建構 RNAi 表現質體用於抑制登革熱病毒 NS2 及 NS4

國立交通大學

生物科技學系

碩 士 論 文

建構 RNAi 表現質體用於抑制登革熱病毒 NS2 及

NS4

Construction of RNAi plasmids for targeting dengue

virus NS2 and NS4

研 究 生：林重延

指導教授：楊昀良 博士

建構 RNAi 表現質體用於抑制登革熱病毒 NS2 及

NS4

Construction of RNAi plasmids for targeting dengue

virus NS2 and NS4

研 究 生：林重延 Student：Chong-Yan Lin

指導教授：楊昀良 博士 Advisor：Dr. Yun-Liang Yang

國 立 交 通 大 學

生物科學系

碩 士 論 文

A Thesis

Submitted to Institute of Biological Science and Technology

National Chiao Tung University

in partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of Master

in

Biological Science and Technology

September 2011

Hsinchu, Taiwan, Republic of China

i

建構 RNAi 表現質體用於抑制登革熱病毒 NS2 及 NS4

研究生：林重延 指導老師：楊昀良 博士 國立交通大學生物科技學系

中文摘要

登革熱是由蚊子傳播的疾病，主要分布在熱帶與亞熱帶地區。全球大 約有 25 億人口生活在病毒傳播疫區，超過 100 個國家有爆發過登革熱。 因此，對於登革熱的治療與預防成為目前的重要議題。登革熱屬於黃質病 毒科。其病毒基因是由全長 10.7kb 的單股正形 RNA 組成。病毒 RNA 利 用單一開放式讀架（open reading fragment）轉譯出三個結構蛋白（C, prM and E）及七個非結構蛋白（NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5）。除了 NS2B/NS3 （protease）與 NS5 （RNA-dependent RNA polymerases; RdRp） 的酵素功能較明確，其他病毒蛋白在病毒複製與致病機制中扮演的角色則 不是非常明確。最近一些研究，推測 NS2A、NS2B、NS4A 及 NS4B 可能 與參與病毒複製及造成感染後細胞膜重組有關。為了解這四個病毒基因在 病毒複製過程中的功能，本研究嘗詴用 RNA 干擾（RNA interference, RNAi） 的方式降低調控病毒複製。在本研究中利用六個 siRNA 設計帄台軟體針對 病毒基因預測具有潛力的 siRNAs（small interfering RNAs），取其交集的 結果，建構表現 siRNA 的質體並在 BHK-21 細胞中（baby hamster kidney cell）測詴對於病毒複製的影響。在空斑詴驗中，短暫性表現 siRNA 的細 胞與穩定表現 siRNA 的細胞株皆沒有看到顯著降低複製的結果，表示利用 綜合多個設計帄台軟體預測出的 siRNA 無法有效地沉默病毒的複製。

ii

Construction of RNAi plasmids for targeting dengue virus NS2

and NS4

Student : Chong-Yan Lin Advisor : Yun-Liang Yang Department of Biological Science and Technology

National Chiao Tung University

Abstract

Dengue viral infection is a mosquito-borne viral disease in the tropical and subtropical regions. Globally, 2.5 billion people live in over 100 endemic countries and areas where dengue viruses can be transmitted; therefore, the treatments and prevention to the disease become a imperative issue. Dengue virus is a member of the Flaviviridae family. The viral genome consists of a single-stranded, positive-sense RNA of 10.7 kb. The viral RNA encodes three structural proteins (C, prM and E) and seven non-structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) in a single open-reading-frame. Except for enzymic activities contained within NS2B/NS3 (protease) and NS5 (RNA- dependent RNA polymerases; RdRp), the exact roles of the those proteins in virus replication and pathogenesis are not well defined. In recent studies, NS2A, NS2B, NS4A and NS4B are implicated in assisting viral RNA replication and inducing membrane alteration. In order to understand the functions of those four viral genes in the viral replication, I attempted to down regulate the replication of Dengue virus by the use of RNA interference (RNAi). In this study, I targeted those four viral genes with small interfering RNAs (siRNAs) selected by six siRNA design tools. The plasmids that expressed those siRNAs were constructed and tested in BHK-21 cel (baby hamster kidney cell) to determine the effect on dengue viral replication. According to the results of the plaque assays, there was no significant reduction of viral replication in the cells either transiently or stably expressing the siRNAs. This suggested that the siRNAs designed through combination of those siRNA design tools did not effectively silence the viral replication.

iii

致謝

碩士的日子過去了，感謝所有幫助過的人。首先感謝指導教授楊昀良老師，印象最 深是剛進實驗室時遇到設計實驗的難題，整晚出勉強的解決之道，隔天與老師討論後， 小楊老師居然瞬間解決而且還改良了方法，當時覺得老師真厲害！。小楊老師總是不辭 辛勞悉心教導，要求清晰表達及重視邏輯思考，使我學到如何處理問題，在碩士的日子 裡成長許多。老師，謝謝您！另外，感謝黃兆祺老師及冷治湘老師擔任口詴委員，不吝 指導指論文不足之處，與老師們討論交談後獲益良多。謝謝老師們！ 碩士的日子，感謝學長姐、同學、學弟妹們共同砥礪，因為你們讓研究生活變得絢 麗多彩。感謝幫我送定序的惠菁學姐、做實驗超嚴謹的秀拔拔、從沒請我吃過提拉米蘇 的提拉敏書學長、帥倒掉渣的酷哥學長、嫻靜溫柔的淑禎學姐、燈塔女王兼烏魚子看板 娘的淑萍學姐、帶我入門細胞實驗，個性活潑的阿毛學姐、講話精闢卻熱人整理 protocol 給我的馨儀學姐、看起來很酷其實個性很單純的小倩學姐，感謝教我 PCR 基本知識、 一整霸氣護體的大姐大的佳禎學姐，感謝學長姐們指出研究中的缺失，在迷惘時為我解 惑。另外，也感謝我的同學們，小楊家自稱最多項目”一姐”的優比、超易中韓國洗腻歌 的毒，帶起 LAB 流行舞步的阿大，成為碩士生涯中最佳的夥伴。還有在 LAB 留下拖鞋 當作足跡的愛喵同士助理蔡金吳。新一代 LAB 管家兼水電工的阿賢、高級美食 guidline 及外務公關的凱薩、LAB 電腻工程技師兼論文寫程式順利的春榮、三不五時實驗做一做 會人來瘋「阿~~~」的幸璇、也幫我送定序兼好市多卡長及”很小隻”善人的小善、寵物 鼠小啾的媽阿白、常幫我代領早餐兼受我的搞怪荼毒的小氣，有學弟妹們的幫忙及搞笑 銘感在心。最後還有細胞室新人的游青、個性乖直的克威、台南鄉民的昇樺、做事要求 完美的子喬，學弟妹們為 LAB 注入新血，加油！ 還有貓女兒林媚妹總是在背後努力用睡覺支持我，在我累的時候給我來個提神一抓。 最後，謹以此文獻給我摯愛的家人、爸爸、媽媽跟妹妹，人力物力的支持，感謝他們的 關心與鼓勵。

iv

目錄

中文摘要………... i 英文摘要………... ii 誌謝………. iii 目錄………. iv 表目錄………... viii 圖目錄………. ix 附錄目錄……….. x 縮寫表………... xi 壹、緒論………1 1.1 登革熱概論……….. 1 1.2 登革熱的臨床病徵……….. 2 1.3 登革熱病毒分子生物學背景……….. 2 1.4 日本腻炎與日本腻炎病毒概論……….. 5

1.5 RNA 干擾（RNA interference, RNAi）概論……… 6

1.6 RNAi 作用機制……….. 7

1.7 RNAi 在哺乳細胞表現系統……….. 8

1.8 shRNA Expressing Vector 設計……….. 9

1.9 學生 t-檢定（Student's t-test）與變異數分析（Analysis of variance, ANOVA）之統計分析介紹……… 10 1.10 Flavivirus 相關之 RNAi 研究……….... 11 1.11 實驗目的與設計……… 12 貮、材料……….. 13 2.1 菌株……… 13 2.2 細胞株……… 13

v 2.3 病毒……… 13 2.4 質體……… 14 2.5 引子（Primer）………. 15 2.6 藥品詴劑……… 16 2.7 詴劑組……… 19 2.8 溶劑、緩衝溶液及培養基……….. 20 2.9 儀器設備……… 21 參、方法……….. 23 3.1 質體建構……… 23 3.1.1 大腸桿菌勝任細胞的製備………. 23 3.1.2 大腸桿菌勝任細胞的轉形………. 23 3.1.3 小量質體 DNA 萃取………. 23 3.1.4 限制酶反應………. 24 3.1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳………. 24 3.1.6 萃取聚丙烯酰胺凝膠內之小片段 DNA………... 25

