廣藿香GC-MS成分分析圖

第四章結果

第一節廣藿香GC-MS成分分析圖

使用 GC-MS 在本實驗條件下分離結果如圖 16，由層析圖可清楚呈現有三個較多的成分，各層析質譜圖比對資料庫 (Agilent Technologies)及文獻得知各層析峰之成分為表 9 所列。

10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 50000

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

Average of 19.130 to 19.269 min.: 100106_4.D 44 122

91 105 79

147 189204 219

134 161175 234246264 287299

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

#46723: Azulene, 1,2,3,4,5,6,7,8-octahydro-1,4-dimethyl-7-(

105

93 147

79 41 133

55 67 119 189204

29 161

Average of 35.188 to 35.516 min.: 100106_4.D 41

83 67

98 138

125 161 222

111

189 207

175 234246 264 281

149 294

#108551: Patchouli alcohol 41

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

Average of 40.871 to 41.373 min.: 100106_4.D 43

195209 236250264 281293

圖 19. 成分 C 質譜圖

第二節廣藿香甲醇萃取物急性毒性試驗

經過實驗確認，廣藿香甲醇萃取物餵食(10 g/kg)，觀察七天後，小鼠並無特殊反應及影響，實驗樣品數十隻小鼠皆存活。

第三節廣藿香及廣藿香油抗氧化實驗一、

清除自由基DPPH

(一) TLC

本實驗原理乃利用 DPPH 自由基原有的紫藍色，與抗氧化劑反應時，其顏色會消失，因此，可作為樣品對 DPPH 自由基清除能力評估的預試驗。藉由實驗結果，篩選適合的實驗濃度。當 TLC 板點上不同濃度、固定量的樣品，再浸泡於 DPPH 溶液中，均勻沾染後靜待 TLC 板顏色變化。樣品對 DPPH 自由基的清除能力與白點的密度大小成正比⁽¹¹²⁾。

實驗結果顯示，PC_MeOH濃度越高白點密度越明顯。在濃度 (1000 µg/ml)仍可見濃密度白點，而白點密度相當於濃度 250 µg/mL 的 BHT (圖 21)。

圖 21. PC_MeOH清除 DPPH 自由基之 TLC 板染色試驗

圖中 PC_MeOH表示廣藿香甲醇萃取物、PCO 為廣霍香油、Vit C 與 BHT 為對照組。

(二) DPPH 自由基清除效應：

DPPH 為一種相當穩定的自由基，其為紫藍色，在 517 nm 波長下有強的吸收光，當 DPPH 與具有供氫能力之抗氧化劑反應時，

其顏色會消失，因此，在 517 nm 的吸光值就會降低，而吸光值降的越低，表示抗氧化劑 (AH)的供氫能力越強，也就是指該抗氧化劑清除自由基的能力越強。樣品對 DPPH 自由基清除率達 50%時的樣品濃度 (即所謂的 IC50值)，IC50值越小表示樣品抗氧化能力越強。其反應式如下：

DPPH‧(violet)+ AH → DPPH ：H (decolorized)+ A‧

實驗結果顯示 PCMeOH及 PCO 對 DPPH 具有良好的清除能力，

IC50分別為 162.22 µg/mL 以及 171.45 µg/mL，抗氧化能力依序為 Vit C＞BHT＞PC＞PCO(表 10)。

表 10. PC_MeOH與 PCO 對 DPPH 自由基清除作用之 IC₅₀ (µg/mL)

Species and positive controls IC

₅₀

(µg/mL)

Vit C 45.64 ± 0.12

BHT 50.23 ± 0.24

PCMeOH 162.22 ± 1.54

PCO 171.45 ± 2.01

a Values represented as mean ± S.D. of three parallel measurements.

二、

總多酚 (polyphenols)及總黃酮 (flavonoids)成分含量測定 總多酚類含量以 mg (+)-catechin equivalent/g dry weight (µg CE/mg)表示，PC 的總多酚含量為 37.23 ± 1.65 (µg CE/mg)。總類黃酮含量以 mg rutin equivalent/g dry weight (µg RE/mg)表示，PC 的總多酚含量為 6.65 ± 0.23 (µg RE/mg)。

