細胞總蛋白質含量測定

細胞中萃取的總蛋白質含量，以進一步計算出於十二基硫酸鈉電泳法

(SDS-PAGE)中每一蛋白質sample 之需要量。定量方法乃是以牛血清蛋白(BSA) 作為標準蛋白質。先泡製stock濃度為10 mg/mL BSA 溶液，再以連續稀釋法配 製1~9 mg/mL等不同濃度之蛋白質標準溶液。分別取3 μl 加入1 ml 已稀釋5倍之 Coomassie® Brilliant Blue G-250染料(Bio-Rad dye)，混和均勻後於分光光度計波 長595 nm 下測量吸光值，並畫出標準曲線(standard curve)，當相關係數

(correlation coefficient)大於0.99 時接受此標準曲線。

先將定量之細胞培養於10 cm 培養皿24 小時後，於細胞中添加不同濃度之 PCMeOH培養24小時，利用100 μl lysis solution (150 mM NaCl / 1% Triton X-100 / 10 mM Tris, pH 7.4 / 5 mM EDTA / 1 mM phenyl methyl sulfony fluoride,

PMSF )，以12000 g 離心10分鐘，收集上清液(細胞蛋白質萃取液)。而後取3 μl 細 胞蛋白質萃取液加入1 ml已稀釋5倍之Bio-Rad dye 染料，混和均勻後於分光光度 計波長595 nm下測量吸光值，並利用上述之標準曲線計算出正確蛋白質含量。

每一樣本進行重複兩次(duplicate)之分析。

六、PC

對RAW 264.7 細胞之毒性評估：MTT

此項實驗以 PC_MeOH對 RAW 264.7 細胞之存活率試驗進行，一般認為實驗樣 品所選的濃度範圍，其細胞存活率宜大於 90%，方具有繼續進行實驗的意義，

故以不同濃度的 PCMeOH進行細胞之存活率試驗。將 RAW 264.7 細胞培養於 96 wells 培養盤中，每 well 的細胞數以 2×10⁴ cells 置入，體積為100 μL，培養液為

含 10% FBS 之 DMEM，培養於 5% CO₂、37 ℃之高濕度恆溫培養箱中。培養

24 小時，待細胞貼附好後，加入含 LPS (最終濃度為 100 ng/mL)，以及不同濃 度之 PCMeOH(最終濃度為 1000、500、250、125 及 62.5 µg/mL)，再培養 24 小時 後，始進行 MTT 試驗^(115-117)。MTT assay 主要是依賴活細胞內粒線體中琥珀酸去 氫酶的作用將 MTT【黃色水溶性固體】的 tetrazolium 轉變為藍紫色產物 MTT formazan (不溶性)⁽¹¹⁸⁾，如圖 13 所示。這種轉變僅發生於活細胞，而 MTT formazan 會堆積於細胞內，且 formazan 形成量會與活的細胞數目成正比。

圖 13. MTT 的還原過程⁽¹¹⁸⁾

實驗首先抽去每 well 中的培養液，用 DPBS 清洗 1 次，加入 90 μL 培養液 及 10 μL MTT 溶液 (1 µg/mL)，再放入培養箱中 4 小時，接著用 isopropanol (100 μL/well)溶出細胞中之藍紫色顆粒，最後以 570 nm 波長測定其吸光值，並以控

制組 (不添加 PCMeOH，僅有 LPS)之吸光值當 100 % 表示。

七、

取138 mg 之sodium nitrite 溶於20 ml 去離子水配置成100 mM stock

solution，在依序稀釋為0~500 μM不同濃度之nitrite 標準液，並加入Griess reagent 於波長540 nm分析nitrite含量，相關係數大於0.99時接受標準曲線，利用上述之 標準曲線對應計算出正確nitrite含量，結果以μM 表示之，每一樣本進行重複兩 次 (duplicate)之分析。

NO在自然界只短暫存在數秒鐘，體液或溶液中主要以其穩定之產物nitrite 與nitrate存在， 所以本實驗主要利用將0.1% naphthylenediamine dihydrochloride 與1% sulfanilamide/5% H₃PO4所組成之Griess reagent 與nitrite結合，呈現紅棕色 產物，在吸光值540 nm 偵測之，以溶液中nitrite 之含量代表NO之生成量⁽¹¹⁹⁾。

