抑制C型肝炎病毒之中草藥研究—以調控細胞激素分泌及病毒RNA轉錄模式; Inhibition of Hepatitis C Virus by Chinese Herbal Extracts---by the Mode of Cytokines secretion and Virus RNA Transcription

全文

(1)中國醫藥大學中國醫學研究所博士論文. 指導教授：陳榮洲教授共同指導教授：林昭庚教授. 論文題目. 抑制 C 型肝炎病毒之中草藥研究—以調控細胞激素分泌及病毒 RNA 轉錄模式 Inhibition of Hepatitis C Virus by Chinese Herbal Extracts---by the Mode of Cytokines secretion and Virus RNA Transcription. 研究生：黃上邦. 中華民國. 97 年. i. 7 月. 25 日.

(2) ii.

(3) iii.

(4) 目. 錄. 第一章. 前言………………………………………………………… 1. 第二章. 文獻探討…………………………………………………… 2. 第一節. 流行病學研究………………………………………… 2. 第二節. C 型肝炎病毒基因體簡介 …………………………… 2. 第三節. 感染 HCV 患者 cytokine 分泌情形………………… 3. 第四節. 臨床治療現況………………………………………… 4. 第五節. HCV 中醫文獻記載…………………………………… 4. 第六節. 中草藥一般功效簡介………………………………… 7. 第七節. 中草藥抗 HCV 現代研究……………………………… 10. 第三章. 材料和方法………………………………………………… 11. 第一節. 中藥濃縮劑熱水萃取液之製備……………………… 11. ㄧ、小柴胡湯的備製………………………………………… 11 二、中藥萃取物及化學成份的備製……………………… 11 第二節. 細胞培養及備製……………………………………… 12. ㄧ、人類周邊血液單核細胞之製備………………………… 12 二、HCV-Huh7 細胞培養…………………………………… 13 三、繼代培養……………………………………………… 13 四、冷凍細胞……………………………………………… 13 五、解凍細胞……………………………………………… 14 第三節. 實驗方法……………………………………………… 14. ㄧ、細胞激素之測量……………………………………… 14 二、HCV 基因型分析………………………………………… 14 三、反轉錄酶-聚合酶連鎖反應(PCR) …………………… 16 四、凝膠菜瓊脂電泳分析…………………………………… 17 五、定量 PCR………………………………………………… 18 六、細胞毒性測試…………………………………………… 19 七、細胞存活計數…………………………………………… 20 第四節. 藥品試劑……………………………………………… 20 iv.

(5) 第五節. 實驗設備……………………………………………… 21. 第六節. 統計分析……………………………………………… 22. 第四章. 結果………………………………………………………… 23. 第一節. HCV 基因型別探討 …………………………………… 23. 第二節. 小柴胡湯對細胞激素分泌之影響…………………… 23. 第三節. 藥物細胞毒殺性分析………………………………… 24. 第四節. RT-PCR 分析中藥對 HCV 複製之影響………………… 29. 第五章. 討論………………………………………………………… 36. 第一節. HCV 高染率探討 ……………………………………… 36. 第二節. HCV 致病因子探討 …………………………………… 36. 第三節. 小柴胡湯選擇性的調節 cytokine 分泌……………… 37. 第四節. 以 HCV-Huh7 細胞篩選具抑制 HCV-RNA 合成能力之中草藥……………………………………………… 38. 第六章. 結論………………………………………………………… 41. 參考資料……………………………………………………………… 42 英文摘要……………………………………………………………… 49 謝辭…………………………………………………………………… 51. v.

(6) 圖目錄圖 3.1 具 HCV (genotype 1b) subgenomic DNA 質體備製…………. 12. 圖 3.2 DNA 序列分析之引子與探針之設計…………………………. 15. 圖 4.1 中草藥對 HCV-Huh7 細胞之存活率之比較…………………. 27. 圖 4.2 中草藥萃取物與 IFN-α合併處理對 HCV-Huh7 細胞之毒性比較……………………………………………………………. 28. 圖 4.3 具有抑制 HCV subgenomic replicon 複製能力之中草藥分析具有 HCV subgenomic replicon 之 Huh7 細胞(7×106/ml)，以化學成分 saikosaponin C，glycyrrhizin， paeconiflorin 或 Baicalein 處理…………………………………………………. 30. 圖 4.4 HCV-Huh7 以化學成分 saikosaponin C，glycyrrhizin， paeconiflorin，Baicalein 或 Bromelain 與 10 IU/ml INF-α 合併處理…………………………………………………. 30. 圖 4.5 HCV-Huh7 以標示之中草藥萃取物與 10 IU/ml INF-α 合併處理……………………………………………………. 31. 圖 4.6 具有抑制 HCV subgenomic replicon 複製能力之中草藥與 INF-α 合併處理分析處理……………………………………. 32. 圖 4.7 HCV-Huh 細胞以中草藥萃取液處理後分析 real-time PCR…. 34. vi.

(7) 表目錄 Table 4.1 某中部沿海地區 C 型肝炎抗原陽性率分析………………… 23 Table 4.2 HCV 基因型別之分析………………………………………… 24 Table 4.3 以小柴胡湯(Xaio Chai Hu Tang) 處理 HCV 抗原陽性病患之 PBMC 產生 cytokine 之情形……………………… 25 Table 4.4 中草藥及化學成分對 HCV-Huh-7 細胞之細胞毒性之影響…………………………………………………………… 26 Table 4.5 中草藥對 HCV-Huh7 細胞之細胞毒性之分析………… 27 Table 4.6 中草藥萃取物與 IFN-α合併處理對 HCV-Huh7 細胞之細胞毒性…………………………………………………………… 28 Table 4.7 中草藥及化學成分對 HCV-Huh7 細胞 HCV RNA 複製能力及與 IFN-α合併處理之影響………………………………… 35. vii.

(8) 抑制 C 型肝炎病毒之中草藥研究— 以調控細胞激素分泌及病毒 RNA 轉錄模式研究生：黃上邦指導教授：陳榮洲中國醫藥大學. 教. 授. 中國醫學研究所. C 型肝炎病毒 (Heptitis C virus)在台灣陽性抗體比率為 2%，但沿海地區某些鄉鎮則有很高的陽性比率 (32.0%)，感染後會導致慢性肝炎及肝癌，目前主要之治療為注射 IFN-α，但是 IFN-α並不能完全除去被感染的人體中的病毒，並且在臨床治療時發現已有很多病人，尤其病毒之基因型別為 1b，對 IFN-α 之治療具有抗性，在台灣沿海地區之感染者篩檢中發現，感染 1b 病毒類型的比率 91.4%，因此篩選出取代 IFN-α 之抗病毒藥物，是目前非常急迫之事。在本研究中，我們證明小柴胡湯透過 cytokine 之分泌而影響人體抗病毒之機制。我們初步結果證實小柴胡湯，能有選擇性的調節人類周圍淋巴細胞分泌 cytokine，並藉由 T-helper cells-1 (Th-1) 之反應以減輕肝炎之發炎症狀，然而小柴胡湯並不能有效的抑制病毒之複製。本研究期望能藉由 HCV Huh7 (Huh7 細胞具具複製起始點但除去結構蛋白基因之 HCV 部分基因體) 細胞來篩選出具 HCV 部分基因體療效且較無副作用之中藥，以取代或輔助目前臨床的用藥，結果顯示濃度為 1 mg/ml 的白蓮蕉及茉草之熱水萃取物有顯著之抗病毒能力。若單獨以 IFN-α處理上述之細胞則濃度需 100 IU/ml 才達最高之抑制能力，但若同時加入 1 mg/ml 濃度之高三帖靈芝、多醣體靈芝、白蓮蕉及茉草葉之熱水萃取物，則 IFN-α只需 10 IU/ml 就能達最高之抑制能力。因此認為 1 mg/ml 之白蓮蕉及茉草葉具有抗病毒之潛力，高三帖靈芝、多醣體靈芝、白蓮蕉及茉草則具有可與 IFN-α合併使用，以降低 IFN-α使用量之潛力，目前正進一步分析其有效成分及抗病毒之機制。關鍵字︰C 型肝炎病毒、小柴胡湯、周邊單核淋巴細胞、細胞激素、抗病毒藥劑、高三帖靈芝、多醣體靈芝、茉草、白蓮蕉. 1.

(9) 第一章. 前言. 在台灣的人口中，HCV 感染陽性抗體比率為 2%，而在中部沿海地區和南台灣感染的比率更高達 32.0%，在台灣沿海地區之感染者篩檢中發現，感染 1b 病毒類型的比率 91.4%，而基因型別為 1b，對 IFN-α 之治療具有較強之抗性，因此篩選出取代 IFN-α之抗病毒藥物，是目前非常急迫之事。但目前仍無理想之藥物可完全替代 IFN-α，可直接抑制 HCV 之複製，目前已證實 HCV 的致病力與 CD8+ HCV 特異性殺手 T 淋巴細胞不正常分泌細胞激素有關，因此經由觀察是否有中藥成份能影響感染者 PBMC 之細胞激素分泌狀態，進而達到治療之目的；另外也選取在民間用於消炎解熱抑制發炎功效之中草藥及化學成分，期望能藉由直接觀察病毒複製能力被抑制之情形，即藉由觀察 HCV Huh7 (Huh7 細胞具具複製起始點但除去結構蛋白基因之 HCV 部分基因體) 細胞之 RNA 複製能力，來篩選出具療效且較無副作用中藥，以取代或輔助目前臨床的用藥 IFN-α。. 1.

