小柴胡湯對細胞激素分泌之影響

小柴胡湯和其他中藥早在臨床上已有使用在對抗肝炎的過程。在以 前的研究顯示，小柴胡湯可降低血清中alanine aminotranferase (ALT)的 濃度。如表 4.3 中所示， 在以小柴胡湯處理之前，除 IL-2 之外，來自 HCV⁺ 病患的 PBMC 的 cytokine 製造與來自健康的 HCV-對照組相比較 大大提升，因此推測用小柴胡湯處理HCV 患者的 PBMC 將導致 cytokine 選擇性的減少。其中 IL-1β與 IL-6 的濃度有明顯減少(paired t-test, p<0.01)，而其他 cytokine 則無明顯變化。IL-1β以及 IL-6 這兩種細胞激

素，似乎可以完全被抑制，並且濃度大幅降低至正常的水準。大致而言，

小柴胡湯治療確實會使得肝炎病患的cytokine 製造 profiles 恢復正常。

而對健康的對照組來說，在比較處理和未處理兩組之間的 cytokine 濃度，僅 IFN-γ 有的顯著的減少外，其他 cytokine 並無顯著之變化。

小柴胡湯對於HCV 感染患者之 cytokine ，具有調節之功效，因此 具有輔助減緩病患不適之功效，但在臨床上對於 HCV 感染之病患，並 無抑制HCV 病毒量(titer)的作用，因此必須在建立更有效之細胞篩選模 式，直接尋找具抑制HCV replication 能力之中藥。

表 4.2 HCV 基因型別之分析 基因型別 個案數 %

1a 1 1.7

1b 53 91.4

2a 3 5.2

2b 1 1.7

第三節 藥物細胞毒殺性分析

本 研 究 建 立 以 具 HCV replicon subgenomic containing cells 之 HCV-Huh7 細 胞 來 篩 選 具 抑 制 HCV replication 能 力 之 中 藥 ， 將 HCV-Huh7 細胞 (7×10⁶/ml)，培養 18 小時後處理藥物，經過 48 小時後，

接著以MTS 方法來進行觀察細胞內 dehydrogenase 的活性，及以顯微鏡 (Olympus, 40X) 觀測 cell morphology 以確認細胞存活率，並判定 chemicals 及 herbal medicines 是否對 HCV-Huh7 具有毒性 ( cytotoxic)。

saikosaponin A and safranin O、bromelain 具有很高之毒性，因此觀測濃 度分別僅能至25 、10 及 50 μM (表 4.4)， glycyrrhizin， paeconiflorin 及baicalein 等化學成分，則無抑制 HCV RNA 複製之功效。

表 4.3 以 小柴胡湯 (Xaio Chai Hu Tang) 處理 HCV 抗原陽性病患之 PBMC 產生 cytokine 之情形

HCV- HCV+

(n=10) (n=10) IL-1β control 302.1±69.46 570.8± 89.53 Xaio Chai Hu Tang 210.2±57.43 201.0± 72.18*¹ IFN-γ control 12.5± 8.93 62.5± 34.09 Xaio Chai Hu Tang 0.5± 1.10 48.2± 37.08 IL-6 control 412.2±50.00 925.8±192.6 Xaio Chai Hu Tang 70.4±88.19 402.7± 82.69*² TFN-α control 240.0±55.52 272.3±115.13 Xaio Chai Hu Tang 238.2±71.34 281.0± 67.43 IL-2 control 4.2± 7.12 0.1± 2.26 Xaio Chai Hu Tang 5.9± 9.06 0.5± 1.05

* : Significant Reduction (Paired-t Test: P<0.01)

1 : P =1.92x10^-6

2 : P= 1.75x10^-5

濃度為1 mg/ml 之 高三萜靈芝、多醣體靈芝及茉草與白蓮蕉之萃 取液， 則不會對 HCV-Huh7 cells 有細胞毒性，再以 MTS assay 觀察濃 度高達4， 2， 1 and 0.5 mg/ml 是否有細胞毒性 (表 4.5). 多醣體靈芝 (0.61±0.04)及白蓮蕉 (0.22±0.04)在 4 mg/ml 濃度範圍，對 HCV replicon Huh7 細胞株具有毒殺性 (圖 4.1)，而在濃度 2-0.5 mg/ml 範圍，高三萜 靈芝、粘多醣靈芝、茉草及白蓮蕉均無顯著之細胞毒殺性 (表 4.4、4.5)。

此外小柴胡湯、知母、石蓮花、薰衣草、金銀花、絞股藍、黃芩等萃取 液因無顯著之抑制HCV RNA 複製之功效，因此並未進一步觀察高濃度 之細胞毒性 (表 4.4 )。

單獨以10、100 IU/ml 之 IFN-α處理 HCV-Huh7 細胞，細胞存活率 分別為1.01±0.08 及 0.96±0.06，無顯著之細胞毒殺性，另外，若以 Ribavirin (400 μM)處理 HCV-Huh7 細胞，細胞存活率則為 1.22±0.01，若將

