細胞激素TNF- α、IL-1ß 之分析

ELISA 試劑組能快速且準確地偵測體內或體外之細胞激素，故本研究為確 定PC_MeOH是否會影響LPS誘導細胞激素生成，使用TNF-α與IL-1ß細胞激素試劑組 進行分析。

將定量之細胞培養於24 well培養皿中，24小時後加入LPS誘導NO之生成，

同時加入不同濃度之PC培養24小時後，分別收集培養基，並利用市售之cytokine 試劑組以ELISA分析培養基中不同之細胞激素TNF-α與IL-1ß的生成。

第八節 廣藿香及廣藿香油動物實驗 一、

1. 醋酸 (acetic acid)：購自 Merck 公司。

2. 福馬林 (formalin)：購自日本試藥株式會社。

3. 1,1,3,3-Tetraethoxypropane (TEP) 4. Thiobarbituric aicd (TBA)

5. Butylated hydroxytoluene (BHT) 6. λ-Carrageenan

7. Indomethacin (Indo) 8. Protein kits

以上試劑皆購自購自 Sigma 公司 9. SOD kits

10. GSH-Px kits 11. GSH-Rd kits

以上試劑皆購自 RANDOX 公司 12. TNF-α kits：購自 PeproTech 公司。

13. IL-1β：購自 PeproTech 公司。

14. IL-6：購自 PeproTech 公司。

以上試劑購自 PeproTech 公司

二、

2. 浮腫測定儀 (UGO Baslile Plethysmometer 7140)

3. ELISA 免疫螢光分析儀 (VersaMax; Massachusetts, USA ) 4. 高速冷凍離心機 (Backman GS-6R)

5. 壓電晶體生物感測器 (Piezoelectric quartz crystal biosensor; Asia New Technology)

三、

(一) 醋酸扭體反應

將不同劑量之廣藿香甲醇萃取物 (0.1, 0.5, 1.0 g/kg)及廣藿香油 (2, 10, 20 mg/kg)以口服方式投予，在給藥後 55 分鐘由腹腔注射 1％醋酸溶液 (每 10 g 體 重給予 0.1 mL)，誘發扭體反應，將小鼠置於觀察箱中，5 分鐘後開始觀察並以 計數器紀錄注射醋酸後第 5 到 15 分鐘，共 10 分鐘內，小鼠的扭體次數，並以 indomethacin (10 mg/kg, i.p.)作為正對照組，於注射醋酸前 25 分鐘給藥⁽¹²¹⁾。

(二) 福馬林舔足試驗

採用 Dubuisson 及 Dennis⁽⁵⁷⁾修飾後的方法，將不同劑量之廣藿香甲醇萃取 物 (0.1, 0.5, 1.0 g/kg)及廣藿香油 (2, 10, 20 mg/kg)以口服方式投予，在給藥後 60 分鐘，用微量注射器以 27 號針頭，在小鼠右後足蹠，皮下注射 20 μL 的 5％福

馬林溶液⁽¹²²⁾，立即將小鼠置入觀察箱中觀察，記錄早期及晚期反應時間，共紀

錄 30 分鐘⁽⁵⁹⁾。其中，第 0 到 5 分鐘之累積舔蹠秒數稱為早期 (early phase)之痛 覺反應時間；第 20 到 30 分鐘之累積舔蹠秒數稱為晚期 (late phase)之痛覺反應

時間。並以 Indo(10 mg/kg, i.p.)作為正對照組，於注射福馬林前 30 分鐘給藥。

(三) λ-角叉菜膠誘導足蹠腫脹試驗

此項實驗採λ-角叉菜膠誘導小鼠足蹠腫脹模式進行，用記號筆在小鼠右後 肢踝關節周圍做一標記，將小鼠右後足蹠浸入浮腫測定儀器，測量正常足蹠容 積後分別在小鼠右後足蹠皮下注射 1％ λ-角叉菜膠混懸液 (50 μL/隻)致炎⁽¹²³⁾。 誘導 2 小時後，將小鼠分別以不同劑量之廣藿香甲醇萃取物 (0.1, 0.5, 1.0 g/kg) 以及廣藿香油 (2, 10, 20 mg/kg)口服方式投予，誘導後 2.5 小時腹腔注射正對照 組 Indo(10 mg/kg)，給藥量皆為 0.1 mL/10 g。給 λ-角叉菜膠混懸液 (50 μL/隻) 致炎後，每隔 1 小時，各測一次足蹠容積，連續測 4 小時，紀錄結果，並分別 計算誘導後每小時足蹠體積與誘導前個別足蹠體積差 (△V)。

(四) 肝臟抗氧化酵素

分別在小鼠右後肢足蹠皮下注射 1％ λ-角叉菜膠混懸液 (50 μL/隻)致炎。

誘導 1 小時後，分別將不同劑量之廣藿香甲醇萃取物 (0.1, 0.5, 1.0 g/kg)及廣藿 香油 (2, 10, 20 mg/kg)以口服方式投予；於誘導後 2.5 小時腹腔注射正對照組

Indo(10 mg/kg)。誘導後第 4 小時，將動物犧牲，採集肝臟，分別將大葉置於福 馬林以待日後切片；其餘肝組織部分以夾鏈袋收集，冷凍於-80 ℃，並剪取小鼠 右後肢足蹠，冷凍於-80 ℃。