(10) 第二章文獻探討第一節. 流行病學研究. C 型肝炎是由 RNA 病毒感染而引起的 1，其感染途徑是由血媒傳染 2。通常在感染初期並無明顯症狀 3，僅有勞累、關節疼痛等 4。約有 85%的 C 肝患者在血清中可測出 HCV-RNA，大部份的患者血清中 aminotransferase 的濃度亦會增加，約有 50~70%的慢性感染者有肝功能異常的現象，5%患者可能導致肝癌發生。目前已證實 HCV 的致病力與 CD8+ HCV 特異性殺手 T 淋巴細胞 (CTL)不正常分泌細胞激素如 TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-8 及 IL-10 有關 5 ,6。根據美國疾病管制中心的統計，美國每年約有三萬新增感染案例，有 8000~10000 人死於 C 肝感染，死亡率高於 AIDS，且有逐年升高趨勢，依據世界衛生組織的報導，全世界約有 170 億的人感染 HCV7。 HCV 在臺灣的感染率極高，且因為 HCV 基因變異極大，HCV 的基因型(genotype) 分為六大型，共 11 個分型 13-15，以目前所得數據顯示，中部地區 C 型肝炎患者所攜帶之 HCV 基因型，大部分為 1b，其次為 2a，再其次則為 1a 與 2a，並無發現其他型別。基因型別不同，致病之程度及抗藥性亦有所不同，1b 對 IFN-α 之治療有較明顯之抗性 16-20。目前並無可以使用之疫苗。依據衛生署統計資料，臺灣地區一般成人 HCV 抗體陽性率約為 1.2%，局部地區達 20%，C 型肝炎總發生率為 3%。臺灣沿海地區 HCV 抗體陽性率可高達 35%，並且有顯著比率之患者為 HCV 及 HBV 合併感染，對於 C 型肝炎的研究，更具獨特性與急迫性。第二節. C 型肝炎病毒基因體簡介. HCV 為 Flaviviridae family，屬 hepacivirus，其 RNA 基因體約 9.5 Kb，其中有一個 open reading frame (ORF)，可製造出約 3000 個胺基酸多蛋白 (polyprotein)。該蛋白質由結構蛋白質（Core， E1， E2，p7）和非結構蛋白質（NS2， NS3， NS4A， NS4B，NSSA， NS5B）組成核心蛋白質 (core protein)，為 HCV 核殼體蛋白質 (nucleocapsid)的主要成分，核心蛋白質可與許多宿主蛋白質進行交互作用，進而影響宿主. 2.

(11) 細胞功能。套膜蛋白質 (E1，E2)構成病毒外套膜。NS2 蛋白質可切割 NS2/NS3 連接處。 NS3 蛋白質切割 NS3/NS4A ， NS4A/NS4B ， NS4B/NS5A，NS5A/NS5B 等交接處。NS4A， NS4B 蛋白質功能不明。 NS5A 蛋白質與 IFN-α的抗藥性有關。NS5B 蛋白質為 RNA-dependent RNA polymerase，參與 HCV 病毒複製 8-12。目前對於 HCV 研究的最大困境，在於缺乏有效而長久的細胞培養系統，造成至今對於 HCV 之感染過程、複製過程、病毒體合成等致病機轉仍未能透徹了解。HCV 感染肝細胞只能觀察到低程度的病毒複製，本研究使用 subgenomic replicon 模式研究 HCV 複製，因帶有 HCV 5’端非轉譯區、IRES、結構蛋白質（Core, E1, E2,p7）、非結構蛋白質 (NS2、 NS3、NS4A、NS4B、NSSA、NS5B)的 RNA 及 HCV 3’端非轉譯區的 subgenomic replicon，經過轉染至人類肝癌細胞株 Huh7，並經 G418 選擇後可得到帶有 replicon 的細胞株，可進行持續的病毒基因體複製 21。第三節. 感染 HCV 患者 cytokine 分泌情形. 於慢性 HCV 感染患者體內，cytokine 不平衡可能為致病因子之ㄧ，並且非特異性的 T cell 活化，亦可能在病毒的持續和疾病發展中扮演重要的角色。HCV antigen-non-specific Th-2 cells 可能支配 cytokine 分泌機制，並引起持續性的免疫放大反應，甚至引起全身性作用 22。因此透過 immunotherapeutic 之作用 (例如 IFN-α，ribavirin 和草本植物的藥物) 調節免疫反應，可以有助於避免在 HCV 感染時，為清除病毒顆粒，而導致大量肝組織的損壞。因此，監控純化自慢性 HCV 病患 PBMC 的 cytokine 濃度變化可能有參考價值，並且可在治療 HCV 感染過程中，評估不同的治療模式之療效。至今 HCV 之致病因子並未有全面性的瞭解，藉由基因晶片觀察未感染及已感染 HCV 之組織檢體，發現於不同的基因表現圖譜(profile)，涉及的具調控功能的基因種類涵括：(1)、免疫反應(2)、細胞附著(3)、細胞增生(4)、蛋白質合成(5)、DNA 複製(6)、細胞凋零(7)、訊息傳遞(8)、其他等 23。. 3.

(12) 第四節. 臨床治療現況. 目前 HCV 的臨床治療，以 IFN-α 為主，劑量一般為每次 3 IU，每星期注射三次，療程約 6 至 12 個月 24-26，目前更積極的治療，則有 IFNα與 Ribavirin (RBV)合併使用，RBV 用量每日 1.2 g，用藥時間配合干擾素。除了治療成功率多半僅有 25-50%外，很不幸地，大約一半的病患又會復發. 27,28. ，另外一個治療上的瓶頸在於藥物的副作用，IFN-α的. 副作用如發熱、嘔吐、頭痛、泄痢、情緒不穩，抵抗力減弱，血壓不正常，白血球數目下降，自體免疫反應等。RBV 則會引起溶血性貧血. 29. 等副作用，這些副作用常導致患者無法持續療程，或需減低劑量。為改善用藥濃度大幅波動所造成的較大副作用與可能之病毒逃脫，目前包含臺灣在內的世界各國正積極進行利用如 pegylated IFN-α等緩慢持續釋放之干擾素與 RBV 合併使用之臨床試驗 28,30。第五節、HCV 中醫文獻記載一、病因病機的認識中醫目前尚無統一認識，李乾溝 31 認為導致Ｃ型肝炎發生的病機病因，歸納起來，有以下 4 種學說︰ 1、脾氣虧虛學說︰“邪之所凑，其氣必虛＂。人體正氣虧虛，方會感染 HCV。當人們腑臟氣血虧虛，脾胃虛弱，肝陰不足，肝腎陰虛，脾腎陰虛時，往往正不抗邪，一旦 HCV 侵入人體，阻遏虛弱，會使臟腑氣血功能紊亂而致病。 2、陰邪濕毒學說︰HCV 傳播方式為垂直傳播及水平傳播。主要以血液針刺注射途徑侵入人體，毒邪直入營血，但臨床觀察未見斑疹、舌質紅絳、神昏譫語、耗血動血等營血熱證，表明病邪為陰毒濕邪，重濁粘滯，阻遏氣機，最先困脾，使脾陽不振，運化失權，濕聚生痰導致脾氣不升，胃氣不降，肝氣不泄。肝鬱氣滯、濕阻痰聚、瘀血阻絡，從而形成毒、瘀、痰、濕交阻的病機。 3、濕熱毒邪學說︰縱觀現在中醫藥治療肝病的文獻，多數作者仍認為 HCV 為濕熱毒邪。濕熱毒邪直入血分，留滯血脈，久聚肝體，內蘊成痰，停滯成瘀，濕熱久蘊，耗損陰津，終易成為“血熱毒邪內蘊. 4.

(13) 之實，肝腎陰液虧耗之虛＂的虛寒夾雜證。 4、痰濕瘀血學說︰飲食不節，損傷脾胃，或情志失調，鬱怒傷肝，肝旺犯胃 (脾)，脾胃虛弱，運化失職，水化生濕，濕聚生痰。肝鬱氣滯則血亦滯，血滯則停聚成瘀。痰、濕、瘀既是Ｃ肝的致病因素，又是病程中的病理產物，是其病機所在。這種痰瘀相關現象是對Ｃ肝病理狀態下血液的濃、粘、凝、聚的高度概括。上述可見濕邪貫穿Ｃ型肝炎的始終，其病程雖有 4 種學說，而引起Ｃ肝的病機是相同的，只是發病部位的深淺不同，以及急性慢性發病差異而已。二、臨床特點Ｃ型肝炎的臨床表現與Ｂ肝相似，但症狀較輕。唐智敏 32 等認為有不同程度的倦怠乏力，噁心欲吐，納差厭油，脘腹脹滿，大便異常，小便黃少，脇肋脹痛，或有肝脾腫大，手掌紅斑，血痔赤縷，面色晦暗等症狀和體證。Ｃ肝患者年紀較大，多有輸血史，瘀血阻絡證較多，顯示慢性Ｃ肝的臨床特點為慢性持續性肝細胞損傷，肝纖維化。治療宜清肝涼血泄毒，在扶正祛邪的同時，尤應注意用活血化瘀通絡法。三、治療 1、治則與治法︰任進余等 33 綜述了中醫藥對Ｃ肝的治則與治法。 1.1、以陰邪瘀毒論治，採用益氣溫陽活血解毒法為主 HCV 感染為陰邪侵襲，陰邪易傷氣礙陽，Ｃ肝久病及腎，可使推動溫煦無力，滋潤不足，治宜益氣溫陽。可選用小劑量溫補脾腎藥如仙茅、仙靈脾、巴戟天、肉桂、乾薑和大劑量益氣健脾藥如黃耆、黨參、白朮、茯苓、甘草。HCV 多因輸血、輸血製品直接入血分，應重用血分藥物。因其性質陰凝毒聚，治宜活血解毒。可選擇有解毒與活血雙重作用的藥物如虎杖、紫草、白花蛇舌草、赤芍、丹皮。王靈台等自擬補腎沖劑 (巴戟天、肉蓯蓉、仙靈脾、菟絲子、枸杞子、黨參、生地、桑寄生、虎杖、丹參、青皮) 清肝沖劑 (黃芩、柴胡、猫人參、劉寄奴)治療Ｃ肝 54 例，症狀積分分別由 13.75±6.3 和 13.83±7.5 5.

