第1章 序論
1-1 引言
近年來，毛細管電泳為一已成熟之分離技術，其利用加電壓於毛細管兩端，
使得帶電荷之分析物擁有不同的電泳速度而分離，相較於傳統的 HPLC 分離技術，
其特色為分析樣品量少，時間短，廣泛運用於分離各種藥物或環境汙染物之鑑定 上。但因毛細管管徑狹小，使得其靈敏度不佳，更使得偵測極限較高，故各式各 樣的離線濃縮方法及線上濃縮方式陸續地被開發出來。
許多研究指出類黃酮化合物具有抗氧化性、抗心血管疾病、以及抗癌的功效，
且廣泛地存在於各種水果、植物及食物中，例如蜂蜜及紅酒或一些天然藥材都含 有類黃酮化合物，本篇論文研究類黃酮化合物在不同條件下之線上濃縮效果，並 試著應用到真實樣品(蜂蜜或紅酒)之檢測。
1-2 毛細管電泳發展史
電泳(Electrophoresis)定義為溶液中之帶電荷分子，在電場作用下受到吸引力 或排斥力，而朝向相反電荷之兩極方向遷移的現象。利用帶電荷粒子的帶電性、
帶電量及粒子的大小差異形成不同的遷移速度而達到分離的效果，這種分離技術 即稱為電泳分離法。早先電泳實驗大多在親水性凝膠或其他支撐介質上進行，通 常用以分離較大的分子物質如蛋白質或其他生化物質，但是凝膠的製備不僅費時 費力，實驗結果的再現性亦不佳。然而，電泳分離法在化學或生化的領域中被視 為是一種非常重要的分析技術。
1897 年，Kohlraush[1]首先提出帶電荷粒子在電解質中的遷移方程式，利用 物理定律來解釋離子在電解質中的遷移行為。直到 1937 年，瑞典科學家 Tiselius[2]
以”移動邊界(moving boundary)”方法將人體血清中的 α、β、γ 球蛋白以及胺基酸 分離出來，由於他在電泳技術發展與應用有卓越貢獻，使他在 1948 年榮獲諾貝
2 過性病毒等。1974 年 Virtanen 和 Mikkers[5, 6]使用 200~500 μm 內徑的玻璃毛細 管和聚四氟乙烯管進行電泳分離的實驗，可有效地控制焦耳熱產生的對流問題。
目前大家所論及的毛細管電泳技術，又稱為高效能毛細管電泳法(High performance capillary electrophoresis, 簡稱 HPCE)，其為在內徑約 25~75 μm 的毛 細管中進行電泳分離實驗，因口徑小的毛細管內壁表面積大，散熱率好，使得理 論板數大為提高。然而毛細管與傳統電泳的主要差別為前者是在毛細管中進行的，
後者為在平板上進行，毛細管電泳是由 Jorgenson 和 Lukacs[7-9]在 1981 年所提 出的，他們以內徑 75 μm 的毛細管柱來分離衍生化的胺基酸，在充滿緩衝溶液的 毛細管兩端施加 30 kV 的高電壓進行分離實驗，並且用螢光偵測器做線上偵測，
成功地分離胺基酸的衍生物。他們詳細探討各種影響分離效率的因素，並且建
立毛細管電泳的理論和實驗基礎。
毛細管區帶電泳法(Capillary zone electrophoresis)於一般情況下只能分離帶 電荷離子，而無法應用於中性分析物，中性分析物通常隨電滲流一起遷移。但是
3 聚焦法(Capillary isoelectric focusing)。1987 年 Cohen 和 Karger[12]亦將傳統的凝 膠電泳法應用到毛細管中以分離胜肽與蛋白質，因而提出毛細管凝膠電泳 (Capillary gel electrophoresis)的技術。同年，Tsuda[13]結合高效能液相層析管柱 與電泳技術提出毛細管電層析法(CEC)。此外，還有其他的毛細管電泳技術被發 展出來，如毛細管等速電泳法(Capillary isotachophoresis)。1988 年 Rose 和 Jorgenson[14]首先提出毛細管電泳作微量分析的可行性，且商業化的毛細管電泳
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Fi = 6πηriυi (1-4)
其中 ri為球型分子的離子半徑。
因此在電泳過程中，當靜電力與摩擦力達到穩態平衡時，兩者大小相等而方向相 反，可知帶電粒子 i 在電場 E 作用下的移動速率為 υi ：
