 小時，再加入樣品先處理 2 小時，最後加入 oxLDL 共同培養 16 及 48 小時，
1. 反轉錄聚合酶鏈反應（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）
（1） 將 RNA 合成 cDNA
每管加入 1µg 的 RNA，以 70℃加熱 5 分鐘，置於冰上 5 分鐘，再加入 oligo(dT)、
DEPC H2O、transcriptase（ImpromⅡ, Promega）、RT 5X buffer（ImpromⅡ,
Promega）、MgCl2（Promega）、dNTP（Promega）至總體積為 20µL 於 PCR tube 中，
放入預先開機的 PCR 機 (42℃，60 分鐘、70℃，15 分鐘)，離心並移至-20℃保存 備用。
（2） 進行聚合酶連鎖反應
將5µL cDNA template分裝至小管，取1 µL 5’-primer、1µL 3’-primer、12.5 µL GoTaq Green Master Mix (包含Reaction Buffer、MgCl2、dNTP 及Taq DNA
polymerase混合物， Promega)，以nucleus-free H2O調整體積至25 µL後進行PCR。
條件如下：
95℃ 2 mins (讓cDNA的二級結構解開，並活化酵素) 94℃ 30 seconds Denature
72℃ 30 seconds Extend (gene 的片斷長，時間也會跟著長。)
這樣的週期循環後，在 72℃停留 10 分鐘，讓尚未完成的片斷繼續完成，之後停留 在 4℃，移至-20℃保存備用。
使用之 primer：
GAPDH，24 cycles
Sense CCATGGAGAAGGCTGGGG Antisense CAAAGTTGTCATGGATGACC
CD36，26 cycles
Sense GAGAACTGTTATGGGGCTAT Antisense TTCAACTGGAGAGGCAAAGG
ABCA1，28 cycles
Sense CAGAAAGCACTTTAAGCAGATTCC Antisense GGGCCATGTTATTTACTGTTCATAG
IL-1β，31cycles
Sense TTGTTGCTCCATATCCTGTCC Antisense CACATGGGATAACGAGGCTT
TNF－α，30 cycles
Sense CACTAAGAATTCAAACTGGGGC Antisense GAGGAAGGCCTAAGGTCCAC
MMP9，28 cycles
Sense CAACATCACCTATTGGATCC Antisense TGGGTGTAGACTCTCTCGCT
（3） 進行電泳
以 1.5% agarose 進行 DNA 電泳以檢定基因表現。將 SybrGold (Invitrogen)以 1：10000 的比例加入 Agarose 溶液中再進行凝膠。最後以紫外線照膠系統拍照後，使用 Image J 軟體進行定量。
十 十 十
十、 、 、 、 MMP-9 活性測定 活性測定 活性測定（ 活性測定 （ （ （Gelatin Zymography） ） ） ）
1. gelatin 電泳膠片製作 gelatin 製備
10%電泳膠片
（gelatin gel） 成分 5%電泳膠片
（Stacking gel）
8300 Gelatin solution －
－ d.d.water 3400
7000 30％ acrylamide（BioRad） 830
5250 1.5 M Tris-HCl（pH ＝ 8.8） －
－ 1.0 M Tris-HCl（pH ＝ 6.8） 630
165 10％ SDS（SIGMA） 50
165 50％ Glycerol －
100 10％ APS（SIGMA） 50
10 TEMED（SIGMA） 5
單位：µl
配製 gelatin gel 於室溫下混合均勻，注入電泳玻片間，以 75%酒精填滿空隙讓 膠得以壓平，待完全聚合。凝結後將酒精倒掉，配製 Stacking gel 於室溫下混合均 勻，注入電泳玻片間使 stacking gel 位於 gelatin gel 之上並插入電泳梳，待完全聚合 後去除電泳梳，裝置在電泳槽中，浸泡於電泳緩衝液（running buffer）等待加入樣 本進行電泳。
2. Buffer 配置
Wash Buffer Incubate Buffer Running Buffer
成
3. 蛋白質電泳（Electrophoresis）
使用之樣本同測定 MMP-9 蛋白質濃度之培養液，檢測培養液之總蛋白質濃度 後，使每個樣本之蛋白質濃度一致，每個槽溝需注入含 0.02µg 蛋白質的樣本，加入 等體積的染料（5X dye）及 SDS buffer，再將樣本及 marker 注入各個電泳膠片槽溝 中，以電壓 125V 進行電泳 1 小時。
4. Zymography
將跑完電泳的 gelatin 與 wash buffer 共同搖晃 1 小時，之後加入 incubate buffer，
經過 37℃、18 小時的培養後將 gelatin 以 CBR solution 染色 30 分鐘，最後以 Destain
第四章
為實驗干擾因素。以 MTT 測定細胞存活率。分別測定 enterolactone, sesamin, genistein 及各種萃取物對於 PMA-differentiated THP-1 macrophages 之存活率 (圖 4-1)。另外也測定各種測試物單獨處理 HAEC 細胞後其細胞存活率 (圖 4-2)。一、對於 PMA-differentiated THP-1 macrophages 的影響：
1. 在 chemical 測試物中， enterolactone、sesamin 及 genistein 分別在 1 µM，50 µM 與 20 µM 的單獨處理下，對 THP-1 macrophages 無顯著的 細胞毒性，故選用上述濃度作為後續實驗之條件。
2. 在萃物測試物中，山藥乙酸乙酯萃物、苜蓿芽乙酸乙酯萃物、茉莉甲醇
萃物及菊花甲醇萃物分別在 100 µg/ml 的單獨處理下，對 THP-1
macrophages 無顯著的細胞毒性，故選用上述濃度作為後續實驗之條件。
二、對於 Human Aortic Endothelial Cells (HAEC)的影響：
1. 在 chemical 測試物中， enterolactone、sesamin 及 genistein 分別在 1 µM，50 µM 與 25 µM 的單獨處理下，對 HAEC 無顯著的細胞毒性，故
0
yam EA extract (μg/ml) perc Fig 4-1. Effects of test compounds on viability of PMA-differentiated THP-1.