(14) 降至 2.4±3.95、3.82±5.95 (P＜0.05)；肝血清生化指標谷丙轉氨酶 (ALT)、谷草轉氨酶 (AST)均明顯下降，下降率分別為 88.8%和 88.2%;總蛋白和白蛋白明顯回升 (P＜0.05)，表明補腎、清肝具有顯著的保肝降酶，促進肝臟蛋白合成，升高血清白蛋白水平的作用 34。 1.2、以肝鬱痰濕論治，採用舒肝健脾、祛濕化瘀法為主Ｃ肝多在素體脾胃虛弱的基礎上，加上情志失調、肝氣鬱結，治宜舒肝健脾，選用太子參、白朮、茯苓、柴胡、鬱金、香附、青皮;脾虛失運，水化為濕，濕聚成痰，治宜祛濕化痰，藥選陳皮、半夏、昆布、海藻。岡部和彥用小柴胡湯治療慢性Ｃ肝 24 例，有效率為 45.3%。故認為小柴胡湯治療慢性Ｃ肝有一定的臨床價值 35。 1.3、以濕熱瘀毒論治，採用清熱利濕、化瘀解毒法為主疫毒之邪直入營血，毒瘀肝體，濕熱蘊阻脈絡，治宜清熱利濕，化瘀解毒，選用大黃、連翹、蒲公英、梔子、黃芩、茵陳、虎杖、水牛角、丹參、丹皮、赤芍等。用自擬赤白桃虎湯 (赤芍、白花蛇舌草、桃仁、虎杖、丹參、薏苡仁、茯苓、水牛角、大黃、柴胡、甘草) 治療慢性Ｃ型肝炎 27 例，痊癒 5 例，險效 8 例，有效 6 例，總有效率 70%36。 2、辨證治療Ｃ肝︰慢性Ｃ型肝炎與慢性Ｂ型肝炎臨床表現相似，辯證分型標準也基本一致，一般臨床上分為 5 個證型來辨證論治。對 108 例Ｃ肝辨證分型結果，屬肝鬱脾虛證 9 例 (佔 8.53%)、脾腎陽虛證 12 例 (佔 11.11%)、濕熱中阻證 16 例 (佔 14.81%)、肝腎陰虛證 16 例 (佔 14.81%)、瘀血阻絡證 34 例 (佔 31.48%)37。 2.1、肝鬱脾虛證. 治宜健脾舒肝法為主。. 用小柴胡湯加冬蟲夏草、紫草、蚤休治療Ｃ肝 56 例，2 個月為 1 個療程，基本治癒 34 例，好轉 12 例，總有效率為 82.1%38。 2.2、濕熱中阻證孫明輝. 39. 治宜清熱利濕法為主。. 用丙肝煎 (虎杖、白花蛇舌草、蒲公英、敗醬草、板 6.

(15) 藍根、黃柏、山茱萸、木瓜、丹皮、赤芍、丹參、川芎、當歸、穿山甲、陳皮、猪苓、茯苓、薏苡仁、枳殼、甘草)治療慢性Ｃ肝 48 例，3 個月為 1 個療程，總有效率為 85%，對肝功能正常、抗-HCV 陰轉者進行隨訪半年未復發者 23 例 (佔 47.8%)。 2.3、脾腎陽虛證. 治療溫補脾腎為主。. 用補腎沖劑治療Ｃ肝基本上屬於這一證型。 2.4、肝腎陰虛證. 治宜以滋補肝腎法為主。. 用丙肝湯 (生黃耆、枸杞子、五味子、女貞子、白花蛇舌草、雙花、連翹、虎杖、苦參、茵陳、柴胡、甘草) 治療慢性Ｃ肝 46 例，連續服藥 3~6 個月，近期治癒 35 例 (76%患者 ALT 恢復正常，抗-HCV、HCV、RNA 陰轉)40。 2.5、瘀血阻絡證. 治宜以活血通絡法為主。. 仿清營湯以擬清退方 (丹參、丹皮、赤芍、山楂、柴胡、梔子、蒲公英)治療慢性Ｃ肝 128 例，並隨證加減，3 個月為 1 個療程， ALT 復發 83.6%，抗-HCV 轉陰 55.5%，治癒 69 例，治癒率達 53.9%41。第六節. 中草藥一般功效簡介 (大陸研究). 1. Xaio Chai Hu Tang (小柴胡湯) 具有增強免疫功能，小柴胡湯 100 mg/kg 可使小鼠 NK 細胞活性增加，200 mg/kg 可使 NK 細胞活性受到抑制 42,43。可增強 LAK 細胞 (細胞因子激活的殺手細胞) 的活性. 44. ，能激活小鼠體內的巨噬細胞，其. 吞噬能力顯著增強 45,46，明顯增強 cytokine 分泌之活性 47。 2. Ganoderma lucidum Karst. (靈芝) 靈芝屬真菌，又名靈芝草、瑞草，全株均可入藥。成分含多醣體、有機鍺。增強細胞免疫功能及具有抗腫瘤免疫作用，有益氣血，補腦髄，養心安神，止咳平喘之功效，靈芝含有很多 bioactive components，子實體及細胞培養懸浮液之成分中具有多醣體 (polysaccharides)及三萜類 ( triterpenes)，目前文獻報導其子實體中多醣體具有抗腫瘤之功效. (Antitumor-active polysaccharides)48 。三萜類則具有抗氧化. 7.

(16) (antioxidative)49,50 ，穩定膽固醇. (cholesterol stasis)51 及保肝. (hepatoprotective)52 之功效。 3. Canna indica (白蓮蕉) 又稱美人蕉、曇華，為多年生草本，高約一至二公尺左右，莖圓柱形，節上生葉，葉互生，長橢圓形，總狀花序，頂生各種顏色花，以花色分為紅花曇華、黃花曇華、白花曇華等三種，蒴果白綠色，成熟後變為黑褐色，整株可以入藥。民間用來治急性黃疸型傳染性肝炎，肝病黃疸，子宮癌，痔瘡，小兒白濁，白帶，跌打損傷。白蓮蕉主治肝病、肝炎、黃疸症、瘰癘、喉嚨痛、高血壓、各種癌症配藥，花可治外傷、美顏色 53。 4. Desmodium caudatum (Thunb.) (茉草) 又叫小槐花、抹草、鬼仔豆。3 出複葉，頂生小葉披針形或闊葉披針形，側生小葉較小，頂部漸狹呈急尖或短漸尖，基部楔形，兩面被毛；葉柄扁；托葉披針形線形。總狀花序腋生；花綠白色；子房在縫線處密被絹狀毛。苦、甘、涼可清熱解毒、利濕消食、退胃腸火、止咳散瘀、治肺疾、肺結核、水腫、小兒疳積、跌打損傷、胃潰瘍等。外用適量，煎洗、搗敷或研末撒 53。 5. Anemarrhena asphodeloides Bunge (知母) 屬百合科植物，具抗病原微生物及抗炎、抗衰老，並有清熱瀉火，生津潤燥之功效，治療高熱煩渴、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、盜汗、內熱消渴、腎火亢盛、口腔及咽喉炎、消渴、腸燥便秘等諸症，其功效有解熱、抗菌、鎮靜、祛痰等。同時又可預防老年痴呆、改善認知學習功能；而大劑量的知母浸膏濾液，靜脈注射至家兔，會產生呼吸停止、血壓下降而死，具有毒性 54-56。 6.Caesalpinia minax Hance (石蓮花) 又稱風車草，石蓮，石蓮草，岩松，岩蓮花等名稱，具有治療肝炎，肝硬化，高血壓，慢性潰瘍，痔瘡出血，虛寒，燙火傷等，全草主治跌打損傷，喉炎，熱癤等症，對於濕熱型 (急性且發熱，臉黃，尿黃赤) 的肝炎具有清熱解毒之效，對於口臭、口苦、便秘有消除作用，並有減緩肝毒、急性慢性肝炎、肝硬化、預防肝癌及幫助肝機能 8.

(17) 新陳代謝等 53。 7.Lavandula officinalis (薰衣草) 半灌木或矮灌木，高約 50~70 公分。莖分枝，被星狀絨毛，在幼嫩部分較密；老枝暗褐色，皮層作條狀剝落，具有長的花枝及短的更新枝。一般功效為其精油有殺菌、鎮靜及止痛作用，可治療昆蟲咬傷；治頭痛，放鬆精神，抗憂鬱，助消化，抗痙攣，燙傷，且清熱解毒，散風止癢。有研究報告證實它具有抗菌作用，所以常被用於治療呼吸系統的感染。以其茶飲或酊劑內服，可用來解毒、放鬆精神、幫助消化，以治療消化不良、失眠、焦慮和緊張 57,58。 8.Lonicera japonica Thunb (Caprifoliaceae) (金銀花) 屬冬科植物忍冬、具有清熱解毒，涼散風熱之功效。主治癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱血毒痢，風熱感冒，溫病發熱，金銀花中分離出的三萜類化合物對小鼠肝損傷有明顯的保護作用. 59,60. 。並可保持口腔. 黏膜濕潤，減少刺激和疼痛；同時甘草的調和作用可使兩藥的抑菌、抗病毒及解熱等功效得到充分發揮，促進潰瘍癒合 61。 9. Gynosremma simlicafolium Blume (cucurbitaceae) (絞股藍) 屬葫蘆科植物，學名絞股藍，中藥名為七葉膽，在我國被譽為〝南方人蔘〞。在日本和東南亞地區被稱為〝福音草〞。臨床證實，絞股藍不但對於人體有滋補、鎮靜、催眠、抗緊張、促食慾、降血脂、降膽固醇、降轉氨酶、延緩衰老等作用，還能防止正常細胞癌化 62。是一種藥用、食用同源的植物，具有治療和滋補的雙重作用，是人蔘的替代品，絞股藍主成分為皂苷，約 80 餘種，其中 6 種皂苷與人參所含的皂苷完全相同，根莖或全草對消炎解毒，止咳祛痰、肝癌、子宮癌、肺癌及黑色素瘤的增殖有顯著抑制作用。在病理切片顯示，絞股藍皂苷對肝細胞空泡變性、炎性浸潤、壞死等均有明顯保護作用，並能促進肝細胞再生 63,64。 10. Scutellaria baicalensis Georgi (Lamiaceae) (黃芩) 黃芩，屬唇形科植物的乾燥根。可鎮靜神經和滋補強身，治療癲癇和狂牛症；黃疸，瀉火解毒，清熱燥濕，血熱吐衂，痛腫瘡毒，胎動不安。對 B 型肝炎病毒 (HBV)DNA 合成均有抑制作用 65，乙酸 9.

(18) 乙酯萃取物和正丁醇萃取物均可使損傷的肝細胞恢復功能 66-68。第七節. 中草藥抗 HCV 現代研究. 有研究證實靈芝在肝病之治療中具有抗發炎反應 (anti-inflammatory effects on hepatitis) 之療效 69，純化自甘菊之化學成分 parthenolide 在濃度 2.21 μM 時，於 in vitro 之實驗中證實具有減低 HCV 病毒 50% 複製之能力. 70. 。黃芩則可以使感染 HCV 之病患血中. 71. aminotransferase 恢復正常。但目前仍無理想之藥物可完全替代 IFN-α，可直接抑制 HCV 之複製，本研究選取在民間用於消炎解熱抑制發炎功效之中草藥：知母、金銀花、黃芩、絞股藍、石蓮花、薰衣草、茉草及白蓮蕉及化學成分： Saikosaponin A, Saikosaponin C, glycyrrhizin, paeconiflorin and baicalein safranin O 及 bromelain，期望能藉由具 HCV subgenomic RNA 之細胞株 Huh720,21 來篩選出具療效且較無副作用中藥，以取代或輔助目前臨床的用藥 IFN-α。. 10.