第四節廣藿香甲醇萃取物巨噬細胞實驗一、

PCMeOH對RAW 264.7 細胞之毒性評估

(一)PCMeOH對RAW 264.7 細胞之存活率試驗：

為了確認在本實驗中，PCMeOH對組織細胞是否具毒性，我們將不同濃度的 PC_MeOH對 RAW 264.7 細胞進行 24 小時的反應處理，其存活率試驗結果如圖 22。由圖可知 PC_MeOH在 62.5 µg/mL 到 1,000 µg/mL 的濃度範圍下，對 RAW 264.7 細胞並不具有細胞毒性。因此，我們將 1,000 µg/mL PC_MeOH當成細胞實驗濃度。另外動物實驗濃度一般為細胞實驗濃度的 1,000 倍，故本實驗後續動物餵藥部分，PCMeOH的口服最高濃度取 1,000 mg/kg。

另外以 LPS (100 ng/ml)誘導 RAW 細胞產生發炎反應現象，由圖 23 顯示，不論是 LPS 誘導組或是治療組，還是單獨給予 PCMeOH

組別，其細胞之形態及存活數目，以 100 倍顯微鏡觀察，亦無發現明顯差異。

C el l v ia bi li ty (% o f c o nt ro l)

0 20 40 60 80 100 120

PC_MeOH concentration (µg/mL)

0 62.5 125 250 500 1000

圖 22. RAW 264.7 細胞存活率試驗

PCMeOH對 RAW 264.7 細胞進行 24 小時反應之存活率試驗，圖中每個數 值以 mean ± S.D.表示，n=3，其 p 值大於 0.05。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test) 。

Control LPS 100 ng/mL

LPS 100 ng/mL + PC_MeOH 1000μg/mL PCMeOH 1000 μg/mL 圖 23 PC_MeOH對 RAW 264.7 細胞進行 24 小時反應後之形態觀察

上述各圖皆以 100 倍觀察，給藥後 24 小時可觀察到各組間細胞形態並無明顯差異。

(一) PCMeOH對 LPS 誘導 RAW 264.7 細胞生成 NO 的影響

LPS 100 ng/mL Control

圖 24. PC_MeOH對 RAW 264.7 細胞生成 NO 的影響

PC_MeOH對LPS誘導RAW 264.7生成NO的影響，同時給予LPS及PC_MeOH進行24小時反應 後，以Greiss reagent分析NO的含量，圖中每個數值以mean ± S.D.表示，n=3，**p＜0.01,

***p＜0.001，皆與LPS (PC_MeOH0 μg/mL)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test) 。

二、

PCMeOH對LPS誘導RAW 264.7 細胞中細胞激素TNF-α生成之影響

當巨噬細胞受到外來刺激會活化釋放出一些細胞激素，其中，促發炎性細胞激素如：TNF-α、IL-1ß 會促進 iNOS 基因的表現而增加 NO 的生成。由於^PCMeOH

可抑制由 LPS 所誘導之 NO 的生成，因此本實驗進一步觀察 PCMeOH對不同細胞激素生成之影響。

如圖 25 同時給予不同濃度PCMeOH與 LPS 100 ng/mL 培養 24 小時後，對 RAW 264.7 生成 TNF-α 的影響。結果顯示， ^PCMeOH與 LPS 同時給予時，PC_MeOH可抑制 LPS 所誘導之 TNF-α 生成，並於 1000 µg/mL 抑制作用最為明顯。

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Tissue TNF-α Concentration (nmol/mg protein) ***

62.5 125 250 500

PC_MeOH (µg/mL) LPS 100 ng/mL

0 ¹⁰⁰⁰

圖 25. 細胞以 LPS 誘導及不同濃度 PC_MeOH培養 24 小時後，對 TNF-α 生成的影響 PC_MeOH對LPS誘導RAW 264.7生成TNF-α的影響，同時給予LPS及PCMeOH進行24小時反應後，分析其上清液TNF-α的含量，圖中每個數值以mean ± S.D.表示，n=3，**p＜0.01,

***p＜0.001，皆與LPS (PCMeOH 0 μg/mL)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test) 。

三、

PCMeOH對LPS誘導RAW 264.7 細胞中細胞激素IL-1ß生成之影響

62.5 125 250 500

PC_MeOH (µg/mL) Cell IL-1β Concentration (nmol/ml )

LPS 100 ng/mL

0 ¹⁰⁰⁰ PC_MeOH對LPS誘導RAW 264.7生成IL-1ß的影響，同時給予LPS及PC_MeOH進行24小時反應 後，分析其上清液IL-1ß的含量，圖中每個數值以mean ± S.D.表示，n=3，**p＜0.01, ***p