以5×10⁵細胞/well 培養於24 well培養皿24小時後，加入LPS 誘導NO 之生 成，同時加入不同濃度之PCMeOH繼續培養24小時後，取培養液到96 well microtiter plate 中，加入等量之Griess reagent，利用microplate reader於波長540 nm下測量 培養液中nitrite含量，以反應細胞中NO生成之情形。每一濃度樣本數為4 (n=4)，

並以sodium nitrite 取得的standard curve 以計算nitrite 含量之平均值 (mean)及 標準偏差 (standard deviation, SD)。

八、

利用分子量大小的不同而分離出不同之蛋白質。其中之SDS試劑是一種清潔 劑，主要可使蛋白質變性並帶負電荷，因而蛋白質於進行電泳時可由負極往正 極移動，並依分子量大小而使不同的蛋白質分離至不同之位置，分子量大的蛋

白質會因移動較慢，停留於電泳膠片之上方，分子量較小的蛋白質，則因其移 動較快而停留於電泳膠片之下方，以便分離不同之蛋白質分子。本實驗欲觀察 之蛋白質為iNOS與COX-2，其分子量分別為130 kDa 與72 kDa，故選用10%

SDS-PAGE 進行分析。主要是利用SDS-polyacrylamidegel system (GIBCO)製作 之電泳膠片 (4% stacking gel, 10% resolving gel)，並於電泳裝置 (Hoefer electro- phoresis system)中進行電泳步驟。取含有40 µg 總蛋白質之細胞蛋白質樣本萃取 液或4 μl protein marker (BioLabs 公司, New England)，加入等體積之treatment buffer (0.125 M Tris-HCl, pH 6.8 / 4% SDS, 20% glycerol / 10%

ß-mercaptoethanol)，並再加入適量之lysis solution 使所有蛋白質樣本達相同之總 體積，混合均勻後於100℃環境中加熱5分鐘使蛋白質變性，隨即將樣本分別注 入已製作完成之膠片內的well中，於電泳槽內外注入Tank buffer (25 mM Tris, pH 8.3 / 192 mM glycine / 0.1%SDS)，室溫下以100 mA進行2小時之電泳分離⁽¹²⁰⁾。

九、

將SDS-PAGE 所得之電泳膠片，利用半乾式轉移設備 (semi-dry unit)，使用 Towbin transfer buffer (20 mM Tris/ 192 mM glycine/ 1.3 mM SDS/ 10% Methanol) 為轉移緩衝溶液，於300 mA 環境下轉移2小時，而後將含蛋白質之PVDF膜，利 用Ponceau S solution (0.2% Ponceau S / 3% trichloroacetic acid)染色確定膠片上蛋 白質已轉印至膜上，並利用針頭標定protein marker 分子量位置，最後以蒸餾水 清洗去除膜上之紅色染劑再進行免疫分析。將含轉移蛋白質之PVDF膜浸於

blocking solution【5% non-fat milk/PBS-T(PBS in 0.2% Tween 20)】，於室溫下作 用1小時，以減少膜上非特異性之鍵結，並以PBS-T清洗PVDF膜5分鐘，連續三 次，接著加入1:1000倍之一級抗體 (iNOS或COX-2)於4 ℃下作用16小時，再以 PBS-T 重複清洗PVDF膜5分鐘四次，加入1:5000倍之二級抗體，於室溫下作用1 小時，同樣以PBS-T 重複清洗PVDF膜5分鐘5次。最後加入顯影劑

chemiluminescent HRP substrate，以冷光照相系統 (Fuji LAS-3000)拍攝，觀察蛋 白質之表現。

十、

ELISA 試劑組能快速且準確地偵測體內或體外之細胞激素，故本研究為確 定PC_MeOH是否會影響LPS誘導細胞激素生成，使用TNF-α與IL-1ß細胞激素試劑組 進行分析。

將定量之細胞培養於24 well培養皿中，24小時後加入LPS誘導NO之生成，

同時加入不同濃度之PC培養24小時後，分別收集培養基，並利用市售之cytokine 試劑組以ELISA分析培養基中不同之細胞激素TNF-α與IL-1ß的生成。

第八節 廣藿香及廣藿香油動物實驗 一、

1. 醋酸 (acetic acid)：購自 Merck 公司。

2. 福馬林 (formalin)：購自日本試藥株式會社。

3. 1,1,3,3-Tetraethoxypropane (TEP) 4. Thiobarbituric aicd (TBA)