(19) 第三章第一節. 材料和方法. 中藥濃縮劑熱水萃取液之製備：. ㄧ、小柴胡湯的備製小柴胡湯濃縮劑乃勝昌製藥公司濃縮方法製成，過程包括：秤量、粉碎、過篩、提煉、過濾、濃縮及乾燥等標準步驟濃縮而成。每 15 公克小柴胡湯包含下列成分︰柴胡 (Bupleuri Radix) 5.22 gms; 黃芩 (Scutellariae Radix) 1.95 gms; 人參 (Ginseng Radix) 1.95 gms; 甘草 (Glycyrrhizae Radix) 1.95 gms; 半夏 (Pinelliae Tuber) 1.635 gms; 生薑 (Ginger) 1.95 gms; 和大棗 (Ziziphus Fructus) 0.345 gms。將濃縮劑以蒸餾水泡製成 500 mg/ml 之懸浮液，使用時用以培養基稀釋成 5000μg/ml、500 μg/ml 及 100 μg/ml，並以振動器 (Shaker) 振動 overnight。再將此懸浮液煮沸 10 分鐘後，離心 3000 rpm，15 分鐘，收上清液，備用。二、中藥萃取物 (herbal extracts)及化學成分 (chemical compounds) 的備製 1、化學成分 Saikosaponin A, Saikosaponin C, glycyrrhizin, paeconiflorin and baicalein 購自 Yoneyama Co. (Tokyo, Japan). safranin O, bromelain 購自 Sigma (St. Louis, MO). 將這些化學成分溶解於 DMSO 溶液中. IFN-α購自 PBL Biomedical Laboratories (NJ, USA). 2、靈芝 G. tsugae Murr. (Aphyllophoromycetideae) 由 Double Crane Group, Yung-Kien Industry Corp., Taiwan, R.O.C.提供兩種商品-高三萜靈芝及粘多醣靈芝(Triterpenoids Enterprise (Shuang Hor LingzhiR) and Polysaccharides Enterprise (Shuang Hor Supreme LingzhiR)) 其配方為以靈芝菌絲體 mycelia 及子實體 fruiting bodies 之乾燥粉末以一定比例混合後保存於室溫，Triterpenoids Enterprise. 11.

(20) (Shuang Hor LingzhiR) and Polysaccharides Enterprise (Shuang Hor Supreme LingzhiR). 高三萜靈芝及粘多醣靈芝則因其較多之成分而命名。 3、民間草藥知母、金銀花、黃芩、絞股藍、石蓮花、薰衣草、茉草及白蓮蕉由陳榮洲教授實驗室代購. 葉部先乾燥處理打成粉末後，再取粉末溶於二次水 (100 mg/ml)，經高溫高壓滅菌 10 分鐘，離心 3000 rpm (Beckman JA-14 rotor)，10 mins 取上清液。 IFN-α ( PBL Biomedical Laboratories ) 溶於含 0.1% BSA 的 PBS 溶液中，分別給予 10 IU/ml，100 IU/ml。第二節. 細胞培養及備製. 一、人類周邊血液單核細胞（Human PBMC）之製備 PBMC 之製備為將血液裝入 100 ml 的血清瓶,加入 50 ml 之 PBS 溶液 (Gibco)，加入 20 ml 之 Ficoll Paque (Pharmacua)，離心 1400 rpm，25 mins，取中層 15 ml，加入 50 ml PBS (wash)以去除 Ficoll Paque，離心 1000 rpm，10 mins 二次後，收集沉澱物，加 1 ml PBS (溶解)，90% FCS，10% DMSO (Dimethyl Sulfoxid)，分裝成 1 ml (vial)，-800C；overnight。移至 liquid nitrogen，計算細胞數目約 2x104/ml 備用。 HCV 之部分 DNA 序列(Genbank accession No. AJ242652，圖 3.1) ，以 polymerase chain reaction (PCR)方式取得，並將之黏合 DNA. (ligation) 於 pUC19 plasmid vector 上 (具 T7 promoter)，最後. 以 sequencing 確認 DNA 順序。. 圖 3.1. 具 HCV (genotype 1b) subgenomic DNA 質體備製. 12.

(21) 二、HCV-Huh7 細胞培養 (cell culture) HCV-Huh7 細胞株，內含 HCV subgenomic 複製子的人類肝癌細胞株 Huh7，由南加大歐健雄教授慨贈 11。細胞培養於含有 10% FBS，0.37% sodium bicarbonate，2 mM L-glutamine 和 100 U/ ml ampicillin 含有 800 μg/ml 的 G418 抗生素之 DMEM 培養液。將細胞株置放於含有 5% CO2 的 37℃恆溫培養箱內培養，每二天更換一次新鮮的培養液。約二～三天繼代培養。三、繼代培養 (passage) 首先將培養皿中舊的細胞培養液吸出，加入 10 ml phosphate buffer saline (PBS，0.2 g/L KCl、0.2 g/L K2HPO4、8 g/L NaCl、2.16 g/L Na2HPO4 )緩衝液清洗二次，然後將 1 倍的 PBS 緩衝溶液吸出，接著再加入 1 倍的 trypsin-EDTA (為一種胰蛋白水解酶，主要切斷胜肽中 lysine 或 arginine 的鍵結，使細胞能脫離培養皿)，當胰蛋白水解酶覆蓋所有細胞後，在室溫下靜置 2～3 mins，並用手輕輕拍打培養皿幫助細胞能完全脫離培養皿，同時也可使用倒位顯微鏡觀察細胞是否完全脫離培養皿，待細胞完全脫落之後，加入 10 ml 含有 10﹪血清的培養液抑制胰蛋白水解酶活性並且混合之後將細胞吸出，置於 15 ml 離心管中再放入離心機，轉速為 800 rpm，5 mins。之後，將上清液去除，用手指輕微拍散細胞，最後用 10 ml 含有 800 μg/ml 的 G418 抗生素培養液混合均勻後即可種入培養皿中。通常以一分三至一分四的稀釋方式分盤繼代培養。四、冷凍細胞 (frozen cell) 首先將培養皿中舊的細胞培養液吸出，加入 10 ml 的 1 倍 PBS 清洗二次，然後將 1 倍的 PBS 吸出，接著再加入 1 倍的 trypsin-EDTA，當胰蛋白水解酶覆蓋所有細胞後，在室溫下靜置 1 ～2 mins，並用手輕輕拍打培養皿幫助細胞能完全脫離培養皿，待細胞完全脫落之後，加入 10 ml 含有 10% 血清的培養液，以抑制胰蛋白水解酶活性並且混合之後將細胞吸出，置於 15 ml 離心管中再放入離心機，轉速為 800 rpm，5 mins 之後將上清液去除，用手指輕微拍散細胞，取少許細胞置 1.5 ml 微量離心管進行細胞計數，經 13.

(22) 確定細胞數目後，再加入冷凍細胞培養液 (1 ml DMSO＋9 ml 細胞培養液，混合後以 0.2 µm 針筒過濾器過濾)，將細胞數稀釋約 2 × 106 個細胞/ml 混合均勻，以每個冷凍管 1 ml 將細胞移到冷凍管中，再將冷凍管移至 Cryo 1℃ Freezing Container (NALGENE)中，外圍置放 2-propanol 置於 -80℃冷凍櫃中冷凍 5 小時以上，最後將冷凍管移至-120oC 液態氮桶內，將細胞保存起來，並填寫資料簿。五、解凍細胞 (frozen cell thawing) 首先，取 9 ml 新鮮的細胞培養液，置於 15 ml 離心管中備用。取 37℃溫水裝在小燒杯中，接著將細胞自液態氮桶取出放入小燒杯中，迅速放到 37℃水浴槽解凍。當細胞呈現半溶狀態時，在將細胞移至 Laminar flow 內把冷凍管中細胞液取出，與 9 ml 新鮮的細胞培養液混合均勻，再放入離心機，轉速 800 rpm ，5 mins 之後，將上清液去除，用手指輕微拍散細胞，再加入 10 ml 新鮮含有 800 μg/ml 的 G418 抗生素培養液混合均勻，最後將細胞移至細胞培養皿，並培養於有 5﹪CO2 的 37℃恆溫培養箱培養。第三節. 實驗方法. 一、細胞激素(細胞激素)之測量人類周邊血液單核細胞，加入小柴胡湯後，分別於 0、2、4、8、 12 小時收集培養液，並離心 1400 rpm，30 mins 以去除細胞，並置於 37OC 中培養。使用 (“Titer Zyme＂，Perseptive Diagnostics， Inc.USA) ELISA Kit 分析 cytokine 之濃度。將收集之培養液加入已先附著 cytokine-specific monoclonal antibody 之 ELISA plate 中，於 37℃中作用二小時，然後清洗。再加入 cytokine-specific polyclonal antibody conjugated with enzyme 作用二小時，然後清洗。加入 substrate solution 於室溫中作用 30 分鐘，加入 2N sulfuric acid 中止反應。以 OD.450 nm 讀取吸光度值 (optical density value)，以 Soft Max 軟體畫出 standard curve，並算出 cytokine 之濃度 (pg/ml) 。二、HCV 基因型分析引子與探針之設計參見圖 3.2，設計於 HCV 基因體之 5’ UTR. 14.

(23) 區域。 HCV RNA 由所儲存之血清中抽取，以 RNA isolation kit ( QIAamp viral RNA kit from Qiagen Inc.)純化。並以下列方法進行反轉錄：1 µg of RNA 檢體混以 2 pmole 反向引子，總體積為 15.5 µL。加熱 70°C 10 mins 後，加入 1 µl dNTP (2.5 mM)，2 µL 5× enzyme buffer (250 mM Tris-HCl，pH 8.3； 50 mM MgCl2；500 mM KCl； 20 mM DTT ), 0.5 µL RNasin (40 U/µL)與 0.5 µL 反轉錄酵素 (2 IU/µL)恆溫 42°C 40 mins 反應，最後再用 70°C 加熱 15 mins 破壞酵素。上節中反轉錄後之 cDNA 經過 PCR 擴增，與 pGEM-7ZF (Promega)載體接合後，再以 PCR 及限制酵素剪切確認轉殖成功。基因型分析：製成之 cDNA 以 thermal cycler 進行核酸擴增。配方為：5 µL cDNA, 1 µL 2 mM MgCl2 (25 mM), 2.5 µL GeneAmp 10× PCR Gold buffer (500 mM KCl, 150 mM Tris-HCl (pH 8.0), 2 µL dNTP (2.5 mM)與 0.1 U Platinum® polymerase (Invitrogen, USA)，總體積為 25 µL。 PCR 條件則為：95°C 10 mins 前加熱後，以 94°C 30 secs、57°C 30 secs 及 72°C 30 secs 進行 30 循環，最後以 72°C，5 mins 完成反應，基因型確定乃藉由 DNA 自動定序儀，並藉助所附電腦程式進行分析與統計。 Primer 114 83. 102. Probe 148. Primer 115. 168. 260. 279. 5’ UTR 圖 3.2. Core. E1. E2. 3’. DNA 序列分析之引子與探針之設計. 於 HCV 基因體之 5’UTR 區域。圖上數字表示序列的核酸編號 (nucleotide number; nt)4,17,72。. 15.