3.1.7 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）……….. 26

3.1.8 PCR 產物純化……… 26 3.1.9 去磷酸反應………. 26 3.1.10 接合反應（Ligation）………. 27 3.2 細胞實驗……… 27 3.2.1 BH K-21 細胞繼代培養……… 27 3.2.2 C6/36 細胞繼代培養……….…..….………. 27 3.2.3 登革熱病毒的增殖………. 28 3.2.4 日本腻炎病毒的增殖………. 28 3.2.5 BHK-21 細胞轉染………. 29

vi

3.2.6 BHK-21 穩定細胞株選殖………. 29

3.2.7 空斑詴驗（短暫性質體轉染細胞組）………. 30

3.2.8 空斑詴驗（穩定細胞株組）………. 30

3.3 小分子 RNA（small RNA）檢測………. 31

3.3.1 小分子 RNA（small RNA）的萃取………. 31

3.3.1.1 細胞均質化……….. 31

3.3.1.2 有機萃取……….. 31

3.3.1.3 小分子 RNA 萃取……….. 31

3.3.2 北方墨點法（Northern Blotting）偵測小分子 RNA……….. 32

3.3.2.1 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳……….. 32 3.3.2.2 轉漬 RNA………... 33 3.3.2.3 雜交反應……….. 33 3.3.2.4 免疫偵測……….. 34 肆、結果……….. 35 4.1 pSilencer 系列質體建構與定序分析………... 35 4.2 pDsRed-pS. 系列質體建構與定序分析………... 35 4.3 BHK-21 經 pDsRed-pS. 系列質體短暫性轉染後之空斑詴驗測詴…. 36 4.4 表現 pDsRed-pS. 系列質體 BHK-21 穩定株細胞之挑選…………... 38 4.5 表現 pDsRed-pS. 系列質體 BHK-21 穩定株細胞之空斑詴驗測詴... 38 4.6 表現 pDsRed-pS. 系列質體 BHK-21 穩定株細胞之北方墨點檢測小片 段 RNA 之表現……… 40 伍、討論……….. 42 5.1 DV2 基因體、JEV 基因體的分析………... 42 5.2 質體短暫性轉染與穩定株細胞之空斑詴驗的分析……… 42 5.3 小分子 RNA 之偵測分析……… 44

vii

陸、結論……….. 46 柒、參考文獻……….. 47

viii

表目錄

表一、DV2 PL046 與 JEV RP9 的 NS2A、NS2B、NS4A、NS4B 之核苷

酸相同率……… 52

表二、shRNA Expression Vector 上 shRNA 片段的設計帄台軟體及設計 siRNA 之結果………... 53 表三、登革熱病毒（DV2）全長基因體以及在目標基因上設計 siRNA 的位 置………... 54 表四、日本腻炎（JEV）全長基因體示圖……… 55 表五、日本腻炎（JEV）全長基因體與針對登革熱病毒（DV2）全長基因體 設計之 siRNA 之序列比對圖………. 56 表六、pSilencer-SiNS2A-1 定序結果………... 57 表七、pSilencer-SiNS2B-1 定序結果………... 58 表八、pSilencer-SiNS4A-1 定序結果………... 59 表九、pSilencer-SiNS4B-1 定序結果………... 60 表十、pDsRed-pS.-siNC 定序結果………... 61 表十一、pDsRed-pS.-SiNS2A-1 定序結果………... 62 表十二、pDsRed-pS.-SiNS2B-1 定序結果………... 63 表十三、pDsRed-pS.-SiNS4A-1 定序結果………... 64 表十四、pDsRed-pS.-SiNS4B-1 定序結果………... 65 表十五、pDsRed-pS. 系列質體 BHK-21 穩定株細胞株列單………... 66

ix

圖目錄

圖一、pUC57-X13337G 質體圖………... 67 圖二、pSilencer shRNA Expression Vector 質體建構流程圖……… 68 圖三、pSilencer shRNA Expression Vector 質體結構及酵素位置圖………… 69 圖四、pDsRed - shRNA Expression Vector 質體建構流程圖………70 圖五、pDsRed - shRNA Expression Vector 質體結構及酵素位置圖………... 71 圖六、pDsRed - shRNA Expression Vector 經 Nde I 與 Hind III 限制酶作用 後切電泳分析圖……….... 73 圖七、BHK-21 對於 G418（Geneticin）不同濃度之細胞毒性………... 74 圖八、BHK-21 經 pDsRed-pS. 系列質體短暫性轉染後細胞螢光與可見光圖 及空斑圖……… 75 圖九、BHK-21 經 pDsRed-pS. 系列質體短暫性轉染後之空斑詴驗……... 77 圖十、pDsRed-pS. 系列質體 BHK-21 穩定株細胞株培養於含 G418 的 5% FBS / MEM 之細胞觀察圖……... 78 圖十一、表現 pDsRed-pS. 系列質體 BHK-21 穩定株細胞之空斑圖……. 83 圖十二、表現 pDsRed-pS. 系列質體 BHK-21 穩定株細胞之空斑詴驗…. 84 圖十三、表現 pDsRed-pS. 系列質體 BHK-21 穩定株細胞之北方墨點檢測 小分子 RNA 之表現 - 偵測 siNC 小分子 RNA……… 86 圖十四、表現 pDsRed-pS. 系列質體 BHK-21 穩定株細胞之北方墨點檢測 小分子 RNA 之表現 - 偵測 siNS2A 小分子 RNA……… 87 圖十五、表現 pDsRed-pS. 系列質體 BHK-21 穩定株細胞之北方墨點檢測 小分子 RNA 之表現 - 偵測 siNS4A 小分子 RNA……… 88 圖十六、表現 pDsRed-pS. 系列質體 BHK-21 穩定株細胞之北方墨點檢測 小分子 RNA 之表現 - 偵測 siNC 小分子 RNA（Size marker: DNA primer- DIG, pS-shNCPB 注入膠孔洞量減半）………... 89

x

附錄目錄

附錄一、登革熱疫情分布圖……….. 90 附錄二、台灣早期登革熱流行情形……….. 90 附錄三、1987 年至 2007 年台灣登革熱確定病例數... 91 附錄四、2007 年至 2011 年 7 月台灣登革熱確定病例數……….. 91 附錄五、登革熱病毒全長基因體與聚蛋白示意圖……….. 92 附錄六、1970 年至 1998年日本腻炎疫情分布圖……….. 93 附錄七、1998 年至 2007 年台灣日本腻炎確定病例數……… 93 附錄八、2007 年至 2011 年 8 月台灣日本腻炎確定病例數……….. 94

附錄九、小干擾 RNA（Small interfering RNA, siRNA）結構圖………. 95

附錄十、RNA 干擾（RNA interference, RNAi）機制路徑圖………... 95

附錄十一、生物體開啟 siRNA pathway 的方法……….. 96

附錄十二、shRNA Expression Vector 上 shRNA 片段之設計……….. 97

附錄十三、DIG 北方墨點免疫偵測的原理………... 97

附錄十四、Locked nucleic acid（LNA）的結構圖………. 98

附錄十五、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide（EDC）的結構 圖……… 98

xi

縮寫表

縮寫 全名

2’, 5’-AS 2’, 5’-oligoadenylate synthetase

AGO2 Argonaute 2

AP Alkaline phosphatase

APS Ammonium Persulfate

BHK-21 Baby hamster kindey cell

BSA Bovine serum albumin

C protein Capsid protein

CAT Chloramphenicol acetyl transferase CDC, Taiwan Center for Disease Control, Taiwan

CDC, USA Centers for Disease Control and Prevention, USA

CHS chalcone synthase

CMV Cytomegalovirus

CSPD Chloro-5-substituted adamantyl-1,2-dioxetane phosphate

CPE Cytopathic effect

DC-SIG Dendritic-cell-specific ICAM3-grabbing non-integrin

DEPC Diethyl pyrocarbonate

DF Dengue fever

DHF Dengue hemorrhagic fever

DIG Digoxigenin

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

dsRNA Double strand RNA

DSS Dengue shock syndrome

DV Dengue virus

E protein Envelope protein E. coli Escherichia coli

EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide EDTA Ethylenedinitrilotetraacetic acid

eIF eukaryotic Initiation Factor

EM Immunoelectron microscopy

ER Endoplasmic reticulum

EtBr Ethidium bromide

xii

縮寫 全名

IFM Confocal immunofluorescence microscopy

IFN Interferon

ISRE IFN-stimulated response element JEV Japanese encephalitis virus

KUNV Kunjin virus

LB agar Luria-Bertni agar LB broth Luria-Bertni broth

LNA Locked nucleic acid

MEM Minimun Essential Medium

miRNA Micro RNA

MOI Multiplicity of infection

MOPS 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid

MTase Methyltransferase

HA Hemagglutinin tag

NS protein Non-structural protein NTpase Nucleoside triphosphatase

ORF Open reading frame

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PBS Phosphate buffered saline

PCR Polymerase chain reaction

PFU Plaque-forming unit

PKR dsRNA-dependent protein kinase

pre-miRNA Precursor miRNA

pri-miRNA Primary microRNA transcript prM protein Precursor membrane protein

PTGS Post- transcriptional gene silencing

RdRp RNA-dependent RNA polymerase

RISC RNA-inducing silencing complex

RNA Ribonucleic acid

RNAi RNA interference

RNase P Ribonuclease P

SAP Shrimp Alkaline Phosphatase

SDS Sodium dodecyl sulfate

shRNA Small hairpin RNA

xiii

縮寫 全名

SSC Saline-sodium citrate

ssRNA Single strand RNA

TAE Tris-acetate-EDTA

TBE Tris-Borate-EDTA

TEMED N, N, N’, N’,-tetramethylenediamine

TGN Trans Golgi network

Tris Tris(Hydroxymethyl) aminomethane

UTR Untranslated region

WHO World Health Organization

WNV West Nile virus

1

壹、緒論

1.1 登革熱概論

登革熱是感染登革熱病毒（dengue virus, DV）所引起的傳染病。研究 顯示，藉由埃及斑蚊（Aedes aegypti）與白線斑蚊（Aedes albopictus）進行 傳播，一般認為以人與病媒蚊間的傳播循環做為傳染途徑，傳播範圍主要 為熱帶與亞熱帶地區，包括亞洲、非洲、中南美洲與大洋洲（見附錄一）， 流行季節為每年 8 ~ 12 月。全球大約有 25 億人口生活在病毒傳播疫區，

超過 100 個國家有爆發過登革熱（World Health Organization, WHO）。根據

世界衛生組織（WHO）全世界每年高達 5000 萬的感染登革熱案例數，其 中有 50 萬為登革出血熱（Dengue hemorrhagic fever, DHF）病例，2.2 萬 為死亡病例。