(1-5)
這種帶電粒子的遷移行為即為電泳，我們定義電泳遷移率為單位電場下的電泳速 率為μi或μep：
(1-6)
1.2.2 電雙層(Electric double layer)與 Zeta 電位
在毛細管電泳中，不論是帶電荷粒子或毛細管電泳的內壁均會有電雙層的形 成，電雙層是浸於溶液中的物質表面都會發生的一種情形。一般毛細管的材料常 採用熔融矽膠(fused silica)，在 pH > 3 的情況下，毛細管表面受到鹼液活化後，
毛細管表面的矽醇基(Si-OH)解離而形成帶負電荷的 Si-O-，使溶液中存在過多的 正電荷；有些被不可逆地吸附在毛細管的內壁，稱為固定層(Stern layer)；還有一 些分佈在距離毛細管較遠的區域，其電荷密度隨著距離管壁愈遠而成指數趨勢急 劇下降，此層稱為擴散層(Diffusion layer)，此兩部分電荷所組成的離子層稱為電 雙層(Electric double layer)，如圖 1-1[16]所示。由於毛細管溶液中電荷分佈不均 勻，使溶液與管壁間有電位差的存在，若將溶液的中央部分(Bulk solution)的電位 定為ψ1，管壁的電位定為ψ2，此時固定層的電位下降φ，而在擴散層中電位由 ψ2
降至ψ1，毛細管內溶液各處與(ψ2 - φ)的差距稱為 Zeta 電位(ζ potential)，其方程 式可表示如下：
(1-7)
式中δ 為電雙層的厚度，e 為每單位表面積的電荷，ε 為溶液的介電常數。
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1-3-2 電滲流(Electroosmotic flow, EOF)與流型(Flow profile)
廣義地說，電滲流是緩衝液相對於毛細管內壁表面移動的電泳現象，在電場 的作用之下，毛細管內壁形成電雙層，其中水合陽離子集體向負極移動所引起的 電滲流與帶電粒子在溶液中的電泳遷移行為類似，可用下列方程式表示之：
υeo = μeoE (1-8)
(1-9)
其中υeo為電滲流速率，μeo為電滲流遷移率，η 為緩衝液的黏度，ε 為介電常數，
ζ 為電滲流的 Zeta 電位。
由此方程式可以看出電滲流與 Zeta 電位及介電常數成正比，與黏度成反比。
一般而言，電滲流強度受 Zeta 電位、電雙層的厚度和緩衝液黏度的影響。Zeta 電位愈大、電雙層愈厚、黏度愈小，將使得電滲流值愈大。由於 Zeta 電位在擴 散層中急劇下降，其寬度僅數十微米，故毛細管中接近內管壁的大部分溶液，其 Zeta 電位均為定值，因此毛細管在電場作用下，除了靠近毛細管管壁微米區域之
外，其他區域皆以同一個速度前進，此時的電泳速率 υeo即造成穩定的電滲流。
影響電滲流的大小與方向除了緩衝液組成與濃度、pH 值、有機添加劑、毛細管 管壁修飾與否之外，毛細管樣品區帶的組成亦是影響的主要因素。
毛細管電泳中的電滲流是電解質相對於毛細管管壁移動的現象，此由距離管 壁表面甚近的正電荷離子所引起的，當施加電場後，這些正電荷粒子因電場作用 之下而集體向負極移動，同時也帶動附近水分子一起移動，當此種電滲流與電解 質黏滯力達到平衡時，整個流體會像一個扁平板塞狀而向負極移動，與一般 HPLC 的拋物線流型是不相同的，如圖 1-2[17]所示。因為 HPLC 的驅動力是靠 壓力系統，受黏滯力的影響，中央處的速度大約是平均速度的 2 倍。換言之，即
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使樣品在管柱中不滯留，也會因為本身流型的影響造成區帶變寬的現象，然而毛 細管電泳的流型是扁平型，因此樣品不會有區帶變寬的現象發生。
由於帶電荷粒子在毛細管內的緩衝溶液中有自己的電泳遷移率(μep)；而分離
緩衝溶液本身亦有電滲流遷移率(μeo)的存在，因此帶電荷粒子在沒有其它因素影
響下的視遷移率(μap)為這兩者向量的加成：
μap = μep + μeo (1-10)