(24) 三、反轉錄酶-聚合酶連鎖反應 (Reverse Transcriptase. Polymerase. Chain Reaction，RT-PCR ) (1)RNA 純化：將 HCV Huh7 (containing HCV replicon)細胞以 6 × 105 個細胞數/3 ml 培養液種植至 6 cm 細胞培養皿，18 小時後，藥物處理 HCV Huh7 細胞，48 小時之後純化 RNA 。方法如下：移除舊培養液，加入 1 ml RareRNA (GPR02，真興)之後上下搖晃均勻，放置室溫 5 mins。吸取液體至新的微量離心管，加入 300 µl 的 chloroform (Merck)劇烈振盪混合 20 secs，置於冰上 5 mins 後，離心 13000 rpm，4℃，5 mins。吸取上清液 500 µl 並置換乾淨的 1.5 ml 微量離心管中，加入等體積 500 µl 的 isopropanol 振盪混合 20 secs，離心 13000 rpm，4℃，5 mins。倒掉上清液，再用 75﹪酒精清洗一次，離心 13000 rpm，4℃，倒掉上清液，以 Speed Vacume 進行抽乾，約 5 mins。以 RNase-Free Dnase (Promega) (2 µl 的 RNase-Free DNase，3 µl 的 10 倍 buffer 及 25 µl RNase free ddH2O，總體績 30 µl) 處理抽乾的 pellet，37℃，作用 20 mins。接著補充 RNase free ddH2O 至 200 µl，再加入 acid phenol/ chloroform (1:1) 200 µl，vortex 20 secs，離心 13000 rpm，4℃，5 mins，小心吸取上清液 180 µl，加入等體積 180 µl 的 Isopropanol， vortex 20 secs，離心 13000 rpm，4℃，5 mins，75% Alcohol 清洗，用 Speed Vacume 進行抽乾，溶於 TE buffer 40 µl。取 2 μl 進行 50 倍稀釋，測其在 260 nm 與 280 nm 波長下的比值，其比值應大於 1.8 以上，並取 2 µg RNA 進行反轉錄反應作成 cDNA。其他的 RNA 儲存在-80℃冰箱中。 (2)cDNA 的合成 ( RT-PCR )：本實驗使用 RT-PCR kit (Promega)進行反應。方法如下：取 2 µg 的 total RNA 加熱 70℃、10 mins 後隨即放置冰浴中冷卻，再加入 5 倍 MMLV buffer 4 µl ，10 mM dNTP Mixture 2 µl， Recombinant RNasin Ribonuclease inhibitor 0.5 µl，MMLV Reverse transcriptase 0.5 µl，100ng/ul Random Primer 1 µl 及 RNase-Free 16.

(25) Water 補至最終體積為 20 µl。於 PCR 儀中進行下列反應： 42℃、 90 mins，72℃、10 mins 及 4℃、5 mins 合成 cDNA。可進行 PCR 反應或 Real-Time PCR 分析，或儲存於-20℃冰箱中備用。 (3)PCR ( 鏈聚合酶鏈鎖反應 )：取 1 µl 的 cDNA，加入 10 倍的 PCR buffer 5 µl ( 100 mM Tris-HCl，pH 9.0，25 mM MgCl2，500 mM K2O，0.1﹪gelatin)， 2 µl 的 10 mM dNTPs，及各 2 µl 的 10 pmole 的引子。加二次蒸餾水 37 µl，最後加入 1 µl Pro-Taq DNA polymerase (5 單位/µl ) 共 50 µl，加熱 94℃、5 mins。反應條件：94℃、1 min；55℃、1 min； 72℃、2 mins，上述條件 NS5b 進行 30 cycles、β-actin 進行 28 cycles，接下來在 72℃反應 10 mins，作用結束後取 4 µl 進行 1.5 ﹪agarose gel 電泳分析，以 EtBr 染色，在 UV light box 下觀察。 HCV NS5b 正、反 primer73 5’TggggATCCCgTATgATACCCgCTgCTTTgA 3’ 5’ggCggAATTCCTggTCATAgCCTCCgTgAA 3’ β-actin 正、反 primer 5’TCATCACCATTggCAATgAg 3’ 5’CACTgTgTTggCgTACAggT 3’ 四.凝膠菜瓊脂電泳分析 (agarose gel electrophoresis) (1)1.5% agarose gel 的製備方法取 0.45 g 的 agarose powder 加入 30 ml 的 0.5 倍 TBE buffer 中 (40 mM Tris-Broate, pH 8.0，1 mM EDTA) 混合均勻後於微波爐中加熱 2 mins 至凝膠呈現透明滾沸狀態，待溫度稍下降後倒入平面膠體製備槽中，其上並放置一片梳狀膠片 (comb)，待完全凝固後小心取出梳狀膠片，其所留下的凹槽可作為注入樣品加入之用。 (2)電泳操作將 1.5% agarose gel 置於電泳槽 (Mupdi II)中，注入 0.5 倍 TBE buffer 並使其蓋過膠體，將 PCR 產物 (NS5b，β-actin)與適當量的 6 倍 loading dye buffer (0.25% Bromophenol blue，0.25% Xylene Cyanol FF，30% Glycerol ) 混合均勻後，注入膠片的凹形槽中，接 17.

(26) 上電源以 110 伏特電壓使 DNA 由負極向正極移動。約 50 mins 後取出膠片，放置於含有 5 ng/ml 的 ethidium bromide (EtBr)中浸染 10 mins，由於 ethidium bromide 具有嵌在 DNA 上的特性，所以操作時應小心謹慎不要觸摸到皮膚。並將 agarose gel 於電泳影像分析系統 (Alpha Innotech Corporation )進行照相存檔。五.定量 PCR (Real-time PCR) (一)儀器 ABI Perkin Elmer Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) ，以光纖管即時紀錄每一個 cycle 的螢光訊號，來定量經由 PCR 放大的基因片段，能偵測 500 nm 至 660 nm 範圍之螢光。 (二)試劑組 ®. TaqMan Universal PCR kit (AB gene)，除了 PCR kit 外，必須再另外合成一條能專一地辨識標的基因的 probe，probe 的 5’必須標示高能階的螢光物質 (reporter dye)，例如 FAM，而 probe 的 3’ 必須標示低能階阻避螢光物質 (quencher dye)，例如 TAMRA。當 PCR 反應進行，二引子結合至基因模版上，DNA polymerase 開始聚合作用而遇到 probe 這個障礙物，此時 DNA polymerase 會發揮 5’→3’ exonuclease 的作用而將 probe 由 5’逐一切除，此時 probe 5’的 reporter dye 便與 3’的 quencher dye 分離，而發出螢光。反之，若 PCR 反應未進行，probe 5’的 reporter dye 的能量會被 3’ 的 quencher dye 給吸收，因此機器偵測不到 reporter dye 的螢光訊號。機器記錄每個 cycle 數所產生的螢光值，形成 sigmoidal-shaped amplication plots，當螢光值到達閾值(threshold)時，會記錄其 cycle 數，稱為 CT (threshold cycle)值。 (三)方法此實驗取由 2 µg RNA 製備成 20 µl 的 cDNA 當 template，測 GAPDH 時，將 cDNA 稀釋 25 倍; 測量 HCV 基因表現時，cDNA 稀釋 20 倍。每個反應管總體積 25 µl: RNase-free H2O 5.5 µl，TaqMan mixture 18.

(27) 12.5 µl， primer (200 nM)各 0.5 µl， probe (GAPDH 100 nM; HCV 200 nM) 0.5 µl，template cDNA 5 µl。先 50℃ 2 mins，95℃ 10 mins 後，反應條件 95℃ 15 secs，60℃ 1 min，重複 40 cycle。 HCV 5’-untranslated region (UTR)正、反 primer 5’TgCggAACCggTgAgTACA 3’ 及 5’CgggTTTATCCAAgAAAggA 3’ HCV 5’-untranslated region (UTR) probe 6-FAM 5’CgggTTTATCCAAgAAAggA 3’BHQ-1 GAPDH 正、反 primer 5’gCACCgTCAAggCTgAgAAC 3’ 及 5’gCCTTCTCCATggTggTgAA 3’ GAPDH probe CAL Gold 5’CCCATCACCATCTTCCAggAgCgAg 3’BHQ-1 (四)計算方式機器紀錄每個 cycle 數所產生的螢光值，形成 sigmoidal-shaped amplification plots，當螢光到達閥值 ( threshold)時，會記錄其 cycle 數，稱為 CT (threshold cycle)值，即是剛達到可以偵測到螢光的 cycle 數。∆CT = CT(target gene) – CT (GAPDH)，表示此二基因螢光到達閥值時的 cycle 數差異。 ratio = 2 -∆ CT，表示此基因的相對表現量， HCV relativer expression，表示 10000 個 GAPDH 基因分子中 HCV 基因的含量。六.細胞毒性測試 (Cell Titer 96 Aqueous Non-Radioactivative Cell Proliferation Assay (MTS) 此方法之原理在於測粒腺體內膜去氫酶 (dehydrogenase)之活性高低來代表具有該去氫酶之細胞活性變化。反應中外加之 tetrazolium salt (MTS)的環狀結構可以被粒腺體內膜的去氫酶所破壞，造成原本黃色之 MTS 轉變成紫色的 formazan。當反應結果呈色越深，表示該反應中去氫酶之細胞活性越高。而當呈色越淺，代表去氫酶之細胞活性越低。將 HCV Huh7 (containing HCV replicon)，以每孔 8000 個細胞種 19.