THP-1macrophages were treated with PMA at 75 ng/ml for 48hrs and test compounds for 48 hrs. Values are means ± SD. *Significantly different from control group (0)
0
alfalfa EA extract (μg/ml) perc
圖 4-2 不同處理對 HAEC 之細胞存活率影響
Fig 4-2. Effects of test compounds on viability of HAECs. HAECs were treated with test compounds for 24 hrs. Values are means ± SD
*Significantly different from control group(0) analyzed by Mann Whitney U t test, p
＜.05
yam EA extract (μg/ml) perc
alfalfa EA extract (μg/ml) perc
第二節 第二節 第二節
第二節 測試物對已分化 測試物對已分化 測試物對已分化 測試物對已分化 THP-1 細胞膽固醇堆積之影響 細胞膽固醇堆積之影響 細胞膽固醇堆積之影響 細胞膽固醇堆積之影響
一、氧化型低密度脂蛋白增加細胞內總膽固醇 (圖 4-3)
先以 PMA 處理 monocytic THP-1 細胞 72 小時形成 macrophage-like cells 為 PMA-differentiated THP-1 macrophages。再以氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）25，
50 及 100 µg/ml 共同培養 48 小時，觀察細胞內膽固醇堆積情形。
結果發現分別投與 25, 50, 100µg/ml oxLDL 與 control 組比較均顯著升高細胞 內的總膽固醇量。Control 組的細胞內總膽固醇平均量為 33.73 ± 5.70 (µg
cholesterol/mg protein)，投與 25, 50, 100 µg/ml oxLDL 時，總膽固醇平均量分別為 43.33 ± 1.25, 49.72 ± 3.95, 49.72 ± 3.95 (µg cholesterol/mg protein)；分別提高總膽固 醇百分比分別為 28.5%、47.4%、43.9%。
由於添加 50 及 100 µg/ml oxLDL 對於總膽固醇量之提升無顯著差異，所以我 們選用 50 µg/ml oxLDL 為後續實驗所用之濃度。
圖 4-3 不同 oxLDL 濃度之處理對 THP-1 細胞內之總膽固醇/蛋白質比例之影響 Fig 4-3. Effects of oxidized LDL treatment on the content of cellular cholesterol in THP-1 cells stimulated with PMA. THP-1 cells (106/ml) were incubated alone or with the indicated concentrations of oxidized LDL for 48 hours. Levels of cellular
cholesterol are expressed relative to cellular protein. Values are means ± SD.
*Significantly different from control group analyzed by Mann Whitney U test at p
＜.05
＊
＊ ＊
二、 含植物性雌激素測試物對氧化型低密度脂蛋白增加 THP-1 macrophages 細 胞內之總膽固醇堆積之影響
先以 PMA 處理 THP-1 細胞 72 小時，再以氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）50 µg/ml 培養 THP-1 macrophages 48 小時後，測量細胞內總膽固醇含量，並將數值 除以蛋白質濃度校正。
Control 組最後得到之膽固醇含量總平均為 33.73±5.70 (µg cholesterol/mg protein)，oxLDL treatment 組之總平均則為 49.01±4.02 (µg cholesterol/mg protein)，
因此得知以 oxLDL 處理後，細胞內總膽固醇量提升了 45.3％。以各次實驗 control 組之膽固醇含量為 100%，計算以測試物處理細胞後之相對增加或抑制百分比 (圖 4-4)。
結果發現 enterolactone 1 µM、sesamin 50 µM、茉莉甲醇萃物 100 µg/ml 及菊 花甲醇萃物 100 µg/ml，與單獨處理 oxLDL 的組別 (oxLDL treatment) 相比，可顯 著下降細胞內總膽固醇量。enterolactone 可下降 29.6%，sesamin 可下降 25.4%，
茉莉甲醇萃物可下降 42.8%，及菊花甲醇萃物可下降 38.6%之膽固醇堆積。
但是山藥乙酸乙酯萃物 100 µg/ml 顯著上升細胞內總膽固醇堆積達 93.8%。而 苜蓿芽乙酸乙酯萃物組及 genistein 組，與 oxLDL treatment 比較則無顯著差異。
圖 4-4 含植物性雌激素測試物對 oxLDL 處理細胞後之總膽固醇/蛋白質比例之影 響
Fig 4-4. The effects of chemicals and extracts on cellular cholesterol in
PMA-differentiated THP-1 macrophages incubated with oxLDL. THP-1 macrophages were treated with enterolactone (En), sesamin (Sn), yam EA extract (Y), alfalfa EA extract (A), genistein (G), jasmine methanol extract (J), and Chrysanthemum methanol extract (Ch) for 2 hrs and then co-cultured with oxLDL at 50 µg/ml for 48 hrs. Levels of cellular total cholesterol relative to protein were determined and the mean of control was set as 100%. Values are means ± SD.
