細胞實驗

3.2.1 BHK-21 細胞繼代培養

培養液為含有 5 % FBS（Fetal Bovine Serum）的 MEM（Minimun Essential Medium），培養環境為含有 5 % CO₂ 的 37 ℃ 恆溫培養箱。繼代 培養流程如下：吸除 75 cm² 培養皿中舊培養液，以 5 ml 的 PBS 沖洗一 次，加入 1 ml 的 TrypLETM Express，37 ℃ 反應 5 分鐘。加入 2 ~ 3 ml 的 5 % FBS / MEM 輕輕沖散細胞，置於 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離 心 5 分鐘，去除上清液。以 3 ml 新鮮 5 % FBS / MEM 懸浮細胞，取適量 細胞液加入 10 ~ 12 ml 新鮮 5 % FBS / MEM 混合均勻於培養箱培養。

3.2.2 C6/36 細胞繼代培養

培養液為含有 10 % FBS 的 MEM，培養於 28 ℃ 恆溫培養箱。繼代 培養流程如下：舊培養液留約 1 ml，將細胞以細胞刮勺刮落，加入 2 ml 的 10 % FBS / MEM 輕輕沖散細胞，置於 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離 心 5 分鐘，去除上清液。以 3 ml 新鮮 10 % FBS / MEM 懸浮細胞，取 1/3 的細胞液加入 12 ml 新鮮 10 % FBS / MEM 混合均勻於培養箱培養。

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3.2.3 登革熱病毒的增殖

利用 C6/36 細胞以 MOI（multiplicity of infection）= 0.1 增殖 DV2 PL046 strain。將 1 x 10⁷ 的 C6/36 細胞置入 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液。以適量 10 % FBS / MEM 混合均勻，加入 1 x 10⁶ 的病毒（含細胞的培養液其與病毒混合後體積為 2 ml）。於 37 ℃ 培養箱 2 小時，每 30 分鐘搖一次，將其移到新的 T75 培養皿中，加入 7 ml 的 10

% FBS / MEM，培養於 28 ℃ 培養箱。於感染經過第四、六、八、十天，

每兩天收集一次培養皿中含有病毒的培養液，後補 8 ml 新鮮 10 % FBS / MEM 至培養皿中，培養於 28 ℃ 培養箱。含有病毒的培養液以 0.22 μm 孔徑的濾膜過濾，將含有病毒的過濾液分裝到 1.5 ml 的微量離心管中，保 存於 - 80 ℃。

3.2.4 日本腻炎病毒的增殖

利用 BHK-21 細胞以 MOI（multiplicity of infection）= 0.1 增殖 JEV RP9 strain。將 1 x 10⁷ 的 BHK-21 細胞前一日置於 T75 培養皿，加入 5 % FBS / MEM，在 37 ℃、5 % CO2 培養箱中培養 12 小時。感染前先去除培 養液，以 PBS 沖洗兩次，再加入 1 x 10⁶ 病毒（最後在 T75 培養皿中病 毒液體積為 3 ml），於 37 ℃，5 % CO₂ 培養箱中培養 1 小時，每 15 分 鐘搖晃一次。一小時後去除上清液，加入 10 ml 的 5 % FBS / MEM，培養 於 37 ℃，5 % CO₂ 培養箱。於感染經過三天，收集培養皿中含有病毒的 培養液，含有病毒的培養液以 0.22 μm 孔徑的濾膜過濾，將含有病毒的過 濾液分裝到 1.5 ml 的微量離心管中，保存於 - 80 ℃。

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3.2.5 BHK-21 細胞轉染

轉染前一日先於 6-well 培養盤置入 2 x 10⁵ 的 BHK-21 細胞。轉染當 天，取一微量離心管將 4 μg 的質體 DNA 稀釋於 250 μl 的 Opti-MEM 中，取另一微量離心管將 10 μl 的 Lipofectamine™ 2000 加入 240 μl 的 Opti-MEM，室溫靜置 5 分鐘。將兩種液體輕輕混和均勻，室溫靜置 20 分 鐘，將液體均勻滴入培養皿，於 37 ℃，5 % CO₂ 培養箱中 4 ~ 6 小時。

置換新的 5 % FBS / MEM。於 37 ℃，5 % CO₂ 培養箱中培養 24 小時，

以供後續的實驗進行。

3.2.6 BHK-21 穩定細胞株選殖

將 6-well 培養盤經過轉染 24 小時的 BHK-21 細胞吸起培養液，以 2 ml 的 PBS 沖洗，加入 300 μl TrypLETM Express，37 ℃ 反應 5 分鐘。

加入 1 ml 的 5 % FBS / MEM 輕輕沖散細胞，置於 15 ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。倒掉上清液，以 5 % FBS / MEM 懸浮細胞，以 1/500 稀釋倍率將細胞液均勻置入 10 cm 培養皿中，以有含抗生素（G418:

800 μg / ml）的 5 % FBS / MEM，於 37 ℃，5 % CO2 培養箱培養，每 2 天 更換一次含 G418: 800 μg / ml 的 5 % FBS / MEM。直到單一細胞長成群落，

以適量 TrypLETM Express 將細胞單體化，將細胞依序放大轉移至 24-well 培養盤、12-well 培養盤、6-well 培養盤、10 cm 培養皿。最後將 10 cm 培 養皿內穩定細胞株以含 5 % DMSO 的 5 % FBS / MEM 製成凍管，以漸凍 盒於 - 80 ℃ 冷凍一天後，存放於液態桶中。

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3.3 小分子 RNA（small RNA）檢測