(28) 植至 96 孔盤中，37℃培養 16 hrs 後，去除舊的細胞培養液，加入各種藥物的新細胞培養液，處理 48 hrs 。時間到達後，把 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl) -2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (2 mg/ml in DPBS (0.2 g KCl、8 g NaCl、0.2 g KH2PO4、1.15 g Na2HPO4 室溫攪拌至完全溶解，調 pH 值至 7.35，再加 100 mg MgCl2·H2O 攪拌至完全溶解、加入 133 mg CaCl2·H2O 補二次水至 1 L)要依序加入，避免混濁產生) 和 PMS 以 20:1 混和均勻每一孔加入 20 µl 混合液，37℃培養 45 mins 後，用螢光測定儀 (型號:PERKIN ELMER HIS 7000 PLUS)分析波長 492 nm 吸光值。七.細胞存活計數 (counting cell numbers) 將 HCV Huh7 (containing HCV replicon)細胞以 6 × 105 個細胞數 /3 ml 培養液種植至 6 cm 細胞培養皿，37℃培養 16 hrs 後，去除舊的細胞培養液，加入含不同藥物的細胞培養液處理 HCV Huh7 細胞 48 hrs 之後，去除舊的細胞培養液，用 1×PBS 清洗細胞二次，之後加 0.5 ml 的胰蛋白水解酶作用 3 mins，用手輕輕拍打培養皿幫助細胞能完全脫離培養皿，待細胞完全脫落之後，加入 10 ml 含 10﹪血清的培養液抑制胰蛋白水解酶活性並且混合之後將細胞吸出，置於 15 ml 離心管中再放入離心機，轉速為 800 rpm，5 mins。將上清液去除，用手指輕微拍散細胞，加入 1 ml 的 1×PBS 將細胞打散，取 20 µl 的細胞懸浮液，再外加 5 µl Trypan blue solution，用細胞計數器計數未染色的活細胞數目。細胞之型態 (morphology)以顯微鏡觀察 (Olympus, 40X)。第四節. 藥品試劑 (drugs and reagents). 一、酵素 Pro-Taq enzyme 購自波仕特 (Taipei, Taiwan)。 RNase A 購自 Sigma (St. Louis, MO)。 M-MLV Reverse Transcriptase RNase H Minus, Point Mutant 購自 Promega。. 20.

(29) 二、藥品 DMEM 、 FBS. (Fetal. Bovine. serum) 、 L-glutamine 、. penicillin-streptomycin、Trypsin-EDTA、sodium pyruvate 購自 GIBCO (Grand Island NY)。 Amido black、Tris-base 購自 USB (Cleveland OH USA)。 DNA 100bp ladder markers、RareRNA 購自真興實業有限公司 (Taipei, Taiwan)。 Stripping buffer、Agarose powder 購自 Seakem (Rockland ME USA)。 TaqMan® Universal PCR Master Mix 購自美國 Applied Biosystems 公司。 Saikosaponin A、Saikosaponin C、glycyrrhizin、paeoniflorin、baicalein 購自米山藥品工業株式會社。 safranin O、bromelain、ribavirin 購自 SIGMA。石蓮花、薰衣草、銀花、白蓮蕉、茉草、知母、絞股藍皂苷、黃芩由陳榮洲教授實驗室代購。雙鶴高三萜靈芝、雙鶴極品靈芝由雙鶴公司提供。其他: X-光底片購自 Fuji-Film。Hybond-P PVDF membrane 購自 Amershem Bioscience (Uppsala, Sweden)。 Modified Boyden chamber 購自真興 (Taipei, Taiwan)。Polycarbonate membranes 購自 Neuro probe (Neuro probe, Inc)。 Matrigel™ Basement Membrane Matrix 購自 BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ USA)。第五節. 實驗設備 (Instruments). (1) 核酸複製定量同步偵測系統 (Nucleic Acids Sequence Detection System). 型號: ABI PRISM 7700. (2)微量冷凍離心機 (3)pH meter. 型號: Eppendrof 5415R. 型號: JENCO microcomputer pH/mV/TEMP meter 6171. (4)數位化影像處理系統. 型號: MultiImageTM light Cabinet. 21.

(30) (5)聚合酶連鎖反應器. 型號: MJ Peltier Thermal cycler PTC-200. (6)倒立式螢光顯微鏡. 型號: OLYMPUS CK40. (7)紫外可見光分光光譜儀. 型號: ULTROSPEC 2100 PRO. (10)高壓滅菌斧型號: TOMIN TM 322 (11)冷光螢光影像分析系統. 型號: FUJIFILN LAS-1000. (12)電源供應器型號:Major Science MP-250 和 Pharmacia Biotech power supply EPS301 (13)螢光測定儀型號:PERKIN ELMER HIS 7000 PLUS (14)超音波儀型號:BRANSON SONIFIER 250 (15)水浴槽型號:Firstek Scientific B206 第六節. 統計分析(Instruments):. 實驗結果數據皆以平均值±標準偏差 (Meas ±SD)表示，以 SPSS 系統進行變異性分析 (ANOVA), 並以 Duncan's multiple range test 作組間差異比較，P< 0.05 代表有顯著性差異。. 22.

(31) 第四章第一節. 結果. HCV 基因型別探討. 本研究經收集台灣中部地區 60 位具 HCV 陽抗體之檢體，分析基因型別，如表 4.1 所示，與台灣的平均值相比較，在中臺灣沿海地區附近有較高的 HCV 感染率。文獻報告顯示，HCV-1b 對於 IFN 的治療最具有較高之抗性，且在台灣及中國和日本等東亞國家出現的流行率較高。本實驗中分析 58 名 HCV 之患者，其中有 91.4% ( 53/58 )之 subgenomic type 為 1b (表 4.2)；目前在臨床上最有效的治療，為將 IFN-ribavirin 結合治療，然而仍有 30%之 HCV-1b 感染的病患會再復發 (Lu, unpublished result)，因此，實驗結果將來應用於臨床使用，較具意義。表 4.1 區域. 某中部沿海地區 C 型肝炎抗原陽性率分析陽性比率 (%). 相對值. 2.0. 1.0. 鄉鎮 1. 38.9. 19.4. 鄉鎮 2. 34.9. 17.5. 鄉鎮 3. 27.9. 13.9. 鄉鎮 4. 26.3. 13.2. 平均值. 32.0. 16.0. 台灣地區. *as indicated by the presence of serum HCV antigen 第二節、小柴胡湯對細胞激素分泌之影響小柴胡湯和其他中藥早在臨床上已有使用在對抗肝炎的過程。在以前的研究顯示，小柴胡湯可降低血清中 alanine aminotranferase (ALT)的濃度。如表 4.3 中所示，在以小柴胡湯處理之前，除 IL-2 之外，來自 HCV+ 病患的 PBMC 的 cytokine 製造與來自健康的 HCV-對照組相比較大大提升，因此推測用小柴胡湯處理 HCV 患者的 PBMC 將導致 cytokine 選擇性的減少。其中 IL-1β與 IL-6 的濃度有明顯減少(paired t-test, p<0.01)，而其他 cytokine 則無明顯變化。IL-1β以及 IL-6 這兩種細胞激. 23.

(32) 素，似乎可以完全被抑制，並且濃度大幅降低至正常的水準。大致而言，小柴胡湯治療確實會使得肝炎病患的 cytokine 製造 profiles 恢復正常。而對健康的對照組來說，在比較處理和未處理兩組之間的 cytokine 濃度，僅 IFN-γ 有的顯著的減少外，其他 cytokine 並無顯著之變化。小柴胡湯對於 HCV 感染患者之 cytokine ，具有調節之功效，因此具有輔助減緩病患不適之功效，但在臨床上對於 HCV 感染之病患，並無抑制 HCV 病毒量(titer)的作用，因此必須在建立更有效之細胞篩選模式，直接尋找具抑制 HCV replication 能力之中藥。表 4.2. HCV 基因型別之分析個案數. %. 1a. 1. 1.7. 1b. 53. 91.4. 2a. 3. 5.2. 2b. 1. 1.7. 基因型別. 第三節. 藥物細胞毒殺性分析. 本研究建立以具 HCV replicon subgenomic containing cells 之 HCV-Huh7 細胞來篩選具抑制 HCV replication 能力之中藥，將 HCV-Huh7 細胞 (7×106/ml)，培養 18 小時後處理藥物，經過 48 小時後，接著以 MTS 方法來進行觀察細胞內 dehydrogenase 的活性，及以顯微鏡 (Olympus, 40X) 觀測 cell morphology 以確認細胞存活率，並判定 chemicals 及 herbal medicines 是否對 HCV-Huh7 具有毒性 ( cytotoxic)。 saikosaponin A and safranin O、bromelain 具有很高之毒性，因此觀測濃度分別僅能至 25 、10 及 50 μM (表 4.4)， glycyrrhizin， paeconiflorin 及 baicalein 等化學成分，則無抑制 HCV RNA 複製之功效。. 24.

(33) 表 4.3. 以小柴胡湯 (Xaio Chai Hu Tang) 處理 HCV 抗原陽性病患之. PBMC 產生 cytokine 之情形 HCV-. HCV+. (n=10). (n=10). IL-1β control. 302.1±69.46. 570.8± 89.53. Xaio Chai Hu Tang. 210.2±57.43. 201.0± 72.18*1. 12.5± 8.93. 62.5± 34.09. 0.5± 1.10. 48.2± 37.08. IFN-γ control Xaio Chai Hu Tang IL-6 control Xaio Chai Hu Tang. 412.2±50.00 70.4±88.19. 925.8±192.6 402.7± 82.69*2. TFN-α control. 240.0±55.52. 272.3±115.13. Xaio Chai Hu Tang. 238.2±71.34. 281.0± 67.43. IL-2 control. 4.2± 7.12. 0.1± 2.26. Xaio Chai Hu Tang. 5.9± 9.06. 0.5± 1.05. * : Significant Reduction (Paired-t Test: P<0.01) 1. : P =1.92x10-6. 2. : P= 1.75x10-5 濃度為 1 mg/ml 之高三萜靈芝、多醣體靈芝及茉草與白蓮蕉之萃. 取液，則不會對 HCV-Huh7 cells 有細胞毒性，再以 MTS assay 觀察濃度高達 4， 2， 1 and 0.5 mg/ml 是否有細胞毒性 (表 4.5). 多醣體靈芝 (0.61±0.04)及白蓮蕉 (0.22±0.04)在 4 mg/ml 濃度範圍，對 HCV replicon Huh7 細胞株具有毒殺性 (圖 4.1)，而在濃度 2-0.5 mg/ml 範圍，高三萜靈芝、粘多醣靈芝、茉草及白蓮蕉均無顯著之細胞毒殺性 (表 4.4、4.5)。此外小柴胡湯、知母、石蓮花、薰衣草、金銀花、絞股藍、黃芩等萃取液因無顯著之抑制 HCV RNA 複製之功效，因此並未進一步觀察高濃度之細胞毒性 (表 4.4 )。單獨以 10、100 IU/ml 之 IFN-α處理 HCV-Huh7 細胞，細胞存活率分別為 1.01±0.08 及 0.96±0.06，無顯著之細胞毒殺性，另外，若以 Ribavirin (400 μM)處理 HCV-Huh7 細胞，細胞存活率則為 1.22±0.01，若將 25.