據我國衛生署疾病管制局（Center for Disease Control, Taiwan；CDC, Taiwan）發布，登革熱分列第二類傳染病。於 1870 年起陸續有登革熱病 例報告，於 1945 年為止，曾發生三次全島性登革熱大流行（1915、1931、 1942 年），後於民國 40 年代的瘧疾防治時期大量撲殺病媒蚊，降低了登 革熱的傳播。直到 1981 年在屏東縣琉球鄉爆發第二型登革熱疫情，當時全 鄉約 80 % 的居民感染登革病毒（見附錄二，Wu, 1986）。據 CDC, Taiwan 於 1987 至 2007 年登革熱確定病例數及 2007 至 2010 年登革熱確定病 例數資料顯示，在 1988 與 2002 年又爆發大規模感染；2007 至 2010 年 確定病例數的年帄均為 1460.25 例，於 2008 年後有逐年增加的趨勢（見 附錄三、四）。

2

1.2 登革熱的臨床病徵

在臨床上，登革熱病毒依血清抗原性不同主要分為四個血清型（serotype：

DV1, DV2, DV3, DV4）。當登革病毒隨病媒蚊唾液進入人體（潛伏期約 3 ~

14 天，帄均為 4 ~ 7 天，Kao et al., 2005），後會出現病毒血症（viremia）

並破壞組織。臨床症狀可分為無症狀（asymptomatic），或依嚴重程度區分

為：登革熱（dengue fever, DF）、登革出血熱（dengue hemorrhagic fever, DHF）

及登革熱休克症候群（dengue shock syndrome, DSS）。

登革熱（DF）一般出現症狀有：發燒、頭痛、眼窩痛、肌肉關節痛、 皮膚紅疹、白血球減少（leucopenia）等病徵（Nimmannitya, 1987），症狀發 生後 3 ~ 7 天可自然痊癒。登革出血熱（DHF）早期出現的發燒症狀與 DF 類似，但由於血管內皮系統受到病毒感染之影響，造成血管通透性（capillary permeability）增加出現血漿滲出（plasma leakage）的現象。臨床上會併發 水腫、血小板過低（thrombocytopenia，血小板濃度 ≦ 100,000 / mm3）、紅 血球濃縮（hemoconcentration）、胸腔液滲出（pleural effusion）及產生腹水 等現象（Kalayanarooj et al., 1997），其中血小板過低（thrombocytopenia）

是造成出血現象的原因（Huang, 2000）。當血漿滲出過多時，病患會出現皮 膚濕冷、四肢冰涼、脈搏壓微弱（脈搏壓 ≦ 20 mmHg），進一步出現休克 現象，即登革熱休克症候群（DSS, Kalayanarooj et al., 1997）。若無及時給 予適當輸液治療，死亡率可達到 10 ~ 15 %（Gubler, 2002）。 1.3 登革熱病毒分子生物學背景 登革熱病毒屬於黃質病毒科（Flaviviridea）黃質病毒屬（Flavivirus），

同屬病毒有：日本腻炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、西尼羅病毒

（West Nile virus, WNV）、黃熱病毒（Yellow fever virus, YFV）、Kunjin virus （KUNV）…等超過七十種病毒（Lindenbach et al., 2007）。

3

登革熱病毒基因體（見附錄五，Perera et al., 2008）為單股、正形 （single-stranded, positive-sense）的 RNA 病毒，全長約為 10.8 kb，5’ 端

含有 Cap 結構，3’ 端則缺乏 poly(A) 序列（Wengler et al., 1978），僅具一

開放式讀架（open- reading-frame, ORF）。複製時，先轉譯出一個聚合蛋白 （polyprotein），後由病毒與宿主的蛋白酶切割成三個結構蛋白（structural protein），分別為衣殼蛋白（capsid protein, C）、前驅膜蛋白（precursor membrane protein, prM）與外膜蛋白（envelope protein, E）及七個非結構蛋 白（non-structural protein）包括 NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、 NS5（Lindenbach et al., 2007; Perera et al., 2008）。

結構蛋白方面，E protein 會與宿主細胞表面的受器結合（如：dendritic- cell-specific ICAM3-grabbing non-integrin, DC-SIG; Pokidysheva et al., 2006）； prM protein 在病毒 顆粒 由內 質網經由 反面 高基 網狀系統 （ trans Golgi network, TGN）釋出宿主細胞外時， prM-E 蛋白會切割成 M-E，幫助 E

protein 在病毒顆粒表面結構更為穩定（Perera et al., 2008）。

在非結構蛋白方面，NS1 為分泌型蛋白（secrted protein），在病毒早期

複製時被認為扮演重要角色（Lindenbach et al., 1999），而且可抑制補體的 活化（Chung et al., 2006）；NS2B 為 NS3 protease 的 co-factor，幫助 DV polyprotein 在 NS1/NS2A、NS2A/2B、NS2A/NS3、NS3/NS4A、NS4B/NS5

等處切割（Falgout et al., 1991）；NS3 為多功能性蛋白，具有 serine protease、

RNA helicase、nucleoside triphosphatase（NTpase）（Gorbalenya et al., 1989; Wengler et al., 1991）之特性；NS5 為雙功能蛋白，具有 methyltransferase, MTase、RNA-dependent RNA polymerase（RdRp）（Egloff et al., 2002; Yap et al., 2007）之特性，另外，RdRp 的演化相關性也是黃質病科（Flaviviridea） 分類的依據（Lindenbach et al., 2007）。

4

至於 DV 在 NS2A、NS4A、NS4B 有一些研究推測可能的功能。於 2003 年 Muñoz-Jordan 團隊建構表現 DV 蛋白的質體（C-HA、prM-HA、 E-HA、NS1-HA、NS2A-HA、NS2B-HA、NS3-HA、NS4A-HA、NS4B-HA、

NS5-HA；HA 為 Hemagglutinin tag），利用綠猿腎臟癌細胞（Vero cell）將

表現 DV 蛋白的質體及 ISRE-CAT 的質體（ISRE, IFN-stimulated response element；CAT, chloramphenicol acetyl transferase）共轉染（co-transfection），

外加 IFN-（interferon-）觀察，經由 IFN- 誘發 ISRE 下游 CAT 表現

量，由結果顯示，當轉染細胞表現 NS2A、NS4A 或 NS4B 病毒蛋白時， 會使 CAT 表現量下降（分別抑制 51.5 %、38.5 %、74.5 %）；另外，若細 胞同時表現 NS2A、NS4A、NS4B 三種病毒蛋白時，會抑制 CAT 達 92.5 %。推測 NS2A、NS4A、NS4B 可能影響 IFN 與 ISRE 的作用，抑制細 胞的 IFN 訊號傳遞（IFN signal transduction）（Muñoz-Jordan et al., 2003）。 在 NS4A 方面，於 2007 年 Miller 團隊利用共軛 焦免疫螢光 顯微鏡 （confocal immunofluorescence microscopy, IFM）觀察受 DV 感染的人類肝

癌細胞（Huh7 cell），發現內質網（endoplasmic reticulum, ER）會變成 dot-like

structure；另外，發現 NS4A protein、dsRNA（viral RNA）及 E protein 與 ER 的 dot-like structure 有 co-localization，推測 NS4A 可能是病毒複製複 合物（replication complex）的一部分，而且 dot-like structure 可能是因為感 染 後 發 生 膜 重 排 （ membrane alteration ）； 此 外 ， Miller 團 隊 還 建 構 NS4A-eGFP 質體及剔除 NS4A 的 2K 片段的 NS4A(-2K)-eGFP 質體去 轉染 Huh7 cell，利用 IFM 及免疫電子顯微鏡（immunoelectron microscopy, EM）觀察。在 IFM 的結果顯示，表現 NS4A(-2K)-eGFP 的細胞在 ER 會 出 現 與 受 DV 感 染 的 細 胞 一 樣 的 dot-like structure ， 而 且 細 胞 內 的 NS4A(-2K)-eGFP 蛋白也與 ER 的 dot-like structure 有 co-localization；在 EM 部分，表現 NS4A(-2K)-eGFP 的細胞會出現細胞內膜積聚（intracellular

5

membrane accumulation），表示當 NS4A 在細胞內經過蛋白酶修飾切割掉

2K 片段會造成 ER 形成 dot-like structure，綜合 Miller 團隊的結果，推測 DV 的 NS4A 蛋白的 C 端的 2K 片段與調節 membrane alteration 有關 （Miller et al., 2007）。在 NS4B 方面，於 2006 年 Umareddy 團隊利用酵 母菌雙雜交分析（yeast two-hybrid assay）、pull-down assay、免疫沉澱分析 （immunoprecipitation assay）發現 NS4B 與 NS3 會互相作用，在免疫螢

光偵測（immunofluoescence）也發現受 DV 感染的細胞內 NS4B 與 NS3 有

co-localization，推測 NS4B 可能會透過與 NS3 作用而協助病毒複製；另 外，以不同的 NS4B：NS3 比例進行 EMSA（Electrophoretic mobility shift

assay）發現當 NS4B：NS3 比值 ≧ 2 可以看到病毒 RNA 條帶（band），

推測 NS4B 可能是形成 2 個以上的 oligomer 去協助病毒 RNA 從 NS3 脫離（Umareddy et al., 2006）。

1.4 日本腻炎與日本腻炎病毒概論

日本腻炎是感染日本腻炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）所引 起的傳染病。在台灣傳播之病媒蚊為三斑家蚊（Culex tritaeniorhynchus）、 環紋家蚊（Culex annulus）。一般認為豬隻與鳥類為日本腻炎病毒的增幅宿 主，帶有病毒的病媒蚊再經叮咬傳染給人。傳播範圍主要為北起西伯利亞、 日本、台灣、菲律賓、馬來西亞、印尼、斯里蘭卡和澳洲北部…等（見附 錄六），流行季節為每年 5 ~ 10 月。根據我國疾病管制局（CDC, Taiwan） 發布，分列第三類傳染病。自 1968 年台灣開始全面接種疫苗，臺灣日本 腻炎疫情控制良好。據 CDC, Taiwan 於 1998 至 2007 年日本腻炎病毒確 定病例數及 2007 至 2010 年日本腻炎病毒確定病例數資料顯示，從 1998 至 2010 年，臺灣確定病例數的年帄均為 25.1 例（見附錄七、八）。 JEV 的感染大部分為無症狀感染，部分病患的血液病毒含量很高，會