＜0.001，皆與LPS (PC_MeOH0 μg/mL)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test) 。

四、

PCMeOH對LPS誘導RAW 264.7 細胞

COX-2 與iNOS

生成之影響

125 250 500 1000

PCMeOH (μ g/kg)

** ***

Tissue COX-2 accumulation (%)

LPS

125 250 500 1000

PCMeOH (μ g/kg)

** ***

Tissue iNOS accumulation (%)

LPS

第五節廣藿香及廣藿香油動物實驗一、

鎮痛實驗

(一) 醋酸扭體反應試驗

口服給予 PCMeOH (1.0 g/kg)、PCO (10, 20 mg/kg)與 Indo (10 mg/kg)均可明顯減少由醋酸所引起疼痛之扭體次數，結果如圖 28, 29 所示。口服給予 PCMeOH (0.1,

0.5, 1.0 g/kg)治療，在中低濃度時 (0.1, 0.5 g/kg)，無法減少疼痛之扭體次數，高濃度 (1.0 g/kg)才能減少扭體次數，PCO 於 10, 20 mg/kg 即有明顯鎮痛效果。正對照組 Indo 具有明顯之鎮痛效果。

Number of Writhing Responeses

0 10 20 30 40

* * **

CON Indo 0.1 0.5 1.0

PC_MeOH (g/kg)

圖 28. PC_MeOH及 Indo 對醋酸誘導小鼠扭體反應之鎮痛試驗

PCMeOH及 indomethacin (Indo)對醋酸誘導小鼠扭體反應之鎮痛試驗，每個數值以 mean

± S.E.M.表示，n=6，**p＜0.01, ***p＜0.001，皆與 control (CON)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

Number of Writhing Responeses

0 10 20 30 40 50

* * ***

CON Indo 2 10 20

PCO (mg/kg)

***

圖 29. PCO 及 Indo 對醋酸誘導小鼠扭體反應之鎮痛試驗

PCO 及 indomethacin (Indo)對醋酸誘導小鼠扭體反應之鎮痛試驗，每個數值以 mean ± S.E.M.表示，n=6，***p＜0.001，皆與 control (CON)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

(二) 福馬林舔足實驗

L ick in g t im e ( sec)

PC_MeOH及 indomethacin (Indo) 對福馬林誘導小鼠前期舔足反應之鎮痛試驗，每個數值 以 mean ± S.E.M.表示，n=6，其 p 值大於 0.05，皆與 control (CON)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

L ick in g t im e ( sec)

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Early phase

CON Indo 2 10 20

PCO (mg/kg)

圖 31. PCO 及 Indo 對福馬林誘導小鼠前期舔足反應之鎮痛試驗

PCO 及 indomethacin (Indo) 對福馬林誘導小鼠前期舔足反應之鎮痛試驗，每個數值以 mean ± S.E.M.表示，n=6，其 p 值大於 0.05，皆與 control (CON)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

L ick in g t im e ( sec)

0 50 100 150 200 250

Late phase

* *

*

CON Indo 0.1 0.5 1.0

PC_MeOH (g/kg)

圖 32. PC_MeOH及 Indo 對福馬林誘導小鼠後期舔足反應之鎮痛試驗

PC_MeOH及 indomethacin (Indo) 對福馬林誘導小鼠後期舔足反應之鎮痛試驗，每個數值 以 mean ± S.E.M.表示，n=6，*p＜0.05, ***p＜0.001，皆與 control (CON)組比較。

(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

L ick in g t im e ( sec)

0 50 100 150 200 250 300

Late phase

* *

***

CON Indo 2 10 20

PCO(mg/kg)

圖 33. PCO 及 Indo 對福馬林誘導小鼠後期舔足反應之鎮痛試驗

PCO 及 indomethacin (Indo) 對福馬林誘導小鼠後期舔足反應之鎮痛試驗，每個數值以 mean ± S.E.M.表示，n=6，***p＜0.001，皆與 control (CON)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

二、

λ-角叉菜膠誘導足蹠腫脹實驗

PCMeOH及 indomethacin (Indo)對λ-角叉菜膠誘導小鼠足蹠腫脹之抗發炎試驗，每個數 值以 mean ± S.E.M.表示，n=6，*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001，皆與λ-carrageenan (Carr)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

1 2 3 4

∆V (ml)

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08

0.10 Carr

Carr + Indo (10 mg/kg ) Carr + PCO (2 mg/kg) Carr + PCO (10 mg/kg) Carr + PCO (20 mg/kg)

***

Time (hrs)

* * ***

p.o. i.p.