(34) Ribavirin (400 μM)分別與 10，100 IU/ml IFN-α作用後之存活率為 1.19 ±0.05 及 1.22±0.04，亦均無顯著之細胞毒性 (表 4.6)。將高三萜靈芝、粘多醣靈芝、茉草及白蓮蕉萃取液與 10 IU/ml 之 IFN-α共同處理 HCV-Huh7 細胞，結果顯示於 4 及 2 mg/ ml 濃度其細胞存活性均於 87% 以下，而於 1 mg/ml 濃度時，高三萜靈芝與多醣體靈芝萃取液處理過後，細胞存活率小於 80% (分別為 0.73±0.14 及 0.61±0.07) ，茉草及白蓮蕉萃取液在 1 mg/ml 的濃度與 IFN-α共同處理 HCV-Huh7 細胞則並無顯著之細胞毒性 (0.87±0.18 及 0.99±0.11) (表 4.6，圖 4.2)，此外，若將藥物濃度調至 0.5 mg/ml 時，僅多醣體靈芝萃取液處理後，細胞存活率為 0.71± 0.16，高三萜靈芝、茉草及白蓮蕉萃取液均無顯著之細胞毒性。表 4.4. 中草藥及化學成分對 HCV-Huh-7 細胞之細胞毒性之影響. Herbal Extract/Compound. Cell Morphology. MTS assay. -. -. > 400 µM. Saikosaponin A (25 µM). granulated. +. 21 µM. Safranin O (10 µM). granulated. +. 7 µM. Saikosaponin C (100 µM). -. -. > 100 µM. Glycyrrhizin (100 µM). -. -. > 100 µM. Paeconiflorin (100 µM). -. -. > 100 µM. Baicalein (100 µM). -. -. > 100 µM. Bromelain (50 μg/ml). drift and agglutinate. -. > 50μg/ml. XaioChai Hu Tang (1 mg/ml). -. -. > 1 mg/ml. Polysaccharides Enterprise (1 mg/ml). -. -. > 1 mg/ml. Triterpenoids Enterprise. -. -. > 1 mg/ml. C.Indica(1 mg/ml). -. -. > 1 mg/ml. C. aromatica(1 mg/ml). -. -. > 1 mg/ml. granulated. +. 25μg/ml. C.minax(1 mg/ml). -. N.D. > 1 mg/ml. L.officinalis(1 mg/ml). -. N.D. > 1 mg/ml. L.japonica (1 mg/ml). -. N.D. > 1 mg/ml. Ribavirin (400 µM). (1 mg/ml). C.asphodeloides(1 mg/ml). LD50. G.simplicifolium (1 mg/ml). -. N.D. > 1 mg/ml. S.baicalensis (1 mg/ml). -. N.D. > 1 mg/ml. -﹕no effect; +：inhibitory effect;N.D.：not detected LD50 (50﹪Lethal dose)：the dose required to kill 50 percent of cells. 26.

(35) 表 4.5. 中草藥對 HCV-Huh7 細胞之細胞毒性之分析. Concentration (mg/ml). 4. 2. 1. 0.5. Triterpenoids Enterprise. 1.18 ± 0.14. 1.06 ± 0.19. 1.33 ± 0.04. 1.27 ± 0.11. Polysaccharides Enterprise. 0.61 ± 0.04. 1.08 ± 0.01. 0.81 ± 0.04. 1.18 ± 0.02. D.caudatum. 0.82 ± 0.12. 0.95 ± 0.06. 1.15 ± 0.17. 1.33 ± 0.05. C. indica. 0.22 ± 0.04. 1.45 ± 0.10. 1.04 ± 0.17. 1.31 ± 0.12. HCV-Huh7 細胞濃度為 8x103/ml，培養 18 小時後處理各種不同濃度藥物，Triterpenoids Enterprise (高三萜靈芝)、Polysaccharides Enterprise (多醣體靈芝)、Desmodium caudatum (茉草)、Canna indica (白蓮蕉) (4、2 及 1 及 0.5 mg/ml)。經過 48 小時後，接著以 MTS 方法來進行觀察。以細胞未處理藥物的存活率為 1，而處理藥物與之比較得存活率，實驗重複三次，取其平均值。結果以 mean ±SD 表示。. 2 高三帖靈芝黏多醣靈芝. 白蓮蕉. 1. ). %. 茉草. 1.5. (. 存活率. 0.5. 0 0.5. 1. 濃度(m g/m l). 2. 4. 圖 4.1 中草藥對 HCV-Huh7 細胞之存活率之比較. 27.

(36) 表 4.6.中草藥萃取物與 IFN-α合併處理對 HCV-Huh7 細胞之細胞毒性 Concentration (mg/ml). 4. 2. 1. 0.5. Triterpenoids Enterprise. 0.50 ± 0.09 0.57 ± 0.10 0.73 ± 0.14 0.83 ± 0.06. Polysaccharides Enterprise. 0.46 ± 0.03 0.68 ± 0.14 0.61 ± 0.07 0.71 ± 0.16. D.caudatum. 0.68 ± 0.11 0.69 ± 0.12 0.87 ± 0.18. C. indica. 0.87 ± 0.18. 1.0 ± 0.15. 0.78 ± 0.07 0.99 ± 0.11 0.94 ± 0.08. 1.4. 高三帖靈芝黏多醣靈芝. 1.2. 茉草. 存 1 活率 0.8. 白蓮蕉. 0.6. (. %. 0.4. ). 0.2 0 0.5. 1 濃度(mg /ml) 2. 4. 圖 4.2 中草藥萃取物與 IFN-α合併處理對 HCV-Huh7 細胞之毒性比較. 28.

(37) HCV-Huh 7 細胞濃度為 8x103/ml，培養 18 小時後處理各種不同濃度藥物，Triterpenoids Enterprise (高三萜靈芝)、Polysaccharides Enterprise (多醣體靈芝)、Desmodium caudatum (茉草)、Canna indica (白蓮蕉) (4、 2 、1 及 0.5 mg/ml)，同時與 10 IU/ml 之 IFN-α 一起作用於 HCV-Huh 7 細胞。經過 48 小時後，接著以 MTS 方法來進行觀察。以細胞未處理藥物的存活率為 1，而處理藥物與之比較，而處理藥物與之比較得存活率，實驗重複三次，取其平均值。結果以 mean ±SD 表示。以 IFN-α10 及 100 IU/ml 之濃度處理細胞後，細胞存活率分別為 1.01±08 及 0.96±0.06。 Rivavirin (400 μM)細胞存活率則為 1.22±0.01，Rivavirin (400 μM)分別與 10，100 第四節. IU/ml IFN-α作用後之存活率為 1.19±0.05 及 1.22±0.04。. RT-PCR 分析中藥對 HCV 複製之影響. 將濃度為 8x103/ml 之 HCV-Huh7 細胞，培養 18 小時後處理 1 mg/ml 藥物，48 小時後，萃取 RNA，並利用 MMLV-反轉錄酶合成 cDNA，進行 RT-PCR 分析 HCV-Huh7 cells 中 HCV-NS5b mRNA 表現情形，白蓮蕉及茉草萃取液則有顯著之抗病毒能力，至於高三萜靈芝及多醣體靈芝、白蓮蕉及茉草則具有減低 IFN-α用量之能力，未來則朝向純化出上述中草藥之有效成分。分析 7 種化學成份、小柴胡湯及 10 種植物 (表 4.4)抑制 HCV-Huh7 RNA 的複製能力，濃度 1， 10 及 100 μM Saikosaponin C，Saikosaponin A，glycyrrhizin，paeconiflorin，baicalein 等化學成分均無抑制 HCV subgenomic RNA 複製的能力 (圖 4.3)，即使與 10 μM IFN-α合併使用亦無抑制現象 (圖 4.4)；至於小柴胡湯、知母、石蓮花、薰衣草、金銀花及黃芩，亦無明顯的抑制作用 (圖 4.5)，而在單獨使用白蓮蕉及茉草萃取液有顯著之抑制 HCV subgenomic RNA 的複製能力，高三萜靈芝、黏多醣靈芝、白蓮蕉及茉草則與 10 IU/ml IFN-α 合併使用即能明顯的抑制 HCV subgenomic RNA 複製。白蓮蕉及茉草，效果與 10 IU/ml IFNα及 400 mM Ribavirin 合併一樣顯著。因此推測這四種草藥萃取物，於臨床治療上減低 IFN-α用量之能力。. 29.

(38) 圖 4.3. 具有抑制 HCV subgenomic replicon 複製能力之化學成分分析。. 具有 HCV subgenomic replicon 之 Huh7 細胞 (7×106/ml)，以化學成分 Saikosaponin C，glycyrrhizin， paeconiflorin 或 baicalein 處理處理之濃度如圖所標示，處理時間為 48 小時，1 μg RAN 純化出來後，進行 RT 反應，並進行 NS5b gene 之 RT-PCR 分析.取 4 μl PCR 的產物，以 1.5% agrose gel 分析。對照組為 HCV-Huh7 細胞，不處理任何藥物 (lane 1)。所標示之比率係以對照組為 1，重複實驗 3 次，取其平均值。. 圖 4.4. 具有抑制 HCV subgenomic replicon 複製能力之化學成分與 10 IU/ml IFN-α合併處理分析。. HCV-Huh7 以化學成分 Saikosaponin C，glycyrrhizin， paeconiflorin， baicalein 或 Bromelain 與 10 IU/ml IFN-α合併處理。化學成分處理之濃度如圖所標示，比率係以對照組為 1，以實驗 3 次重複，取之平均值。. 30.

(39) 圖 4.5. 具有抑制 HCV subgenomic replicon 複製能力之中草藥與 10 IU/ml IFN-α合併處理分析。. HCV-Huh7 以標示之中草藥萃取物與 10 IU/ml IFN-α合併處理。. 31.