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發展為發燒、頭痛、無菌性腻膜炎，嚴重者會出現頭痛、高燒、腻膜刺激、 昏迷、痙攣等症狀，最後導致精神、神經性後遺症或死亡（CDC, Taiwan）。

JEV 與 DV 同屬於黃質病毒科（Flaviviridea）黃質病毒屬（Flavivirus），

為單股、正形（single-stranded, positive-sense）的 RNA 病毒，僅具一開放 式讀架（open- reading-frame, ORF）。此 ORF 會轉譯出一個聚合蛋白

（polyprotein），經蛋白酶切割成三個結構蛋白（structural protein），分別為

C、prM、E，及七個非結構蛋白（non-structural protein）包括 NS1、NS2A、

NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5（見表四）。JEV 感染模式與 DV 相似，

皆藉由 E protein 構形變化促使病毒與細胞的融合（Lindenbach et al., 2007）。 在分子生物背景層面，JEV 與 DV 有許多相似處，但在核苷酸序列上 JEV

與 DV 的 NS2A、NS2B、NS4A、NS4B 並不相似（見表一），因此在本研

究中作為對照組。

1.5 RNA 干擾（RNA interference, RNAi）概論

RNA 干擾現象（RNA interference, RNAi）最早源於 1990 年植物學家 所發現，當時為增加牽牛花鮮豔度而送入 chalcone synthase（CHS）基因使

其過度表達（overexpression），卻出現預期之外的白色牽牛花，這種造成牽

牛花本身基因（endogenous gene）與轉殖基因（transgene）皆失去功能的現 象，稱為共同抑制作用（co-supreession），認為是某種轉錄後的抑制作用 （post-transcriptional gene silencing, PTGS）造成基因抑制的結果（Napoli et al., 1990）。到了 1998 年在線蟲（C. elegans）中發現雙股 RNA 分子會影 響基因表達，將純化的長鏈雙股 RNA 注射線蟲內能夠高效率及專一性阻斷 相應基因的表達，此時此現象被正式稱為 RNA 干擾（RNA interference,

RNAi）（Fire et al., 1998）。隨後，在植物、錐蟲（Trypanosomes）、果蠅

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et al., 2001）。而哺乳動物則與較為低等生物中的 RNAi 機制有所不同，其

原因是當長鏈雙股 RNA（dsRNA > 30 bp）進入大多數的哺乳動物後，會啟 動序列非專一性的干擾素反應（sequence-nonspecific interferon response）

（Stark et al., 1998）。在干擾素反應中會活化雙股 RNA 依賴型蛋白質激酶

（dsRNA-dependent protein kinase, PKR）及 2’, 5’- 寡腺苷酸合成酶（2’, 5’-oligoadenylate synthetase, 2’, 5’-AS）（Stark et al., 1998）。活化的 PKR 會 將真核起始因子 2 （eukaryotic Initiation Factor 2 , eIF2）磷酸化而抑制

mRNA 轉譯反應（Manche et al., 1992）；活化的 2’, 5’-AS 會活化 RNAse L

而造成細胞內的 mRNA 降解（Minks et al., 1979）。之前研究指出，在線蟲

與 果 蠅 中 送 入 長 鏈 的 dsRNA 會 被 切 割 成 小 分 子 干 擾 RNA （ small interfering RNA, siRNA）而導致 RNAi 發生，因此，於 2001 年 Elbashir 團 隊首次成功利用 siRNA 方式送入哺乳動物細胞，以專一序列有效誘發哺乳 動物細胞內的 RNAi 作用（Elbashir et al., 2001 a）。

1.6 RNAi 作用機制

RNAi 機制主要分為兩個路徑：siRNA pathway（small interfering RNA） 與 miRNA pathway（micro RNA）。差別在於起源的 RNA 不太相同（見附 錄十，de Fougerolles et al., 2007）。

對於外源 RNA 或是病毒感染會以 siRNA pathway 誘發 RNAi。在 siRNA pathway，首先由屬於 RNase II 家族的 Dicer 將長片段雙股 RNA （double-strand RNA, dsRNA）切割成約 21 ~ 25 個核苷酸大小的小分子干

擾 RNA（small interfering RNA, siRNA），此小片段雙股 siRNA 的 5’ 端帶

有一個磷酸團基，而 3’ 端會突出兩個核苷酸（見附錄九，Dykxhoorn et al.,

2003）。接著 siRNA 會與 Argonaute 2（AGO2, 由 EIF2C2 基因所轉譯）

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此時 AGO2-RISC 會將雙股 siRNA 的正股端（sense strand）切除，然後有 反股（anti-sense strand） siRNA 的 AGO2-RISC 會與目標 mRNA 上互補 區的鹼基序列配對黏合，由 AGO2 催化在 anti-sense strand siRNA 的 5’ 端數來第十與十一個核苷酸位置上切割 mRNA，造成直接性 mRNA 切割 （direct mRNA cleavage）。

另外一個是內源性路徑，稱為 miRNA pathway，此路徑 RNA 先在細 胞 核 中 經 由 RNA pol II 轉 錄 出 具 有 髮 夾 結 構 （ hairpin structure 或 stem-loop structure）的 RNA 產物，稱為起始微 RNA 轉錄物（primary microRNA transcript, pri-miRNA），而 pri-miRNA 在細胞核中經由 Dorsha 修飾成 miRNA 前驅物（precursor miRNA, pre-miRNA），pre-miRNA 再經 由 Exportin 5 運輸至細胞質中，隨後 pre-miRNA 與 Dicer 結合修飾並引 導與 AGO2-RISC 結合，pre-miRNA 會經由活化的 RISC 將雙股 miRNA

解旋（unwinding）（需要 ATP，Dykxhoorn et al., 2003），有反股（anti-sense

strand） miRNA 的 AGO2-RISC 會與目標 mRNA 上鹼基序列互補區位 （通常位在 3’ UTR, 3’ untranslated region）配對黏合，造成轉譯抑制 （Translational repression）或是 mRNA 降解（mRNA degradation）。

1.7 RNAi 在哺乳細胞表現系統

一般開啟生物的外源性 RNAi 路徑（siRNA pathway）方式有三種：（1）

利用長鏈雙股 RNA；（2）直接外送 siRNA；（3）送入會表現 siRNA 的載

體（siRNA expression vector）（見附錄十一）。若研究對象不是哺乳動物細 胞，可以利用方法（1）直接用長鏈雙股 RNA 送入誘導 RNAi 機制；因 為當長鏈雙股 RNA（dsRNA > 30 bp）進入哺乳動物細胞後，會啟動干擾素 反應（interferon response）（Stark et al., 1998）。

9

因此，哺乳細胞系統可利用直接將 siRNA 送入細胞內的方式，以化學 合成出 siRNA，優點為方便性可得直接得到高純度的 siRNA，但合成花費

昂貴；或者利用體外轉錄（In vitro transcription），成本低於化學合成法，但

需要經管柱純化。外送 siRNA 的缺點為基因沉默時效較短，大約 3 ~ 7 天 （Wu et al., 2010），無法在細胞中做長效 RNAi 抑制。

第 3 種方式是利用表現 siRNA 的載體（siRNA expression vector，如：

DNA 質 體 、 病 毒 載 體 … ） 來 表 現 siRNA ， 其優點為：質體可大量製備、RNAi 抑制時效較長、可用於建立表現 siRNA

的穩定細胞株、可經由質體上的報導基因（reporter gene）得知轉染效率、 遇到轉染效率偏低的細胞株可改用病毒載體增加轉染效率。相較之下，利 用 siRNA expression vector 的系統在細胞中以內生性的方式可較穩定與持 續轉譯出 siRNA 以誘發 RNAi 的發生。

1.8 shRNA Expressing Vector 設計

本研究是利用 pSilencer shRNA Expressing Vector（Ambion, Inc）於細

胞中表現出 shRNA（small hairpin RNA），經由細胞內的 siRNA pathway 切

割修飾成 siRNA（見附錄十一）。以 shRNA 質體方式表現 siRNA 時，正

股與反股之間會需要 loop（UUCAAGAGA）（見附錄十二）。

siRNA 序列設計目前沒有一定的準則，經由 Ambion 指引介紹與文獻 歸納出幾點設計方法：於目標 mRNA 的開放式讀架（Open-reading- frame,

ORF）中找尋連續 “AA” 序列及往後 19 個鹼基序列（AA(N)19）總長為 21

nt 作為 siRNA 的目標序列（見附錄十二）。找尋 “AA” 序列的原因為當互

補的反股（antisense strand）的 3’ 端為 “UU” 的突出兩個核苷酸時，有助 於基因沉默的效果（Elbashir et al., 2001 b）。另外，siRNA 的 GC 比例可

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尋連續 “AA” 往後 19 個鹼基序列的 5’ 端以 GC-rich 為佳，3’ 端以

AT-rich 為佳（Mittal, 2004）。最後在目標 mRNA 上挑選的 AA(N)19 序列

需與 NCBI 的 genome sequence database 進行比對，避免標的到實驗細胞 株、實驗動物（人、小鼠、大鼠或蚊子…）的基因。

1.9 學生 t-檢定（Student's t-test）與變異數分析（Analysis of variance, ANOVA）之統計分析介紹

學生 t-分佈（Student's t-distribution）簡稱為 t-分布，於 1908 年 William Sealy Gosset 發表，當時在愛爾蘭 Dublin 的 Arthur Guinness Son & Co. 釀酒廠工作，因為商業機密不能以個人名義發表，以筆名 Student 發 表。t-分佈用於常態分布的母體帄均值的估計，是對兩組獨立樣本帄均值差 異進行顯著性測詴的學生 t-檢定（Student's t-test）的基礎。t-檢定改進 Z-檢定（Z-test）的缺點，沒有樣本數目的限制。Z-檢定在小樣本數會產生很 大的誤差，因此小樣本數情況下得改用 t-檢定。