5. Butylated hydroxytoluene (BHT) 6. λ-Carrageenan

7. Indomethacin (Indo) 8. Protein kits

以上試劑皆購自購自 Sigma 公司 9. SOD kits

10. GSH-Px kits 11. GSH-Rd kits

以上試劑皆購自 RANDOX 公司 12. TNF-α kits：購自 PeproTech 公司。

13. IL-1β：購自 PeproTech 公司。

14. IL-6：購自 PeproTech 公司。

以上試劑購自 PeproTech 公司

二、

2. 浮腫測定儀 (UGO Baslile Plethysmometer 7140)

3. ELISA 免疫螢光分析儀 (VersaMax; Massachusetts, USA ) 4. 高速冷凍離心機 (Backman GS-6R)

5. 壓電晶體生物感測器 (Piezoelectric quartz crystal biosensor; Asia New Technology)

三、

(一) 醋酸扭體反應

將不同劑量之廣藿香甲醇萃取物 (0.1, 0.5, 1.0 g/kg)及廣藿香油 (2, 10, 20 mg/kg)以口服方式投予，在給藥後 55 分鐘由腹腔注射 1％醋酸溶液 (每 10 g 體 重給予 0.1 mL)，誘發扭體反應，將小鼠置於觀察箱中，5 分鐘後開始觀察並以 計數器紀錄注射醋酸後第 5 到 15 分鐘，共 10 分鐘內，小鼠的扭體次數，並以 indomethacin (10 mg/kg, i.p.)作為正對照組，於注射醋酸前 25 分鐘給藥⁽¹²¹⁾。

(二) 福馬林舔足試驗

採用 Dubuisson 及 Dennis⁽⁵⁷⁾修飾後的方法，將不同劑量之廣藿香甲醇萃取 物 (0.1, 0.5, 1.0 g/kg)及廣藿香油 (2, 10, 20 mg/kg)以口服方式投予，在給藥後 60 分鐘，用微量注射器以 27 號針頭，在小鼠右後足蹠，皮下注射 20 μL 的 5％福

馬林溶液⁽¹²²⁾，立即將小鼠置入觀察箱中觀察，記錄早期及晚期反應時間，共紀

錄 30 分鐘⁽⁵⁹⁾。其中，第 0 到 5 分鐘之累積舔蹠秒數稱為早期 (early phase)之痛 覺反應時間；第 20 到 30 分鐘之累積舔蹠秒數稱為晚期 (late phase)之痛覺反應

時間。並以 Indo(10 mg/kg, i.p.)作為正對照組，於注射福馬林前 30 分鐘給藥。

(三) λ-角叉菜膠誘導足蹠腫脹試驗

此項實驗採λ-角叉菜膠誘導小鼠足蹠腫脹模式進行，用記號筆在小鼠右後 肢踝關節周圍做一標記，將小鼠右後足蹠浸入浮腫測定儀器，測量正常足蹠容 積後分別在小鼠右後足蹠皮下注射 1％ λ-角叉菜膠混懸液 (50 μL/隻)致炎⁽¹²³⁾。 誘導 2 小時後，將小鼠分別以不同劑量之廣藿香甲醇萃取物 (0.1, 0.5, 1.0 g/kg) 以及廣藿香油 (2, 10, 20 mg/kg)口服方式投予，誘導後 2.5 小時腹腔注射正對照 組 Indo(10 mg/kg)，給藥量皆為 0.1 mL/10 g。給 λ-角叉菜膠混懸液 (50 μL/隻) 致炎後，每隔 1 小時，各測一次足蹠容積，連續測 4 小時，紀錄結果，並分別 計算誘導後每小時足蹠體積與誘導前個別足蹠體積差 (△V)。

(四) 肝臟抗氧化酵素

分別在小鼠右後肢足蹠皮下注射 1％ λ-角叉菜膠混懸液 (50 μL/隻)致炎。

誘導 1 小時後，分別將不同劑量之廣藿香甲醇萃取物 (0.1, 0.5, 1.0 g/kg)及廣藿 香油 (2, 10, 20 mg/kg)以口服方式投予；於誘導後 2.5 小時腹腔注射正對照組

Indo(10 mg/kg)。誘導後第 4 小時，將動物犧牲，採集肝臟，分別將大葉置於福 馬林以待日後切片；其餘肝組織部分以夾鏈袋收集，冷凍於-80 ℃，並剪取小鼠 右後肢足蹠，冷凍於-80 ℃。