(40) 圖 4.6. 具有抑制 HCV subgenomic replicon 複製能力之中草藥與 IFN-α. 合併處理分析處理。 (A) HCV-Huh7 (7×106/ml )以 Triterpenoids Enterprise (高三萜靈芝)， Polysaccharides Enterprise (多醣體靈芝)萃取物單獨處理，所與標示不同濃度之 IFN-α合併處理 48 小時，取 1 µg RNA 進行 NS5b gene 之 RT-PCR 分析。 (B) HCV-Huh7 (7×106/ml)以 Desmodium caudatum (茉草)及 Canna indica (白蓮蕉) 萃取物單獨處理，或與標示之不同濃度 IFN-α合併處理 48 小時後，取 1 µg RNA 進行 NS5b gene 之 RT-PCR 分析；取 4 µl PCR 產物，以 1.5% agrose gel 分析，對照組為不經任何藥物處理之 HCV-Huh7。所標示之比率係以對照組為 1，重複實驗 3 次，取其平均值。上述四種草藥萃取物，明顯的抑制 HCV subgenomic RNA 的複製，甚至比 10 IU/mlIFN-α與 400 mM Ribavirin 合併使用更具明顯的抑制能力， (圖 4.6A 及 4.6B，lanes 6 及 7)，因此推測這四種草藥萃取物，於臨床治療上減低 INF-α用量之能力，若以濃度 500 μg/ml 之草藥萃取液與 10 IU/mlINF-α合併使用，抑制能力則較不顯著。 32. 格式化: 縮排: 第一行: 2 字元, 行距: 固定行高 23 pt.

(41) 為進一步證實以電泳分析 RT-PCR HCV-NS5b mRNA 表現情形，再進行 Real Time-PCR 分析 HCV RNA 表現情形，將 HCV-Huh7 細胞 (7× 106/ml)，48 小時後分別加入高三萜靈芝、多醣體靈芝、茉草、白蓮蕉處理後，進行 Real Time-PCR 分析 HCV RNA 表現情形。結果顯示於藥物濃度 1 mg/ml 時，高三萜靈芝、多醣體靈芝、白蓮蕉及茉草其 relative titer 分別降至 46.6±32.7，34.8±19.0，28.5±10.1 及 13.8±1.2 （圖 4.7），無處理藥物之對照組為 100.0±1.0，而此濃度已於表 5 證實並無細胞毒性，因此表示茉草及白蓮蕉萃取液具有較顯著抑制 HCV 複製之能力。將高三萜靈芝、多醣體靈芝、茉草、白蓮蕉同時與 10 IU/ml 之 IFNα 一起作用於 HCV-Huh7 細胞，經過 48 小時後，進行 Real Time 分析 HCV RNA 表現情形。僅處理 10 IU/ml IFN-α之 HCV relative titer 為 16.4 ±4.4，高三萜靈芝、多醣體靈芝、茉草、白蓮蕉 relative titer 分別為 9.2± 14.7， 3.0±3.1， 8.3±5.7. and 3.0±3.1 (圖 4.7)。. 由此可知 1 mg/ml 之茉草及白蓮蕉對 HCV-Huh7 細胞中 HCV RNA 表現之抑制能力比單獨 10 IU/ml 之 IFN-α較好，因此顯示高三萜靈芝、多醣體靈芝、茉草及白蓮蕉之萃取液與 IFN-α合併使用具有可以降低 IFN-α使用量之潛力。. 33.

(42) 圖 4.7. HCV-Huh7 細胞以中草藥萃取液處理後分析 real-time-PCR. HCV-Huh7 細胞以中草藥萃取液處理後分別以 real-time PCR 進行實驗，HCV-Huh7 (7×106/ml)以 Triterpenoids Enterprise (高三萜靈芝)、 Polysaccharides Enterprise (多醣體靈芝)、Desmodium caudatum (茉草)、Canna indica (白蓮蕉) 萃取物處理 48 小時後，取 1 μg 之 RNA 產物，進行 real-time 定量 PCR，所標示之 Relative HCV RNA titer 係與未處理藥物之對照組比較；上述 4 種萃取物與 10 IU/ml INF-α 合併處理，每個數值皆為重複 3 次，並且平均值±標準差表示。經由上述研究結果顯示，白蓮蕉及茉草之熱水萃取物有顯著之抗病毒能力。若單獨以 IFN-α處理上述之細胞則濃度需 100 IU/ml 才達最高之抑制能力，但若同時加入 1 mg/ml 濃度之高三萜靈芝、多醣體靈芝、白蓮蕉及茉草葉之熱水萃取物，則 IFN-α只需 10 IU/ml 就能達最高之抑制能力。因此認為 1 mg/ml 之白蓮蕉及茉草葉具有抗病毒之潛力，高三萜靈芝、多醣體靈芝、白蓮蕉及茉草則具有可與 IFN-α合併使用，以降低 IFN-α使用量之潛力 (表 4.7)。. 34.

(43) 表 4.7 中草藥及化學成分對 HCV-Huh7 細胞 HCV RNA 複製能力及與 IFN-α合併處理之影響藥物 Ribavirin (400 µM). +. Pure compounds Saikosaponin A (25 µM). -. Safranin O (10 µM). -. Sailosaponin C (100 µM). -. Glycyrrhizin (100 µM). -. Paeconiflorin (100 µM). -. Baicalein (100 µM). -. Bromelain (50 μg/ml). -. 草藥 XaioChai Hu Tang (1 mg/ml). -. Triterpenoids Enterprise (1 mg/ml). -. Polysaccharides Enterprise (1 mg/ml). -. Canna indica (1 mg/ml). +. Desmodium caudatum (1 mg/ml). +. Anemarrhena asphodeloides (1 mg/ml). -. Caesalpinia minax (1 mg/ml). -. Lavandula officinalis (1 mg/ml). -. Lonicera japonica (1 mg/ml). -. Gynostemma simplicifolium (1 mg/ml). -. Scutellaria baicalensis (1 mg/ml). -. -﹕no effect; +：inhibitory effect. 35.

(44) 第五章第一節. 討論. HCV 高染率探討. 在台灣的人口中，HCV 感染率為百分之 2，而在中部沿海地區和南台灣感染的比率更高。不平常的高流行比率可能歸因於以前這些地區不充足的醫療照護資源，及未盡完善消毒醫療設備與器械。以往因 HBV 的高感染率比 HCV 嚴重，目前疫苗已經控制了 HBV 感染之後，HCV 感染目前已成為對台灣的公共衛生之一主要威脅。在台灣，受 HCV 1b subtype 感染的病患比例顯著較高，它對 IFN-α治療最具有抵抗力。因此以 IFN 為主的治療的形態，可能對台灣在治療慢性 HCV 感染較不具顯著療效。第二節. HCV 致病因子探討. 目前已知急性且自我限制的 HCV 感染與第一類 (type 1)之細胞激素濃度變化有關。而顯著的 Type 2 T-cell 反應與病毒的傳染病的慢性發展有關係。這可能可以由太早轉換 Type 2 responses 來解釋。如果沒有第一類細胞激素的幫助體免疫 (humoral immunity)不能持續，也會導致中核之抗體 (neutralizing antibodies) 減少。此外，CTLs 和 natural killers cells 和巨噬細胞不能被活化和補充，也會導致病毒持續的感染。因此平衡第一類/第二類之細胞激素分泌，以產生適合的免疫力來對抗 HCV 之感染 28。對抗 HCV 結構或非結構抗原之特異性周邊或肝細胞內之 T-cell 反應為主要且較先發生之免疫反應。此外，在隨後發生的免疫擴大反應 (systemic reaction)，可能也需要來自 PBMC 的非特異性 HCV 的反應，進而引發全身性作用 74 。在沒有小柴胡湯的處理下，我們在 HCV 病患檢體中觀察到 cytokine 濃度升高，可能與試圖抑制病毒複製，及引發清除被病毒感染細胞的激烈免疫反應有關。 IL-1β 與 IL-6 已知為具有許多功能包含引發發炎反應的細胞激素。且因這兩種細胞激素的過度反應會導致肝炎的症狀表現及激烈之組織損壞。IFN-γ 亦被證實在 HCV 患者體內可能有助於 Type 1 宿主反應，即聚集巨噬細胞及自然殺手細胞，並且引發病毒清除反應。. 36.

(45) 不過，在病患的 PBMCs 中，IL-2 的製造，顯著地較控制組低，並且也許不能支援 CTLs 的活化。經由觀察 cytokine 的濃度，也許可以解釋大多數 HCV 病患不能克服感染，即使病人免疫能力仍然活躍，病毒卻依舊存活。第三節小柴胡湯選擇性的調節細胞激素分泌在以小柴胡湯治療之後的 PBMCs，在病患組內的引發發炎反應的細胞激素 IL-1β 及 IL-6 的產生減少超過 50%，且降到健康控制組的水準。這可以暗示透過小柴胡湯處理，可以減低一些發炎反應，包括一連串發炎反應，導致肝臟損壞。在另一方面，小柴胡湯沒改變在病患體內的兩種第一類細胞激素 IFN-γ 以及 TNF-α的表達模式。在用小柴胡湯處理之後，IL-2 的製造甚至會提升。因此推測小柴胡湯能透過非 HCV 特異性之免疫途徑，有選擇性的調節細胞激素反應。有趣的是，在健康的對照組中的細胞激素表現量也被小柴胡湯改變，只是不同於那些病患的型式。小柴胡湯處理導致 IL-1β 與 IFN-γ 濃度的減少，然而，其他細胞激素的製造好像無明顯的改變。我們的初步的結果顯示小柴胡湯可以在治療 HCV 病患過程中作為一個免疫的調節器。透過轉移細胞激素表現量，病患可能在一方面減少不必要或者危險的發炎反應，而在另一方面保持有利的 Type 1 細胞激素反應。目前已證實 HCV 的致病力與 CD8+ HCV 特異性殺手 T 淋巴細胞 (CTL)5 不正常分泌細胞激素有關. 22. 。因此想了解是否能如先前作者研. 究 measle virus 之研究，以觀察是否有中藥成份能能影響感染者 PBMC 之細胞激素分泌狀態，而能有效治療 HCV 感染，因此本篇論文觀察到 HCV 感染患者之 PBMC 細胞激素表現，與正常人之表現濃度有顯著差異，且觀察到小柴胡湯之熱水萃取物及上述之中藥之有效成份確實能影響感染者 PBMC 之細胞激素分泌狀態 72，雖然並未如預期能恢復與正常人相同之細胞激素表現量，但仍觀察到處理過中藥成份 HCV 感染患者之 PBMC 與無感染者(HCV-)比較呈現不同表現量，並推測小柴胡湯可能經由關閉發炎反應來促進 Th-1 之反應及不正常分泌 CD8+ HCV37.