變異數分析（Analysis of variance, ANOVA）是因統計資料會受到各種 因素影響，使個別樣本的數值產生差異，這種影響因素所造成之差異與檢 定的統計方法稱為變異數分析。ANOVA 用於多組（兩組以上）的獨立樣 本進行的帄均值差異統計分析。 當分析母體樣本超過兩組，若用 t-檢定進行兩兩比較，會無法得到整 體性的差異，而且出現第 I 型錯誤（Type I error）的機率也會提高。所謂 的第 I 型錯誤（Type I error），是指統計結果有假陽性的有顯著水準，假設 兩組數據的真實狀況是沒有差異，可是統計計算出的結果卻是有差異。因 此，可利用單因子 ANOVA 來分析兩組以上的帄均值是否相同，並且降低 t-檢定容易犯第 I 型錯誤的機率。但 ANOVA 只能說明整體多組的帄均值 有沒有統計上顯著差異，無法明確指出哪幾組有差異。當 ANOVA 檢定為

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有顯著差異時，可再事後多重比較（如： t-檢定）來確定個別組與組之間 的帄均值誰存在顯著差異。

1.10 Flavivirus 相關之 RNAi 研究

在 Flavivirus 上有其他病毒有以 RNAi 的方式做病毒研究，如：YFV、 JEV、DV1…等。在 YFV 方面，於 2009 年 Pacca 團隊建構針對 YFV 的 E、NS1、NS5 的 shRNA 表現質體，在體外（in vitro）與體內（in vivo） 進行實驗，在空斑詴驗（plaque assay）中，標的 E、NS1 的 shRNA 表現 質體轉染綠猿腎臟癌細胞（Vero cell）可抑制病毒的複製；在免疫螢光偵測 （Immunofluorescence）上，此兩個 shRNA 表現質體也可降低病毒蛋白的 表現；在活體老鼠實驗上，可增加感染後存活率（cell survival rate）及減少 中樞神經損傷（Pacca et al., 2009）。在 JEV 部分，於 2008 年 Qi 團隊建 構針對 JEV 的 NS5 的 shRNA 表現質體，在 293T 部分，shRNA 表現 質 體 與 pNS5-EGFP 共 轉 染 （ co-transfection ） 以 流 式 細 胞 技 術 （ flow

cytometry）、定量反轉錄 PCR（Ｑ-RT CPR）、西方墨點（Western blotting）

觀察 NS5-EGFP 的基因表現量，以及在 BHK-21 部分，shRNA 表現質體

轉染後以免疫螢光（Immunofluorescence）、定量反轉錄 PCR（Ｑ-RT CPR）、

西方墨點（Western blotting）觀察病毒的複製，由結果顯示，shRNAs 可以 專一性標的 NS5 基因及可有效抑制 JEV 病毒複製（Qi et al., 2008）。在 DV1，於 2010 年 Wu 團隊針對 prM 設計，以直接外送 siRNA 的形式轉 染至蚊子細胞（C6/36 cell），其結果顯示轉染 siRNA 的蚊子細胞可降低病 毒感染後造成的細胞病理效應（cytopathic effect, CPE）、增高細胞存活率

（cell survival rate）及降低病毒 RNA 的複製量（Viral RNA copies）（Wu et

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1.11 實驗目的與設計

由登革熱病毒基因體（見附錄五，Perera et al., 2008）得知，對於 DV 的 結構蛋白 C、prM、E 的功能及非結構蛋白 NS3、NS5 的酵素功能是比較 明瞭，而且蛋白結構也已被解讀（見附錄五，PDB identifiers: 1R6R, 3C5X, 1OKE, 2VBC, 2P1D, 2J7U; Perera et al., 2008）;另外 NS1 也已有商品化的抗

體可供實驗測詴（如：Abcam, ab41623）；相較上述的蛋白，非結構蛋白 NS2A、

NS2B、NS4A、NS4B 的功能較不明確。目前以知 Flavivirus 的 NS2B 為 NS3 protease 的 co-factor；有研究顯示，DV2 的 NS2A、NS4A、NS4B 會 抑制宿主細胞的 IFN signal transduction（Munoz-Jordan et al., 2003）；在 Kunjin virus（KUNV）中，NS2A 推測為組成 replicase complex（NS3、NS5）

中的一部分，參與 RNA 複製（Mackenzie et al., 1998）；在 DV 中，NS4A

蛋白 C 端 的 2K 片段與調節膜重排（membrane alteration）有關（Miller et al., 2007）；在 DV 中，NS4B 會與 NS3 作用協助病毒複製（Umareddy et al., 2006）。因此，本研究想了解 NS2A/2B、NS2A/2B 基因表現量對於病毒複 製的影響，一般消除表現量常用方式是利用 knock-out 或將基因局部 deletion 產生不具功能的 truncated protein 以達到目的；本研究則嘗詴以 knock-down 的方式，利用 RNAi 的機制找尋 siRNA 降低這些基因表現量 觀察對病毒複製的影響。

一般自行設計 siRNA 或 shRNA 是利用 siRNA 設計帄台軟體對於一 個目標基因內找尋多個預測的 siRNA 進行實驗，通常是依據設計帄台預測 出來的分數（score），預測分數越高越符合設計規則，但預測分數越高的 siRNA 序列不代表一定有效。因此，本研究利用多個 siRNA 設計帄台（見 表二）針對於一個目標基因內去預測 siRNA，並挑選 siRNA 設計帄台交 集共同預測有潛力的 siRNA 的序列做為研究的 siRNA（見表二下表為針 對 DV2 PL 046 strain 設計的 siNS2A、siNS2B、siNS4A、siNS4B 序列）。

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貮、材料

2.1 菌株

Escherichia coli DH5α strain（lab collection）

2.2 細胞株

BHK-21（帅倉鼠腎臟纖維母細胞，baby hamster kidney cell） C6/36（白線斑蚊細胞，Aedes albopictus cell）

2.3 病毒

Dengue virus type 2 PL046 strain（Taiwan local strain, lab collection） Japanese encephalitis virus RP9 strain（Dr. R.Y. Chang’s lab collection, NDHU；東華大學，張瑞宜老師）

14 2.4 質體 質體 特性 Reference pUC57-X1337G 請廠商合成並將設計的 DNA 序列片 段接入 pUC57 質體，其合成 DNA 序 列為本研究建構一系列針對不同 DV2 的 NS 基 因 設 計 的 shRNA 片 段 序 列，每個 shRNA 片段外以不同限制酶 分隔，以做為切割某單一 shRNA 序列 進行後續系列質體建構，請參照圖一。 生工 (MDbio) 廠商合成 pSilencer 3.1-H1 neo-siNC 篩選標記為 Ampicillin（在大桿菌轉型 時使用）及 Neomycin（於細胞轉染時

使用），另有 H1 RNA pol III promoter，

其下游片段會表現對於人類、小鼠、大 鼠基因體沒有 RNA 干擾的 shRNA， 做為 negative control。請參照圖三.a。 Ambion pSilencer-SiNS2A-1 pSilencer-SiNS2B-1 pSilencer-SiNS4A-1 pSilencer-SiNS4B-1

pSilencer 質 體 的 H1 RNA pol III promoter 其下游表現 shRNA 片段為 針對個別 NS 基因設計的序列。請參照 圖三.b - e。

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pDsRed-Express2-N1

篩選標記為 Kanamycin（在大桿菌轉型 時使用）/ Neomycin（於細胞轉染時使 用），另含有 reporter gene，Discosoma sp. red fluorescent protein, DsRed。請參 照圖五.a。 Clontech pDsRed-pS.-SiNC pDsRed-pS.-SiNS2A-1 pDsRed-pS.-SiNS2B-1 pDsRed-pS.-SiNS4A-1 pDsRed-pS.-SiNS4B-1 pDsRed-E2-N1 質體於 E.coO109 I 切 位處接入由 pSilencer 系列各質體的 H1 RNA pol III promoter 及其下游表現 shRNA 片段的得到的 PCR 產物。請參 照圖五.b - f。 本研究 2.5 引子（Primer） 引子 5’ → 3’ 序列 位置 應用 M13F(-40) 5’-GTTTTCCCAGTCAC GAC-3’ pSilencer (Ambion)： + 359 ~ + 375 DNA 定序 3.0rev 5’-GAGTTAGCTCACTC ATTAGGC-3’ pSilencer (Ambion)： + 662 ~ + 682 DNA 定序 pDRNC-S-F1(3683) 5’-GCTGGCACTCTGTC GATACC-3’ pDsRed (Clontech)： + 3683 ~ + 3702 DNA 定序 pDRNC-S-R1(4292) 5’-CTCACGTTAAGGG ATTTTGG-3’ pDsRed (Clontech)： + 4272 ~ + 4291 DNA 定序 pS-F-1(288) 5’-TATAGGCCCTGCCT CTTCGCTATTACGC-3’ pSilencer (Ambion)： + 288 ~ + 305 PCR 使用

16 pS-R-1(635) 5’-TATAGGGCCTCGGC TCGTATGTTGTGTG-3’ pSilencer (Ambion)： + 618 ~ + 635 PCR 使用 pS-shNCPB 5’-ACTACCGTTGTTAA GGTG-3’ Digoxigenin pDsRed-pS.-siNC： + 4030 ~ + 4047 北方墨點 探針使用 pS-sh2APB 5’-GGTCTCAATCCAAC AGCTA-3’ Digoxigenin Dengue PL046 genome： + 4075 ~ + 4093 北方墨點 探針使用 pS-sh4APB 5’-GATGACCTTAGGAA TGTGC-3’ Digoxigenin Dengue PL046 genome： + 6613 ~ + 6633 北方墨點 探針使用 2.6 藥品詴劑 藥品名稱 廠商 目錄編號 應用