1. 肝組織抗氧化酵素活性測定

以肝重 (g)與 0.9%的 normal saline (含 protease inhibiter )比例一比一方式在

清液放入新的 eppendorf 中，置入-80 ℃冷凍儲存備用。

A. 總蛋白質濃度測定

取肝均質液50 μL，加入 350 μL 的 0.9%之 normal saline 混和均勻，加入 Biuret reagent (Sodium hydroxide 100 mmol/L, Na-K-tartrate 16 mmol/L, potassium iodide 15 mmol/L, cupric sulphate 6 mmol/L)使產生呈增色反應，波長 550 nm 條件 下測量吸光值，每隔 25 秒測量一次吸光值變化，於反應第 15 min 達反應終點，

以人血清為 protein standard，濃度 (6.0 g/dL)產生吸光值變化扣除 blank reagent (Sodium hydroxide 100 mmol/L, Na-K-tartrate 16 mmol/L)之吸光度差，換算出轉換 係數 (F)，進而換算出肝組織總蛋白質之濃度，肝組織總蛋白質之表示方式為 g/dL。

B. SOD activity assay

取150 μL 均質液置於 enpendoff 中，加入 900 μL 的冰二次去離子水，4 ℃，

冷藏 15 分鐘，混合均勻。取 20 μL 的混合液加入 260 μL 0.1M phosphate buffer (3-cyclohexylamino-1-propanesulfonic acid；CAPS 40 mmol/L, EDTA 0.94 mmol/L, pH 7.0)均勻混合，最終，取 5 μL 混合液加入 340 μL mixed substrate (xanthine 0.05 mmol/L, I.N.T 0.025 mmol/L)，再加入 xanthine oxidase 呈色，混合均勻後於溫度 37 ℃、波長 505 nm 下測量吸光值，每隔 30 秒測量一次，總共測量 3 分鐘，計 算每分鐘吸光值變化速率，以多重校正曲線計算濃度⁽¹²⁴⁾。SOD 活性以單位時間 內抑制 I.N.T 自動氧化速率為一單位 (U)，肝組織內 SOD 活性以 U/mg protein 表示。

C. Glutathione Reductase activity assay

使用 Guntherberg 及 Rost⁽¹²⁵⁾在 1996 年所提出之方法。取 100 μL 的均質液，

倒入 100 μL 的冰二次水，2-8 ℃冷藏 10 分鐘。離心 12000 g，5 分鐘。取上清 液 25 μL，加入 475 μL 之 0.9 % 的 normal saline，混合均勻。取混合液 50 μL 於 Cuvette 中，依序加入等量的 glutathione reductase buffer (250 mmol/L, pH7.3

kupfer phosphate 與 EDTA 0.5 mmol/L)與 substrate (GSSG 2.2 mmol/L)與 NADPH (0.17 mmol/L)混合均勻，於波長 340 nm 下測量吸光值⁽¹²⁶⁾，肝組織內之 GSH-Rd 活性表是方式為 U/mg protein。

D. Glutathione Peroxidase activity assay

本方法依 Paglia 及 Valentine 在 1967 所提出之方法為基礎⁽¹²⁷⁾，使用

glutathione 及 cumene hydroperoxide 與 GSH-Px 反應，再以 NADPH 與 glutathione reductase 將氧化態的 GSSG (oxidised glutathione)迅速轉成還原態，伴隨著

NADPH 氧化成 NADP⁺，以吸光值之減少速率來表示 GSH-Px 之活性(圖 14)⁽¹²⁸⁾。

圖 14. 肝臟抗氧化酵素作用機轉

取均質液25 μL，加入 500 μL 的 diluting agent 稀釋。取上清液 500 μL，隨 即加入 Reagent 1 (glutathione 4 mmol/L、glutathione reductase 0.5 U/L, NADPH

用，於溫度 37℃、波長 340 nm 下測量吸光值⁽¹²⁹⁾，計算吸光值變化速率 (U/L)，

肝組織內 glutathione peroxidase 活性表示方法為 U/mg protein。

(五) 足蹠組織生化值測定 1. COX-2 濃度測定

A. 檢品的製備

取腳組織以均質機於低溫下均質，均質前須加入四倍量含蛋白質酶抑制劑

取腳組織以均質機於低溫下均質，均質前須加入四倍量含蛋白質酶抑制劑