* *

圖 35. PCO 及 Indo 對λ-角叉菜膠誘導小鼠足蹠腫脹之抗發炎試驗

PCO 及 indomethacin (Indo)對λ-角叉菜膠誘導小鼠足蹠腫脹之抗發炎試驗，每個數值 以 mean ± S.E.M.表示，n=6，***p＜0.001，皆與λ-carrageenan (Carr)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

三、

抗氧化酵素及生化值測定實驗

S OD ( U/m g pr ote in) **

indo 0.1 0.5 1.0

***p＜0.001，皆與λ-carrageenan (Carr)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

0 10 20 30 40

***

S OD ( U/m g pr ote in) *

-

^Indo ² ¹⁰ ²⁰

PCO (mg/kg) Carr

圖 37. PCO 及 Indo 對小鼠肝臟抗氧化酵素 SOD 活性的影響

PCO 及 indomethacin (Indo)對於λ-角叉菜膠誘導小鼠足趾腫脹第四小時後，肝臟中抗 氧化酵素 SOD 活性的影響。圖中每個數值以 mean ± S.E.M.表示，n=6，*p＜0.05, ***p

＜0.001，皆與λ-carrageenan (Carr)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

2. GSH-Px活性測定

GS H- P x (U/m g pr ote in) * *

(C)

0.001，皆與λ-carrageenan (Carr)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

***

-

^Indo ² ¹⁰ ²⁰

PCO (mg/kg)

GS H- P x (U/m g pr ote in) * * ***

Carr

圖 39. PCO 及 Indo 對小鼠肝臟抗氧化酵素 GSH-Px 活性的影響

PCO 及 indomethacin (Indo)對於λ-角叉菜膠誘導小鼠足趾腫脹第四小時後，肝臟中抗 氧化酵素 GSH-Px 活性的影響。圖中每個數值以 mean ± S.E.M.表示，n=6，***p＜0.001，

皆與λ-carrageenan (Carr)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

3. GSH-Rd活性測定

GS H- R d ( U/m g pr ote in) * **

Carr (B)

-圖 40. PC_MeOH及 Indo 對小鼠肝臟抗氧化酵素 GSH-Rd 活性的影響

PCMeOH及 indomethacin (Indo)對於λ-角叉菜膠誘導小鼠足趾腫脹第四小時後，肝臟中 抗氧化酵素 GSH-Rd 活性的影響。圖中每個數值以 mean ± S.E.M.表示，n=6，*p＜0.05,

***p＜0.001，皆與λ-carrageenan (Carr)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

**

-

^Indo ² ¹⁰ ²⁰

PCO (mg/kg)

GS H- R d ( U/m g pr ote in) ***

Carr

圖 41. PCO 及 Indo 對小鼠肝臟抗氧化酵素 GSH-Rd 活性的影響

PCO 及 indomethacin (Indo)對於λ-角叉菜膠誘導小鼠足趾腫脹第四小時後，肝臟中抗 氧化酵素 GSH-Rd 活性的影響。圖中每個數值以 mean ± S.E.M.表示，n=6，**p＜0.01,

***p＜0.001，皆與λ-carrageenan (Carr)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

(二) 足蹠組織中發炎介質含量測定

T is sue C OX- 2 a cc um ula tion ( % )

Carr

-圖 42. PC_MeOH及 Indo 對 Carr 誘導小鼠足蹠發炎，足蹠中 COX-2 含量抑制率的影響 PCMeOH及 indomethacin (Indo)對於λ-角叉菜膠誘導小鼠足趾腫脹第四小時後，足蹠中 發炎介質 COX-2 含量抑制率的影響。圖中每個數值以 mean ± S.E.M.表示，n=6，*p＜

0.05, ***p＜0.001，皆與λ-carrageenan (Carr)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

0 20 40 60 80 100 120

Indo 2 10 20

PCO (mg/kg)

* ***

T is sue C OX- 2 a cc um ula tion ( % )

Carr

-圖 43. PCO 及 Indo 對 Carr 誘導小鼠足蹠發炎，足蹠中 COX-2 含量抑制率的影響 PCO 及 indomethacin (Indo)對於λ-角叉菜膠誘導小鼠足趾腫脹第四小時後，足蹠中發 炎介質 COX-2 含量抑制率的影響。圖中每個數值以 mean ± S.E.M.表示，n=6，**p＜