1kb DNA ladder SibEnzyme SEM11C001 DNA 電泳

100 bp DNA ladder Fermentas SM0243 DNA 電泳

40 % Acryl / Bis 19：1 solution

Amresco 0496-500 mL RNA 電泳

30 % Acryl / Bis 29：1 solution

Sigma A-3754 DNA 電泳

Acetic acid Fluka 33209 緩衝液

Agarose Vegonia May-01 DNA 電泳

Anti-DIG-AP Roche 1093274 北方墨點

17

APS Bio-Rad 161-0700 DNA / RNA 電泳

Blocking reagent Roche 1096176 北方墨點

Bronic acid Merck 1.00165.1000 DNA / RNA 電泳

CaCl2 Riedel-de Haën 31307 細菌培養

CH3COONH4

(ammonium acetate) Panreac 131114 緩衝液

Crystal violet Sigma C-3886 空斑測詴

CSPD Roche 1655884 北方墨點

DIG Easy Hyb Roche 11603558001 北方墨點

DEPC Sigma D-5758 RNases 去活化

DMSO Sigma D-8418 細胞儲存

EDTA Amresco 105 緩衝液

EtBr Sigma E-7637 核酸染色

Fetal Bovine Serum Biological

industries 04-001-1A 細胞培養

Formaldehyde Riedel-de Haën 33220 細胞固定

G418 (GENETICIN) GIBCO 11811-031 細胞培養 Glycerol Amresco 0854-1L 細菌培養 Kanamycin Sigma K4000 細菌培養 LB agar Alpha Biosciences L12-111 細菌培養 LB broth Scharlau 02-385 細菌培養

18

Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 細胞轉染

Maleic acid Fluka 63190 緩衝液

MEM GIBCO 41500-034 細胞培養

Methylcellulose Sigma M0512 空斑測詴

microRNA marker Biolabs N2102S RNA 電泳

NaCl Amresco 241 細菌培養

NaHCO3 Sigma S-5761 細胞培養

NaOH Riedel-de Haën 30620 緩衝液

Mg(C2H3O2)2

(magnesium acetate) Sigma M5661 緩衝液

Nylon membrane Pall 60207 北方墨點

Opti-MEM GIBCO 31985-062 細胞轉染

PBS Biological

Industries 11-223-1K 細胞培養

Taq DNA polymerase Fermentas EP0402 質體建構

Restriction enzyme Biolabs,

Fermentas - 質體建構 SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) Promega M8201 質體建構 SDS Riedel-de Haën 62862 質體建構

Sodium citrate Riedel-de Haën 25116 緩衝液

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T4 DNA ligase Promega M1801 質體建構

TEMED Sigma T-9281 DNA / RNA 電泳

Tris-base Amresco 826 緩衝液

Tris-HCl Amresco 234 緩衝液

TrypLETM Express GIBCO 12605-010 細胞培養

Tween-20 Sigma P1379 緩衝液

Urea Fluka SK-2644U RNA 電泳

X-ray film Midwest

Scientific LA7111 北方墨點

2.7 詴劑組

詴劑名稱 廠商 目錄編號 應用

pSilencer™ neo Kit Ambion AM5770 質體 DNA 建構

Gene-SpinTM Miniprep

Purification Kit Protech MP530XL 質體 DNA 萃取

QIAEX II® Gel Extraction

Kit QIAGEN 20021 DNA 純化

PCR Clean-up Kit Premier N-DCE050 PCR 純化

mirVana™ miRNA

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2.8 溶劑、緩衝溶液及培養基

 1 X PBS（Phosphate buffer saline）

137 mM NaCl; 10 mM Na2HPO4; 2.7 mM KCl; 1.8 mM KH2PO4  1 % Crystal violet solution（1 L）

10 g crystal violet; 100 ml 37 % formaldehyde; 900 ml ddH2O  3.7 % Formaldehyde（1 L）

100 ml 37 % formaldehyde; 900 ml ddH2O  Diffusion buffer

0.5 M ammonium acetate; 10 mM magnesium acetate; 1 mM EDTA, pH 8.0; 0.1 % SDS.

 50 X TAE（Tris-acetate-EDTA）（200 ml）

48.4 g Tris base; 20 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0; 11.42 ml acetic acid 加 ddH2O 至 200 ml

 10 X TBE（Tris-Borate-EDTA）（for DNA）（800 ml）

86.4 g Tris base; 44 g bornic acid; 32 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0; 加 ddH2O 至 800 ml

 10 X TBE（Tris-Borate-EDTA）（for RNA）（800 ml）

86.4 g Tris base; 44 g bornic acid; 32 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0; 加 DEPC-treated H2O 至 800 ml

 0.1 % DEPC（Diethyl pyrocarbonate）-treated H2O（1000 ml）

取 DEPC 原液 1 ml 加 999 ml ddH2O，37 ℃ 震盪 3 ~ 16 小時，滅菌

 20 X SSC（Saline-sodium citrate）, pH 7 3 M NaCl; 0.3 M Sodium citrate

 Maleic acid buffer, pH 7.5 0.1 M Maleic acid; 0.15 M NaCl

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 Washing buffer, pH 7.5

0.1 M Maleic acid; 0.15 M NaCl; 0.3 % Tween 20  10 X blocking buffer（100 ml）

10 g blocking reagent 加 Maleic acid buffer 至 100 ml  Detection buffer, pH 9.5

0.1 M Tris-base; 0.1 M NaCl  LB（Luria-Bertni）broth

1 % tryptone; 0.5 % yeast extract; 1 % NaCl  LB（Luria-Bertni）/ Ampicillin agar

1 % tryptone; 0.5 % yeast extract; 1 % NaCl; 1.5 % agar, 50 μg/ml Ampicillin

 LB（Luria-Bertni）/ Kanamycin agar

1 % tryptone; 0.5 % yeast extract; 1 % NaCl; 1.5 % agar; 50 μg/ml Kanamycin

2.9 儀器設備

一次水製造機 UR-181JW-1（UNION） 超純水製造機 Simplicity（MILLIPORE）

微量管震盪器 VORTEX-GENIE2 G560（SCIENTIFIC INDUSTRICS） 詴管震盪器 S101（FIRSTEK SCIENTIFIC） 乾燥加熱板 HV-01（Violet BioSciences） 加熱攪拌器 PC-420（CORNING） 酸鹼值檢測計 Φ360（BECKMAN） 電子天秤 PB153-S（METTLER TOLEDO） 電子防潮箱 DX106（台灣防潮科技）

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往復式恆溫水槽 B206-T1（FIRSTEK SCIENTIFIC） 水帄式電泳槽 MJ-105（MEDCLUB）

垂直式電泳槽 VE-180（瑞伯生物科技有限公司） 電泳影像處理系統 GEL DOC 2000（BIO-RAD）

迴轉式震盪培養箱 S300R（WISDOM APPARATUS MFG COMPANY） 低溫培養箱 701（WISOOM）

二氧化碳培養箱（NAPCO）

電磁式奈米級偵測儀 ND-1000（博克科技有限公司）

分光光度計 20GENES YSRT（SPECTRONIC INSTRUMENTS） 梯度核酸增殖儀 labcycler（SENSOQUEST）

微量離心機 MICRO 240A（DINVILLE SCIENTIFIC INC.） 微量冷凍高速離心機 centrifuge 5415R（eppendorf） 桌上型低溫高速離心機 centrifuge 5804R（eppendorf） 烘箱 DS-45（DENG YNG） 4℃三門冰藏櫃 KS-101-MS（MINI KINGKON） 4℃雙門冰藏櫃 CH-502（CHIN HSIN） -20℃開蓋式冷凍櫃 311-407-00（至鴻股份有限公司） -20℃直立冷凍櫃（WHITE-WESTINGHOUSE） -80℃超低溫冷凍櫃 925/926（FIRSTEK SCIENTIFIC） 液態氮桶 LS 750（TAYLOR-WHARTON） 無菌操作台 VCM-420（造鑫） 血球計數器（MARIEMFELD） 倒立相位差螢光顯微鏡 TE2000-U（Nikon） 數位相機 C-5050ZOOM（OLYMPUS） 雜交連結器（UVITEC）

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參、方法

3.1 質體建構 3.1.1 大腸桿菌勝任細胞的製備 取單一菌落培養於 5 ml 的 LB 培養液，於 37 ℃ 震盪（180 rpm）培 養。培養 14 ~ 16 小時後，取 2 ml 的菌液轉養於 100 ml 的 LB 培養液（含 5 % 葡萄糖; 2 mM MgCl2），於 37 ℃ 下震盪（180 rpm）培養直到 O.D.600 介於 0.4 ~ 0.6 之間。將菌液移至 50 ml 離心管於冰上 20 分鐘。在 4 ℃ 以 3000 rpm 離心 10 分鐘，去除上清液，加入 50 ml 預冷的 0.1 M CaCl2 懸浮菌體，靜置冰中 30 分鐘。在 4 ℃ 以 2000 rpm 離心 10 分鐘，去除 上清液，再加入 5 ml 預冷的 0.1 M CaCl2 懸浮菌體，於 4 ℃ 靜置 18 ~ 20 小時。在 4 ℃ 以 2000 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，再加入 5 ml 預 冷的 freezer solution （50 mM CaCl2; 15 % Glycerol）懸浮菌體。每管以 100 μl 的體積分裝於預冷的微量離心管，儲存於 - 80 ℃。 3.1.2 大腸桿菌勝任細胞的轉形 將勝任細胞於冰上解凍，加入 < 100 ng 質體 DNA 混合均勻，冰浴 20 分鐘。於 42 ℃ 水浴熱休克（Heat shock） 30 秒，加入 500 μl LB 培養 液，於 37 ℃ 震盪培養（180 rpm）1 小時。取 100 μl 菌液均勻塗至含有 抗生素（Ampicillin: 50 μg / ml 或 Kanamycin: 50 μg / ml）的 LB 固體培養 基上，37 ℃ 培養 14 ~ 16 小時。 3.1.3 小量質體 DNA 萃取

