小 分 子 RNA（ small RNA ） 是 利 用 mirVana miRNA Isolation Kit
（Ambion, AM1560）萃取，分成以下三個部分。
3.3.1.1 細胞均質化
將細胞以 5 ml 的 PBS 沖洗，加入 1 ml TrypLETM Express，37 ℃ 反 應 5 分鐘。加入 3 ml 的 5 % FBS / MEM 輕輕沖散細胞置於 15 ml 離心 管，於 4 ℃ 以 1500 rpm 離心 5 分鐘。倒掉上清液，加入 1 ml PBS 洗 勻細胞，於 4 ℃ 以 1500 rpm 離心 5 分鐘，放至冰中。倒掉 PBS 上清 液，加入 600 μl 的 Lysis/Binding Solution，均勻懸浮使細胞均質化，將細 胞均質液換至新的微量離心管。
3.3.1.2 有機萃取
加入 1/10 倍體積 miRNA Homogenate Additive 與細胞均質液混合均 勻，靜置冰上 10 分鐘。加入 1 倍體積常溫 Acid-Phenol：Choroform，震 盪 30 ~ 60 秒。以 10,000 g 離心 5 分鐘，會出現上層水相液（aqueous phase）
及下層有機相液（organic phase），小心取上層液（aqueous phase），不要碰 到下層液，將上層液換至新微量離心管中。
3.3.1.3 小分子 RNA 萃取
加入 1/3 倍上層液（aqueous phase）體積的 100 % 酒精至微量離心管 混合均勻（例如：100 μl 的 100 % 酒精加至 300 μl 的吸取的上層液）。將 上層液/酒精混合物加入 column 中，以 10,000 g 離心 15 秒，收集過濾液 移至新微量離心管中。重複以 10,000 g 離心 15 秒一次，使上層液/酒精混
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3.3.2 北方墨點法（Northern Blotting）偵測小分子 RNA
一般偵測 mRNA 是利用含有 formaldehyde 的 1.5 % agarose gel，將
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X TBE、7.2072 g 的 Urea、75 μl 的 10 % APS（ammonium persulfate）、15 μl 的 TEMED，補 DEPC-treated H2O 至總體積為 15 ml，靜置膠凝固 1 小 時，以 4 ℃ 及 150 V 進行預跑 15 分鐘。將 DNA 與 1X Gel Loading Buffer II 混合均勻，於 95 ℃ 作用 4 分鐘，後放置於冰上。將樣品注入 膠孔中，用 0.5 X TBE buffer 在電泳槽中以 4 ℃ 及 150 V 進行電泳直到 bromophenol blue 電泳至凝膠最底部，取出膠體以 SYBR-Gold 染色 30 分 鐘，以 UV 光觀察膠上 RNA 片段。以 SYBR-Gold 染色的原因為敏感度 較 EtBr 高，可觀察到更小片段的 RNA。
3.3.2.2 轉漬 RNA
利用 wet transfer 將電泳後的凝膠以下圖方式排列，用 0.5 X TBE buffer 在轉漬槽中以 0 ℃，100 mA 電泳 3 小時。
3.3.2.3 雜交反應
將轉漬完的 Nylon membrane 下面墊一片 3M 濾紙，以 UV 254 nm 照射 membrane （有 RNA 那面朝上） 2 次，每次 2 分鐘。將 membrane 泡入 DIG Eazy Hy（pre-hybridization）於 42 ℃ 震盪（50 rpm） 2 小時。
將 100
M 的 Probe 於 95 ℃ 預熱 10 分鐘，後置於冰上 10 分鐘，以
0.5 l 的 100 M 的 Probe：1 ml 的 DIG Eazy Hy 比例混合均勻（最後濃 度約為 300 ng / ml 或 60 pmole / ml）。將 membrane 泡入含有 probe 的 DIG Eazy Hy，於 37 ~ 41 ℃（Oligonuclutide 的 Tm 值 - 15 ℃）震盪（50 rpm） 16 小時。配製 25 ml 的 2 X washing buffer（2.5 ml 20 X SSC; 500 μl34
10 % SDS; 22 ml DEPC-treated H2O），將 membrane 泡入 2 X washing buffer，
於室溫震盪（50 rpm） 5 分鐘，重複此步驟一次（清洗 2 次）。配製 25 ml 的 0.5 X washing buffer（625 μl 20 X SSC; 500 μl 10 % SDS; 23.875 ml DEPC-treated H2O），將 membrane 泡入 0.5 X washing buffer，於 37 ~ 41 ℃
（Oligonuclutide 的 Tm 值 - 15℃）震盪（50 rpm） 15 分鐘，重複此步驟 一次（清洗 2 次）。
3.3.2.4 免疫偵測
將 membrane 泡入 washing buffer，於室溫震盪（50 rpm） 15 分鐘，
重複此步驟一次（清洗 2 次）。配製 20 ml 的 1 X Blocking buffer（18 ml Maleic acid buffer; 2 ml 10 X Blocking buffer），將 membrane 放入 1 X Blocking buffer 中，於室溫震盪（50 rpm） 30 分鐘。配製 20 ml Antibody buffer（18 ml Maleic acid buffer; 2 ml 10 X Blocking buffer; 2 μl Antibody, Roche Anti-DIG-AP），將 membrane 放入 Antibody buffer 中，於室溫震盪
（50 rpm） 30 分鐘。將 membrane 泡入 washing buffer 中，於室溫震盪
（50 rpm） 15 分鐘，重複此步驟一次（清洗 2 次）。將 membrane 泡入 Detection buffer 中，於室溫震盪（50 rpm） 10 分鐘。將 membrane 放置 在投影片上（有 RNA 那面朝上），混合 10 μl 的 CSPD 和 990 μl 的 Detection buffer，加到 membrane 上，蓋上另一片投影片，推掉多餘緩衝液 和氣泡，以鋁鉑紙包好，於 37 ℃ 反應 20 分鐘。在暗房進行壓片，將底 片隔著投影片放置於 membrane 上，待感光適當時間後，將底片置於 Develop buffer 中使影像顯現，再以 Fix buffer 固定影像，以清水沖洗掉緩 衝液後，將底片陰乾永久保存。
35 處理過的線性 pSilencer 3.1-H1 neo siRNA Expression Vectorr 接合，建構出 一系列表現 shRNA 片段的 pSilencer shRNA Expression Vector（pSilencer- SiNS2A-1、pSilencer- SiNS2B-1、pSilencer-SiNS4A-1、pSilencer-SiNS4B-1），