Ribavirin (400 μM)分別與 10，100 IU/ml IFN-α作用後之存活率為 1.19

Herbal Extract/Compound Cell Morphology MTS assay LD50

Ribavirin (400 µM) - - > 400 µM

C.asphodeloides(1 mg/ml)

granulated + 25μg/ml

C.minax(1 mg/ml) - N.D > 1 mg/ml

L.officinalis(1 mg/ml) - N.D > 1 mg/ml

L.japonica (1 mg/ml) - N.D > 1 mg/ml

G.simplicifolium (1 mg/ml) - N.D > 1 mg/ml

S.baicalensis (1 mg/ml) - N.D > 1 mg/ml

-﹕no effect; +：inhibitory effect;N.D.：not detected

LD50 (50﹪Lethal dose)：the dose required to kill 50 percent of cells.

0 0.5 1 1.5 2

0.5 1 2 4

濃度(m g/m l) 存

活 率 (

% )

高三帖靈芝 黏多醣靈芝 茉草 白蓮蕉

表 4.5 中草藥對 HCV-Huh7 細胞之細胞毒性之分析

Concentration (mg/ml) 4 2 1 0.5 Triterpenoids Enterprise 1.18 ± 0.14 1.06 ± 0.19 1.33 ± 0.04 1.27 ± 0.11 Polysaccharides Enterprise 0.61 ± 0.04 1.08 ± 0.01 0.81 ± 0.04 1.18 ± 0.02 D.caudatum 0.82 ± 0.12 0.95 ± 0.06 1.15 ± 0.17 1.33 ± 0.05 C. indica 0.22 ± 0.04 1.45 ± 0.10 1.04 ± 0.17 1.31 ± 0.12

HCV-Huh7 細胞濃度為 8x10³/ml，培養 18 小時後處理各種不同濃度 藥物，Triterpenoids Enterprise (高三萜靈芝)、Polysaccharides Enterprise (多醣體靈芝)、Desmodium caudatum (茉草)、Canna indica (白蓮蕉) (4、2 及1 及 0.5

m

g/ml)。經過 48 小時後，接著以 MTS 方法來進行觀察。以 細胞未處理藥物的存活率為 1，而處理藥物與之比較得存活率，實驗重 複三次，取其平均值。結果以mean ±SD 表示。

圖 4.1 中草藥對 HCV-Huh7 細胞之存活率之比較

表 4.6.中草藥萃取物與 IFN-α合併處理對 HCV-Huh7 細胞之細胞毒性

Concentration (mg/ml) 4 2 1 0.5 Triterpenoids Enterprise 0.50 ± 0.09 0.57 ± 0.10 0.73 ± 0.14 0.83 ± 0.06 Polysaccharides Enterprise 0.46 ± 0.03 0.68 ± 0.14 0.61 ± 0.07 0.71 ± 0.16 D.caudatum 0.68 ± 0.11 0.69 ± 0.12 0.87 ± 0.18 1.0 ± 0.15 C. indica 0.87 ± 0.18 0.78 ± 0.07 0.99 ± 0.11 0.94 ± 0.08

圖4.2 中草藥萃取物與 IFN-α合併處理對 HCV-Huh7 細胞之毒性比較

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

0.5 1 濃度(mg /ml) 2 4

存 活 率

(

%

)

高三帖靈芝 黏多醣靈芝 茉草 白蓮蕉

HCV-Huh 7 細胞濃度為 8x10³/ml，培養 18 小時後處理各種不同濃 度藥物，Triterpenoids Enterprise (高三萜靈芝)、Polysaccharides Enterprise (多醣體靈芝)、Desmodium caudatum (茉草)、Canna indica (白蓮蕉) (4、

2 、1 及 0.5

m

g/ml)，同時與 10 IU/ml 之 IFN-α 一起作用於 HCV-Huh 7 細胞。經過48 小時後，接著以 MTS 方法來進行觀察。以細胞未處理藥 物的存活率為1，而處理藥物與之比較，而處理藥物與之比較得存活率，

實驗重複三次，取其平均值。結果以mean ±SD 表示。以 IFN-α10 及 100 IU/ml 之濃度處理細胞後，細胞存活率分別為 1.01±08 及 0.96±0.06。

Rivavirin (400 μM)細胞存活率則為 1.22±0.01，Rivavirin (400 μM)分 別與10，100 IU/ml IFN-α作用後之存活率為 1.19±0.05 及 1.22±0.04。

在文檔中 抑制C型肝炎病毒之中草藥研究—以調控細胞激素分泌及病毒RNA轉錄模式; Inhibition of Hepatitis C Virus by Chinese Herbal Extracts---by the Mode of Cytokines secretion and Virus RNA Transcription (頁 31-37)