小 量 質 體 是 利 用 Gene-SpinTM Miniprep Purification Kit （ Protech, MP530XL）萃取。實驗步驟如下：將單一大腸桿菌菌落轉養在 5 ml 含有

24 抗生素（Ampicillin: 50 μg / ml 或 Kanamycin: 50 μg / ml） 的 LB 培養液， 37 ℃ 震盪培養（180 rpm）14 ~ 16 小時。取 1.5 ml 菌液移至微量離心管， 以 13000 rpm 離心 1 分鐘，去除上清液。加入 200 μl 預冷的 Solution I 混合均勻，再加入 200 μl 的 Solution II 緩和混合均勻，靜置室溫 5 分鐘， 最後加入 300 μl 的 Solution III 緩和混合均勻，以 13000 rpm 離心 5 分鐘。 取上清液至 column，以 13000 rpm 離心 30 秒，去除濾液。加 700 μl 的 Washing Solution 至 column，以 13000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉濾液，此 步驟重複一次（清洗 2 次）。以 13000 rpm 離心 5 分鐘，去除殘留的 Washing Solution，將 column 裝置新的微量離心管。開蓋放於 60 ℃ 加熱 板 3 ~ 5 分鐘去除多餘酒精，加 40 ~ 50 μl 的 ddH2O 或 Elution Buffer （10 mM Tris-Cl, pH 8.5）於 column 濾膜中，以 13000 rpm 離心 1 分鐘， 測量 DNA 的濃度與純度，儲存於 - 20 ℃。 3.1.4 限制酶反應 為製備實驗所需之 DNA 片段，取適量 DNA（0.5 ~ 5 μg）及適量限制 酶（1 μg 的 DNA 約使用 1 unit 的酵素），到適量的反應體積（20 ~ 50 μl）， 於酵素作用的溫度作用 2 ~ 3 小時。反應完成後，於適當溫度加熱以終止 反應。酵切溫度、終止反應溫度及緩衝液的濃度則依照所附之說明書使用。 利用洋菜膠電泳分析，若為小片段 DNA（約 100 bp）則用聚丙烯酰胺凝膠 電泳分析。 3.1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳 此為分析實驗小片段 DNA（約 100 bp）。以 12 % 的 nondenaturing polyacrylamide gel（native PAGE）進行電泳分離，凝膠配法如下： 6ml 的 30 % acryl / bis（29：1）solution、1.5 ml 的 10 X TBE，120 μl 的 10 % APS、

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6 ul 的 TEMED，補 ddH2O 至總體積為 15 ml，靜置膠凝固 1 ~ 2 小時。

將 DNA 與 6 X loading buffer（0.01 % bromophenol blue; 0.25 M EDTA; 50 % sucrose）混合均勻，注入膠孔中，以 100 V 進行電泳直到 bromophenol blue 電泳至凝膠底部，取出膠體以 EtBr 染色，觀察小片段 DNA。

3.1.6 萃取聚丙烯酰胺凝膠內之小片段 DNA

小片段 DNA 是利用 QIAEX II® Gel Extraction Kit（QIAGEN, 20021） 萃取。將含有所要的小片段 DNA 的聚丙烯酰胺凝膠切下放入新的微量離 心管（凝膠 ≦ 250 mg）。秤量切下的凝膠重量，加入 2 倍體積的 diffusion buffer 至 1 倍體積凝膠中，於 50 ℃ 作用 30 分鐘，以 13000 rpm 離心 1 分鐘。小心吸取上清液以 Whatman GF/C 濾膜的 column 過濾。計算過濾 液的體積，加入 6 倍體積的 Buffer QX1 至 1 倍體積的過濾液中。預先將 QIAEX II 震盪 30 秒，加入 30 μl 的 QIAEX II 至濾液/QX1 混合物中， 於 50 ℃ 作用 10 分鐘，每 2 分鐘震盪一次確保 QIAEX II 懸浮於溶液 中（QX1 在 pH ≦ 7.5 為黃色，此時 QIAEX II 與 DNA 作用效果最佳， 在高 pH 下 QX1 會呈橘色或紫色，則會降低 DNA 回收效率，若液體呈 橘色或紫色可加入 10 μl 的 3 M sodium acetate, pH 5.0 使 QX1 恢復黃 色），以 13000 rpm 離心 30 秒，移除上清液。以 500 μl 的 QX1 清洗管 中沉澱物，以 13000 rpm 離心 30 秒，移除上清液。以 500 μl 的 Buffer PE 清洗沉澱物，以 13000 rpm 離心 30 秒，移除上清液，此步驟重複一次（清 洗 2 次）。自然烘乾 15 ~ 30 分鐘使沉澱物變成微白，加入 20 μl 的 ddH2O

或 Elution buffer（10 mM Tris-Cl, pH 8.5）懸浮沉澱物，以 13000 rpm 離心 30 秒，將上清液移至新的微量離心管，測量 DNA 的濃度與純度，儲存於 -20 ℃。

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3.1.7 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）

此步驟為取得 pSilencer 系列各質體的 H1 RNA pol III promoter 及其下 游 表 現 shRNA 片 段 的 PCR 產 物 ， 以 供 接 入 pDsRed-E2-N1 質 體 於 E.coO109 I 切位處。取 100 ~ 150 μg 的質體 DNA、5 μl 的 10 倍酵素緩

衝液（不含 MgCl2）、4 μl（25 mM）的 MgCl2、4 μl（2.5 mM）的 dNTP、

各 1 μl（50 mM）的引子對、1 ~ 1.5 units 的聚合酶，反應總體積為 50 μl。 溫度設定：A. 95 ℃ 反應 5 分鐘；B. 95 ℃ 反應 1 分鐘；C. 55 ℃ （Annealing temperature）反應 1 分鐘；D. 72 ℃ 反應 1 分鐘；E. 72 ℃ 反 應 5 分鐘。其中，B、C、D 重覆 29 次循環。

3.1.8 PCR 產物純化

PCR 產物是利用 PCR Clean-up Kit（Premier, N-DCE050）純化。將 PCR 產物加入 500 μl binding solution 混合均勻放入 column 中，以 13000 rpm 離心 1 分鐘，去除濾液。加入 700 μl washing solution，以 13000 rpm

離心 1 分鐘，去除濾液，此步驟重複一次（清洗 2 次）。以 13000 rpm 離

心 2 分鐘，去除 column 上殘餘的液體。將 column 換至新的微量離心管，

開蓋放於 60 ℃ 加熱板 3 ~ 5 分鐘去除多餘酒精，加 30 ~ 50 μl ddH2O 或

Elution Buffer（10 mM Tris-Cl, pH 8.5）於 column 濾膜中，以 13000 rpm 離 心 1 分鐘，測量 PCR 產物的濃度與純度，儲存於 - 20 ℃。

3.1.9 去磷酸反應

DNA 去磷酸反應是利用 SAP（Shrimp Alkaline Phosphatase）進行。取 1 μg 的 DNA、5 μl 的 10 倍酵素緩衝液、1 unit 的 SAP 酵素，反應總體 積為 50 μl，37 ℃ 反應 15 分鐘。於 65 ℃ 加熱 15 分鐘終止反應。

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3.1.10 接合反應（Ligation）

取 50 ng 的 vector DNA、適量 insert DNA（vector 與 insert 的分子 數比約 1：3）、2 μl 的 10 倍酵素緩衝液、1 μl（3 units / μl）的接合酶， 反應總體積為 20 μl，於 14 ℃ 水浴反應 16 小時，65 ℃ 去活化 10 分 鐘， 儲存於 - 20 ℃冰箱或直接進行大腸桿菌勝任細胞的轉形。

3.2 細胞實驗

3.2.1 BHK-21 細胞繼代培養

培養液為含有 5 % FBS（Fetal Bovine Serum）的 MEM（Minimun

Essential Medium），培養環境為含有 5 % CO2 的 37 ℃ 恆溫培養箱。繼代 培養流程如下：吸除 75 cm2 培養皿中舊培養液，以 5 ml 的 PBS 沖洗一 次，加入 1 ml 的 TrypLETM Express，37 ℃ 反應 5 分鐘。加入 2 ~ 3 ml 的 5 % FBS / MEM 輕輕沖散細胞，置於 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離 心 5 分鐘，去除上清液。以 3 ml 新鮮 5 % FBS / MEM 懸浮細胞，取適量 細胞液加入 10 ~ 12 ml 新鮮 5 % FBS / MEM 混合均勻於培養箱培養。 3.2.2 C6/36 細胞繼代培養 培養液為含有 10 % FBS 的 MEM，培養於 28 ℃ 恆溫培養箱。繼代 培養流程如下：舊培養液留約 1 ml，將細胞以細胞刮勺刮落，加入 2 ml 的 10 % FBS / MEM 輕輕沖散細胞，置於 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離 心 5 分鐘，去除上清液。以 3 ml 新鮮 10 % FBS / MEM 懸浮細胞，取 1/3 的細胞液加入 12 ml 新鮮 10 % FBS / MEM 混合均勻於培養箱培養。

28 3.2.3 登革熱病毒的增殖 利用 C6/36 細胞以 MOI（multiplicity of infection）= 0.1 增殖 DV2 PL046 strain。將 1 x 107 的 C6/36 細胞置入 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液。以適量 10 % FBS / MEM 混合均勻，加入 1 x 106 的病毒（含細胞的培養液其與病毒混合後體積為 2 ml）。於 37 ℃ 培養箱 2 小時，每 30 分鐘搖一次，將其移到新的 T75 培養皿中，加入 7 ml 的 10 % FBS / MEM，培養於 28 ℃ 培養箱。於感染經過第四、六、八、十天， 每兩天收集一次培養皿中含有病毒的培養液，後補 8 ml 新鮮 10 % FBS / MEM 至培養皿中，培養於 28 ℃ 培養箱。含有病毒的培養液以 0.22 μm 孔徑的濾膜過濾，將含有病毒的過濾液分裝到 1.5 ml 的微量離心管中，保 存於 - 80 ℃。 3.2.4 日本腻炎病毒的增殖

