以 HCV-Huh7 細胞篩選具抑制 HCV RNA 合成能力之中草藥 為進一步研究小柴胡湯是否具抑制 HCV-RNA 能力，接著我們直接

以具有HCV replicon subgenomic DNA 之 Huh7 細胞來觀察，是否所篩 選中藥成份能直接有效抑制 HCV-cDNA 之合成。實驗結果為小柴胡湯 雖然具有調節HCV 感染之 PBMC 分泌 cytokine 能力，但並無法直接抑 制HCV-RNA 合成。

以前之研究⁷¹證實升麻葛根湯可以抑制meales virus 之複製，因此 本篇研究原先期望能從中藥複方中篩選出有抑制 HCV 複製之藥物，但 是實驗結果並未如預期顯著，以HCV-Huh7 之 cell model 中，小柴胡湯 雖然具有調節HCV 感染之 PBMC 分泌 cytokine 能力，但並無法直接抑 制HCV-RNA 合成，因此調整研究方向，將小柴胡湯成分中之單位藥，

或其他報導中較具有保肝作用的化學成份，以及具有清熱解毒等保肝功 效之民間草藥，篩選這些藥物是否具有能夠抑制 HCV-cDNA 合成之能 力，實驗結果顯示我們所篩選的化學成份，並未如預期具有直接抑制 HCV-RNA 合成的功能。然而本篇研究發現以 1 mg/ml 之高三萜靈芝，

多醣體靈芝，白蓮蕉，茉草與較低濃度 (10 IU/ml) IFN-α合併使用即可 有效抑制 HCV-Huh7 之 HCV-cDNA 合成，因此可以上述中藥成份來輔 助治療HCV 感染。而以 Real Time 分析 HCV RNA 表現情形，則可觀察 到 單 獨 使 用 1 mg/ml 白 蓮 蕉 及 茉 草 葉 即 能 有 效 抑 制 HCV-Huh7 HCV-cDNA 合成。

於實驗中所使用之 IFN-α濃度為 5-10 IU/ml，即對 HCV-Huh7 HCV-subgenomic cDNA 複 製 有 明 顯 之 抑 制 作 用 ， 與 其 他 以 HCV-subgenomic cDNA 為研究材料之結果一致^75,76，較抑制whole HCV virion 之濃度 (5,000 IU/ml)為低，原因為 HCV structural proteins 可能會 影響IFN-α之 antiviral activity。中藥口服之合理濃度為 1-10 g，因此於

細胞中之合理濃度應為100 ug/ml⁷⁷，而所使用之中藥於1 mg/ml 雖對細 胞無毒性，但因所使用之藥物為植株萃取液 (extract power from dried plant).因此相信若能進一步分析其有效成分，應可以降低使用濃度。

肝炎臨床用藥中，有效之藥物包括病毒酵素抑制劑、antisense、

oligonucleotides、ribozymes、免疫調節劑及疫苗。這些治療目的就是清 除或避免HCV RNA 產生，並且恢復肝功能，降低肝硬化、肝癌的發生。

其中以 IFN-α為最有效的治療藥物，能有效但仍無法完全清除 HCV- RNA 的表現，並有復發之可能，並且高劑量之 IFN-α病人會有較強之 副作用，且會有較大之風險，因此目前之研究方向為找尋較理想之替代 療法或藥物，目前已有報告顯示 As2O3具有抑制 HCV replication 之能 力，惟因其具有毒性 (notorious toxicities)，因此目前仍需進一步研發其 analogues ⁷⁵。

本研究在以HCV-Huh7 之 cell model 中，可觀察到以 1 mg/ml 之高 三萜靈芝，黏多靈芝，白蓮蕉，茉草葉與10n IU/ml IFN-α合併使用即 可有效清除HCV RNA 的表現，因此可以上述中藥成份來輔助治療 HCV 感染，相信能能降低 IFN-α使用之濃度，而在台灣病患在實際治療中，

亦常選擇以中藥輔助治療，因此目前正準備進行有效之中藥成份輔助 IFN-α之臨床研究，期望能降低 IFN-α之使用濃度或縮短其使用時間，

另 外 ， 亦 因 發 現 1 mg/ml 白蓮蕉及茉草葉能有效抑制 HCV-Huh7 HCV-cDNA 合成，在排除經由影響 PBMC 之分泌特定 cytokine 來影響 HCV 合成 RNA 之因素後，我們亦將進一步研究中藥有效成份，是否 經由抑制HCV-RNA replication enzyme 而達到抑制 HCV-RNA 合成。

高三萜靈芝，多醣體靈芝，茉草，白蓮蕉等植物萃取液抑制 HCV subgenomic replicon 複製之機制目前仍未知，目前僅知並非經由調控 RNA-dependent RNA polymerase 或 引 發 氧 化 機 制 (induce reactive oxygen species，unpublished observations). 研究報告顯示 HCV 之致病原 因與 CD8+ HCV-specific killer T lymphocytes 之不正常分泌有關 ^{5，6，22，}

29並可能引發TNF-α , IFN　 -γ , GM　 -CSF, IL-8 or IL-10 ^5，6之不正常分 泌。HCV 感染之疾病引發及病毒之殘存，T cell 去活化 (ineffectiv)或非 特異性活化 (non-specific activation)可能扮演極重要之角色，因此觀測感

染HCV 病患 PBMCs 之 cytokine 仍極有意義， 雖然 Xiao Chai Hu Tang 並 不會抑制HCV subgenomic RNA 複製， 而以高三萜靈芝，多醣體靈芝，

茉草，白蓮蕉萃取液處理過之HCV 感染病患之 PBMC cytokine 並無明 顯之變化， 顯示上述萃取液抑制 HCV subgenomic replicon 之複製並不 是經由調控cytokine 之分泌。

文獻報告顯示濃度為5000 IU/ml IFN-α 在抑制整個 HCV genome 之複製，效果比抑制部分HCV genome (subgenomic HCV RNA)⁷⁵差，係 因 HCV structure protein 會干擾 IFN-α之作用，在本篇研究中以 5-100 IU/ml IFN- α 觀 測 到 subgenomic HCV RNA 之 複 製 現 象 為 dose-dependent inhibition， 100 IU/ml 之濃度即達相當明顯之抑制，濃 度為 1 mg/ml 之 高三萜靈芝，多醣體靈芝，茉草，白蓮蕉萃取液，與 10 IU/ml IFN-α合併處理，即能加強抗 HCV (anti-HCV) 之能力。濃度 為 1 mg/ml 之 高三萜靈芝，多醣體靈芝，茉草，白蓮蕉萃取液，並不 具有細胞毒性，僅高三萜靈芝多醣體靈芝在與IFN-α合併使用時會發生 低於 75% 之細胞毒性，因此於臨床使用時應考慮高劑量會引發 side effects 。自高三萜靈芝，多醣體靈芝，茉草，白蓮蕉萃取液中分析及純 化 具抗 HCV 之有效成份，將會是本研究未來發展方向。