0.01, ***p＜0.001，皆與λ-carrageenan (Carr)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

2. 足蹠組織中脂質過氧化物MDA濃度測定

λ-角叉菜膠組之足蹠中 MDA 濃度明顯上升，而口服給予高濃度 PC^MeOH (0.1,

0.5 g/kg)或腹腔注射 Indo (10 mg/kg)皆能明顯抑制足蹠中脂質過氧化物 MDA 上升之現象，口服給予 PCO (10, 20 mg/kg)，結果如圖 44, 45 所示。

0 1 2 3 4

Indo 0.1 0.5 1.0

PC_MeOH (g/kg)

T is sue M DA T B AR S (nm ol/m g pr ote in) * * ***

-Carr

圖 44. PC_MeOH及 Indo 對 λ-角叉菜膠誘導小鼠足蹠發炎，足蹠中 MDA 含量的影響 PC_MeOH及 indomethacin (Indo)對於λ-角叉菜膠誘導小鼠足趾腫脹第四小時後，足蹠中 脂質過氧化物 MDA 含量的影響。圖中每個數值以 mean ± S.E.M.表示，n=6，***p＜

0.001，皆與λ-carrageenan (Carr)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

0 1 2 3 4

-

^Indo ² ¹⁰ ²⁰

PCO (mg/kg)

T is sue M DA T B AR S (nm ol/m g pr ote in) * * ***

Carr

圖 45. PCO 及 Indo 對λ-角叉菜膠誘導小鼠足蹠發炎，足蹠中 MDA 含量的影響 PCO 及 indomethacin (Indo)對於λ-角叉菜膠誘導小鼠足趾腫脹第四小時後，足蹠中脂 質過氧化物 MDA 含量的影響。圖中每個數值以 mean ± S.E.M.表示，n=6，***p＜0.001，

皆與λ-carrageenan (Carr)組比較。(One-way ANOVA followed by Scheffe’s multiple range test)。

3. 足蹠組織中IL-6 濃度測定

λ-角叉菜膠組之足蹠組織中 IL-6 濃度明顯上升，而口服給予 PC^MeOH (0.5,

在文檔中中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/32605 (頁 79-0)

第四章 結果

第一節 廣藿香GC-MS成分分析圖

第二節 廣藿香甲醇萃取物急性毒性試驗

第三節 廣藿香及廣藿香油抗氧化實驗 一、

Species and positive controls IC

(µg/mL)

二、

第四節 廣藿香甲醇萃取物巨噬細胞實驗 一、

C el l v ia bi li ty (% o f c o nt ro l)

二、

三、

四、

COX-2 與iNOS

第五節 廣藿香及廣藿香油動物實驗 一、

*** *** **

*** *** ***

***

L ick in g t im e ( sec)

L ick in g t im e ( sec)

Early phase

L ick in g t im e ( sec)

*** ***

*

L ick in g t im e ( sec)

*** ***

***

二、

***

*** *** ***

*** ***

三、

S OD ( U/m g pr ote in) **

***

S OD ( U/m g pr ote in) *

-

GS H- P x (U/m g pr ote in) *** ***

***

-

GS H- P x (U/m g pr ote in) *** *** ***

GS H- R d ( U/m g pr ote in) * **

**

-

GS H- R d ( U/m g pr ote in) ***

T is sue C OX- 2 a cc um ula tion ( % )

*** ** ***

T is sue C OX- 2 a cc um ula tion ( % )

T is sue M DA T B AR S (nm ol/m g pr ote in) *** *** ***

-

T is sue M DA T B AR S (nm ol/m g pr ote in) *** *** ***

第四章結果

第一節廣藿香GC-MS成分分析圖

第二節廣藿香甲醇萃取物急性毒性試驗

第三節廣藿香及廣藿香油抗氧化實驗一、

第四節廣藿香甲醇萃取物巨噬細胞實驗一、

第五節廣藿香及廣藿香油動物實驗一、

* * **

* * ***

* *

* *

* * ***

* *

GS H- P x (U/m g pr ote in) * *

GS H- P x (U/m g pr ote in) * * ***

* ***

T is sue M DA T B AR S (nm ol/m g pr ote in) * * ***

T is sue M DA T B AR S (nm ol/m g pr ote in) * * ***