利用 BHK-21 細胞以 MOI（multiplicity of infection）= 0.1 增殖 JEV

RP9 strain。將 1 x 107 的 BHK-21 細胞前一日置於 T75 培養皿，加入 5 % FBS / MEM，在 37 ℃、5 % CO2 培養箱中培養 12 小時。感染前先去除培 養液，以 PBS 沖洗兩次，再加入 1 x 106 病毒（最後在 T75 培養皿中病 毒液體積為 3 ml），於 37 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 1 小時，每 15 分 鐘搖晃一次。一小時後去除上清液，加入 10 ml 的 5 % FBS / MEM，培養 於 37 ℃，5 % CO2 培養箱。於感染經過三天，收集培養皿中含有病毒的 培養液，含有病毒的培養液以 0.22 μm 孔徑的濾膜過濾，將含有病毒的過 濾液分裝到 1.5 ml 的微量離心管中，保存於 - 80 ℃。

29 3.2.5 BHK-21 細胞轉染 轉染前一日先於 6-well 培養盤置入 2 x 105 的 BHK-21 細胞。轉染當 天，取一微量離心管將 4 μg 的質體 DNA 稀釋於 250 μl 的 Opti-MEM 中，取另一微量離心管將 10 μl 的 Lipofectamine™ 2000 加入 240 μl 的 Opti-MEM，室溫靜置 5 分鐘。將兩種液體輕輕混和均勻，室溫靜置 20 分 鐘，將液體均勻滴入培養皿，於 37 ℃，5 % CO2 培養箱中 4 ~ 6 小時。 置換新的 5 % FBS / MEM。於 37 ℃，5 % CO2 培養箱中培養 24 小時， 以供後續的實驗進行。 3.2.6 BHK-21 穩定細胞株選殖 將 6-well 培養盤經過轉染 24 小時的 BHK-21 細胞吸起培養液，以 2 ml 的 PBS 沖洗，加入 300 μl TrypLETM Express，37 ℃ 反應 5 分鐘。 加入 1 ml 的 5 % FBS / MEM 輕輕沖散細胞，置於 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。倒掉上清液，以 5 % FBS / MEM 懸浮細胞，以 1/500 稀釋倍率將細胞液均勻置入 10 cm 培養皿中，以有含抗生素（G418: 800 μg / ml）的 5 % FBS / MEM，於 37 ℃，5 % CO2 培養箱培養，每 2 天 更換一次含 G418: 800 μg / ml 的 5 % FBS / MEM。直到單一細胞長成群落， 以適量 TrypLETM Express 將細胞單體化，將細胞依序放大轉移至 24-well 培養盤、12-well 培養盤、6-well 培養盤、10 cm 培養皿。最後將 10 cm 培 養皿內穩定細胞株以含 5 % DMSO 的 5 % FBS / MEM 製成凍管，以漸凍 盒於 - 80 ℃ 冷凍一天後，存放於液態桶中。

30 3.2.7 空斑詴驗（短暫性質體轉染細胞組） 實驗前一天在 6-well 培養盤中個別放入 2 x 105 的 BHK-21 細胞、2 x 105 的帶有轉染質體的 BHK-21 細胞（短暫性質體轉染細胞）。以不含血 清的 MEM 沖洗兩次。病毒（分成 DV2 實驗組及 JEV 對照組）以不含 血清的 MEM 進行序列稀釋，每一個培養孔加入 450 μl 序列稀釋的病毒 溶液（100 ~ 200 PFU / well）（PFU, plaque-forming unit），於含有 5 % CO2 的 37 ℃ 培養箱中 1 ~ 2 小時進行感染，每 30 分鐘搖晃一次。加入 4 ml 的

1.1 % methyl cellulose medium，置入含有 5 % CO2 的 37 ℃ 培養箱中培養。

DV2 實驗組培養 7 天後，吸除培養液，加入適量 2 ml 的 3.7 % 甲醛固定 細胞，於室溫 15 ~ 20 分鐘，吸除甲醛，加入 2 ml 的 1 % 結晶紫溶液染 色，於室溫 2 ~ 16 小時，以清水沖洗培養盤。於室溫風乾後，計數空斑數 目。JEV 對照組則培養 3 天後，進行固定及染色細胞，計數空斑數目。 3.2.8 空斑詴驗（穩定細胞株組） 實驗前一天在 6-well 培養盤中個別放入 2 x 105 的 BHK-21 細胞、2 x 105 的帶有質體的 BHK-21 穩定細胞株。以不含血清的 MEM 沖洗兩次。 病毒（分成 DV2 實驗組及 JEV 對照組）以不含血清的 MEM 進行序列 稀釋，每一個培養孔加入 450 μl 序列稀釋的病毒溶液（100 ~ 200 PFU / well），於含有 5 % CO2 的 37 ℃ 培養箱中 1 ~ 2 小時進行感染，每 30 分

鐘搖晃一次。加入 4 ml 的 1.1 % methyl cellulose medium，置入含有 5 %

CO2 的 37 ℃ 培養箱中培養。DV2 實驗組培養 7 天後，吸除培養液，加

入適量 2 ml 的 3.7 % 甲醛固定細胞，於室溫 15 ~ 20 分鐘，吸除甲醛， 加入 2 ml 的 1 % 結晶紫溶液染色，於室溫 2 ~ 16 小時，以清水沖洗培養 盤。於室溫風乾後，計數空斑數目。JEV 對照組則培養 3 天後，進行固定 及染色細胞，計數空斑數目。

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3.3 小分子 RNA（small RNA）檢測 3.3.1 小分子 RNA（small RNA）的萃取

小 分 子 RNA（ small RNA ） 是 利 用 mirVana miRNA Isolation Kit （Ambion, AM1560）萃取，分成以下三個部分。 3.3.1.1 細胞均質化 將細胞以 5 ml 的 PBS 沖洗，加入 1 ml TrypLETM Express，37 ℃ 反 應 5 分鐘。加入 3 ml 的 5 % FBS / MEM 輕輕沖散細胞置於 15 ml 離心 管，於 4 ℃ 以 1500 rpm 離心 5 分鐘。倒掉上清液，加入 1 ml PBS 洗 勻細胞，於 4 ℃ 以 1500 rpm 離心 5 分鐘，放至冰中。倒掉 PBS 上清 液，加入 600 μl 的 Lysis/Binding Solution，均勻懸浮使細胞均質化，將細 胞均質液換至新的微量離心管。 3.3.1.2 有機萃取

加入 1/10 倍體積 miRNA Homogenate Additive 與細胞均質液混合均 勻，靜置冰上 10 分鐘。加入 1 倍體積常溫 Acid-Phenol：Choroform，震 盪 30 ~ 60 秒。以 10,000 g 離心 5 分鐘，會出現上層水相液（aqueous phase） 及下層有機相液（organic phase），小心取上層液（aqueous phase），不要碰 到下層液，將上層液換至新微量離心管中。 3.3.1.3 小分子 RNA 萃取 加入 1/3 倍上層液（aqueous phase）體積的 100 % 酒精至微量離心管 混合均勻（例如：100 μl 的 100 % 酒精加至 300 μl 的吸取的上層液）。將 上層液/酒精混合物加入 column 中，以 10,000 g 離心 15 秒，收集過濾液 移至新微量離心管中。重複以 10,000 g 離心 15 秒一次，使上層液/酒精混

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合物都通過 column 上的濾膜。加入 2/3 體積 100 % 酒精至過濾液混合均 勻（例如：266 μl 的 100 % 酒精加至 400 μl 的過濾液中）。將過濾液/酒 精混合物加入新 column 中，以 10,000 g 離心 15 秒，倒掉過濾液，重複 離心一次，使過濾液/酒精混合物都通過 column 上的濾膜。加入 700 μl 的 miRNA Wash Solution 1 至 column 中，以 10,000 g 離心 5 ~ 10 秒，倒掉 過濾液，重複離心一次，去除多餘殘留液。加入 500 μl 的 Wash Solution 2/3 至 column 中，以 10,000 g 離心 5 ~ 10 秒，此步驟重複一次（清洗 2 次）。 倒掉過濾液，以 10,000 g 離心 1 分鐘，將 column 移至新 collection tube 中，加入 100 μl 的 95 ℃ 的 Elution Solution 於 column 濾膜中，以 10,000 g 離心 20 ~ 30 秒。測量 RNA 濃度與純度，儲存於 - 80 ℃。

3.3.2 北方墨點法（Northern Blotting）偵測小分子 RNA

一般偵測 mRNA 是利用含有 formaldehyde 的 1.5 % agarose gel，將 RNA 樣本經過 formaldehyde、formamide 及加熱 denaturing 處理後，以 MOPS （3-(N-morpholino)propanesulfonic acid）電泳緩衝液進行電泳。接著 以 10 X SSC 利用毛細現象轉漬法（capillary transfer）將 RNA 轉漬到 Nylon membrane 上。而 1.5 % 的 agarose gel 可適用 0.5 ~ 8.0 kb 的 RNA。 本實驗為偵測 20 ~ 30 nt 的小分子 RNA，因此改用聚丙烯酰胺凝膠 （polyacrylamide gel），15 % 的 polyacrylamide gel 可適合的範圍為 25 ~ 150 bp。另外，本實驗改以電壓的方式轉漬，提高小分子 RNA 轉移到 Nylon membrane 上的效率。

3.3.2.1 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

以 15 % 的 denaturing polyacrylamide gel（8 M Urea）進行電泳分離， 凝膠配法如下：5.625 ml 的 40 % acrylamide（19：1）solution、1.5 ml 的 10