在毛細管電泳實驗中，可由中性物質(如氰甲烷)的遷移時間 t0，以及帶電荷分析
物的遷移時間 tm，來求得分析物的電泳遷移率(μep)：
(1-11)
其中 Ld為毛細管進樣端到偵測器的有效長度，Lt為毛細管的總長度，V 為施加
的總電壓。
在毛細管電泳分離的過程中，分離的機制就是藉著各種樣品分析物在緩衝溶 液中之電泳遷移率差異性來達成分離。因此藉由改變緩衝條件如成分、濃度、pH 值、添加有機修飾劑等來達成分離的目的。
1-3-3分離效率(Separation efficiency)
毛細管電泳(CE)與高效能液相層析(HPLC)同為液相分離技術，因此 CE 在功 能和結果上與 HPLC 十分相似，所以毛細管電泳的分離效率可以用理論板數(N) 及解析度(RS)當作指標：
(1-10)
√ √ (1-11)
其中 H 為理論板高，σ2為分析物的變異係數，D 為分析物在介質中的擴散係數，
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Δt 為二分析物的遷移時間差，Wi為分析物 i 的吸收峰半高寬，Δμ 為二分析物的 視電泳遷移率差。
由於毛細管電泳是藉著電泳的現象流動，其流動層面為扁平板面，而不像高 效能液相層析是藉由壓力系統來達成，其流動層面為拋物面，所以在毛細管電泳 中，理論板數常常可以高達每米數十萬以上，甚至數百萬之上，其分離效率相當 可觀。
此外，在毛細管電泳中造成吸收峰波形變寬而影響分離效率的因素主要有下 列幾種：
(1) 焦耳熱造成管內溫度分佈不均，形成介質各處的黏度不一樣；
(2) 溶質吸附於管壁而造成吸收峰拖尾；
(3) 溶質與緩衝溶液的導電度相差太大而造成峰行畸變；
(4) 溶質在介質中的擴散現象；
(5) 樣品進樣太多。
因此在毛細管電泳分離過程中，必須特別注意以上這些現象，才能適當地克 服這些缺點，進而增加分離效率。
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1-4毛細管電泳的分離模式
毛細管電泳技術發展至今，已有數種不同分離模式，不同分離模式的分離機 制各不相同。目前已發展出來的方法是依照分離原理來命名的：
毛細管區帶電泳法
(Capillary zone electrophoresis, CZE)
微胞電動力層析法
(Micellar electrokinetic chromatography, MEKC)
毛細管凝膠電泳法
(Capillary gel electrophoresis, CGE)
毛細管等電聚焦電泳法
(Capillary isoelectric focusing, CIEF)
毛細管等速電泳法
(Capillary isotachophoresis, CITP)
毛細管電層析法
(Capillary electrochromatography, CEC) 1-4-1 毛細管區帶電泳法(CZE)
9 Micellar Concentration, CMC)的界面活性劑於緩衝溶液中，界面活性劑單體分 子會聚集在一起而形成微胞(micelle)。微胞在水溶液中的結構為界面活性劑單體
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1-5-1 水動力注入法(Hydrodynamic injection)
水動力注入法可細分成壓力差(pressure)和抽真空(vacuum)兩種。採用水動力
1-5-2 水靜力注入法(Hydrostatic injection) 若是以虹吸進樣，方程式中的壓力差可以表示為：
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(1-13)
其中ρ 為緩衝溶液的密度，g 為重力常數，Δh 為毛細管兩端的高度差。由上述
的公式可得知採用水動力注入法及水靜力注入法的進樣量不受樣品基質的影響，
的公式可得知採用水動力注入法及水靜力注入法的進樣量不受樣品基質的影響，