*Significantly different from oxLDL analyzed by Mann Whitney U test at p＜.05 concentration
三、含植物性雌激素測試物對氧化型低密度脂蛋白刺激 THP-1 細胞內脂質堆積之 影響
THP-1 macrophages 培養 48 小時後，以 Oil-Red-O 染色，依此確定膽固醇酯 之生成 (圖 4.5)。之後以 isopropanol 溶解 Oil-Red-O 後，以 500 nm 讀取吸光值，
結果如圖 4.6。跟 control 組相比發現，oxLDL treatment 吸光值可增加 1.92 倍，顯 著高於 control 組。苜蓿芽乙酸乙酯萃物可增加 4.9 倍，顯著高於 oxLDL treatment；
而茉莉甲醇萃物之吸光值為 1.15 倍，顯著低於 oxLDL treatment。另外，sesamin、
genistein 之吸光值皆較 oxLDL treatment 低，但未達顯著。
圖 4-5 含植物性雌激素測試物經 oxLDL 處理對泡沫細胞形成之影響 Fig 4-5. Effects of chemicals and extracts on foam cell formation in
PMA-differentiated THP-1 macrophages incubated with oxLDL (50 µg/ml) for 48hrs.
THP-1 macrophages were pretreated with the test compounds for 2 hrs followed by oxLDL for 48 hrs. Cells were then stained with Oil-Red-O and then observed by phase-contrast microscopy (200X).
圖 4-6 含植物性雌激素測試物對 oxLDL 處理後對泡沫細胞生成之影響 Fig 4-6. Effects of chemicals and extracts on foam cell formation in
PMA-differentiated THP-1 macrophages incubated with oxLDL (50 µg/ml) for 48hrs.
THP-1 macrophages were pretreated with the test compounds for 2 hrs followed by oxLDL for 48 hrs. Cells were then stained with Oil-Red-O and lysed with isopropanol.
Values are means ± SD.
＊Significantly different from oxLDL treatment analyzed by student Mann Whitney U test at p＜.05
concentration
四、 含植物性雌激素測試物對 THP-1 macrophages 之 CD36 mRNA 表現的影響 經過共同培養 16 小時後，發現 genistein、茉莉甲醇萃物與菊花甲醇萃物皆能 顯著抑制 CD36 mRNA 表現，分別可抑制 30.4% (p=.05)，35.9% (p=.05)及 27.4%
(p=.05)。
經過共同培養 48 小時後，發現 enterolactone、sesamin 與 genistein 皆能顯著 抑制 CD36 mRNA 表現。Enterolactone 可抑制 29.2% (p=.05)，sesamin 可抑制 38.3%
(p=.05)，genistein 可抑制 52.2% (p=.05)。
圖 4-7 含植物性雌激素測試物對氧化型低密度脂蛋白刺激細胞後 CD36 mRNA 表 現之影響
Fig 4-7. Effects of chemicals and extracts on CD36 mRNA expression in
PMA-differentiated THP-1 macrophages incubated with oxLDL (50 µg/ml) for 16 and 48hrs. THP-1 macrophages were pretreated with the test compounds for 2 hrs followed by oxLDL for 16 and 48 hrs. Expression levels were adjusted by GAPDH mRNA levels and are represented relative to control, which is set as 100%. Values are means ± SD.
*Significantly different from oxLDL treatment analyzed by Mann Whitney U test at p <
0.05.
concentration
C D 3 6 e x p re s s io n ( % o f C )
三、含植物性雌激素測試物對 THP-1 macrophages 之 ABCA1 mRNA 表現的影響 在測試物與 oxLDL 共同培養 16 小時後，發現與 oxLDL 刺激組相較之下，
enterolactone、sesamin、genistein 與茉莉甲醇萃物會降低 ABC A1 mRNA (p=.05)。
但是培養 48 小時後，所有測試物對於 ABCA1 mRNA 表現量，與 oxLDL treatment 比較皆無顯著差異。
圖 4-8 含植物性雌激素測試物對氧化型低密度脂蛋白刺激細胞後 ABCA1 mRNA
圖 4-8 含植物性雌激素測試物對氧化型低密度脂蛋白刺激細胞後 ABCA1 mRNA