1. 肝組織抗氧化酵素活性測定

以肝重 (g)與 0.9%的 normal saline (含 protease inhibiter )比例一比一方式在

清液放入新的 eppendorf 中，置入-80 ℃冷凍儲存備用。

A. 總蛋白質濃度測定

取肝均質液50 μL，加入 350 μL 的 0.9%之 normal saline 混和均勻，加入 Biuret reagent (Sodium hydroxide 100 mmol/L, Na-K-tartrate 16 mmol/L, potassium iodide 15 mmol/L, cupric sulphate 6 mmol/L)使產生呈增色反應，波長 550 nm 條件 下測量吸光值，每隔 25 秒測量一次吸光值變化，於反應第 15 min 達反應終點，

以人血清為 protein standard，濃度 (6.0 g/dL)產生吸光值變化扣除 blank reagent (Sodium hydroxide 100 mmol/L, Na-K-tartrate 16 mmol/L)之吸光度差，換算出轉換 係數 (F)，進而換算出肝組織總蛋白質之濃度，肝組織總蛋白質之表示方式為 g/dL。

B. SOD activity assay

取150 μL 均質液置於 enpendoff 中，加入 900 μL 的冰二次去離子水，4 ℃，

冷藏 15 分鐘，混合均勻。取 20 μL 的混合液加入 260 μL 0.1M phosphate buffer (3-cyclohexylamino-1-propanesulfonic acid；CAPS 40 mmol/L, EDTA 0.94 mmol/L, pH 7.0)均勻混合，最終，取 5 μL 混合液加入 340 μL mixed substrate (xanthine 0.05 mmol/L, I.N.T 0.025 mmol/L)，再加入 xanthine oxidase 呈色，混合均勻後於溫度 37 ℃、波長 505 nm 下測量吸光值，每隔 30 秒測量一次，總共測量 3 分鐘，計 算每分鐘吸光值變化速率，以多重校正曲線計算濃度⁽¹²⁴⁾。SOD 活性以單位時間 內抑制 I.N.T 自動氧化速率為一單位 (U)，肝組織內 SOD 活性以 U/mg protein 表示。

C. Glutathione Reductase activity assay

使用 Guntherberg 及 Rost⁽¹²⁵⁾在 1996 年所提出之方法。取 100 μL 的均質液，

倒入 100 μL 的冰二次水，2-8 ℃冷藏 10 分鐘。離心 12000 g，5 分鐘。取上清 液 25 μL，加入 475 μL 之 0.9 % 的 normal saline，混合均勻。取混合液 50 μL 於 Cuvette 中，依序加入等量的 glutathione reductase buffer (250 mmol/L, pH7.3

kupfer phosphate 與 EDTA 0.5 mmol/L)與 substrate (GSSG 2.2 mmol/L)與 NADPH (0.17 mmol/L)混合均勻，於波長 340 nm 下測量吸光值⁽¹²⁶⁾，肝組織內之 GSH-Rd 活性表是方式為 U/mg protein。

D. Glutathione Peroxidase activity assay

本方法依 Paglia 及 Valentine 在 1967 所提出之方法為基礎⁽¹²⁷⁾，使用

glutathione 及 cumene hydroperoxide 與 GSH-Px 反應，再以 NADPH 與 glutathione reductase 將氧化態的 GSSG (oxidised glutathione)迅速轉成還原態，伴隨著

NADPH 氧化成 NADP⁺，以吸光值之減少速率來表示 GSH-Px 之活性(圖 14)⁽¹²⁸⁾。

圖 14. 肝臟抗氧化酵素作用機轉

取均質液25 μL，加入 500 μL 的 diluting agent 稀釋。取上清液 500 μL，隨 即加入 Reagent 1 (glutathione 4 mmol/L、glutathione reductase 0.5 U/L, NADPH

用，於溫度 37℃、波長 340 nm 下測量吸光值⁽¹²⁹⁾，計算吸光值變化速率 (U/L)，

肝組織內 glutathione peroxidase 活性表示方法為 U/mg protein。

(五) 足蹠組織生化值測定 1. COX-2 濃度測定

A. 檢品的製備

取腳組織以均質機於低溫下均質，均質前須加入四倍量含蛋白質酶抑制劑 之緩衝溶液，以 12000 g 離心 5 分鐘，取上清液備用。

B. 定量蛋白質含量

取腳均質液 10 μL，加入 700 μL 的 0.9%之 normal saline 混和均勻，加入 Biuret reagent (Sodium hydroxide 100 mmol/L, Na-K-tartrate 16 mmol/L, potassium iodide 15 mmol/L, cupric sulphate 6 mmol/L)使產生呈增色反應，波長 550 nm 條件 下測量吸光值，每隔 25 秒測量一次吸光值變化，於反應第 15 分鐘達反應終點，

以胎牛血清為 protein standard，濃度 (6.0 g/dL)產生吸光值變化扣除 blank reagent (Sodium hydroxide 100 mmol/L, Na-K-tartrate 16 mmol/L)之吸光度差，換算出轉換 係數 (F)，進而換算出腳組織總蛋白質之濃度，腳組織總蛋白質之表示方式為 g/dL。

C. QCM 測量腳組織 COX-2 含量

壓電晶體生物感測器採用 QCM 的原理，在固定壓力下，晶片表面的感測器 會表現出特定頻率，當晶片表面質量改變時，會引起共振頻率衰減，藉由訊號

實驗原理

放大器的放大，在輸出後可以圖示清楚表示其前後頻率變化，利用衰減量算出 質量的變化，其有效的精確度可以達到 10^-12 g。利用公式ΔF=K*Δm/A 可求得濃 度與頻率衰減的對應關係，以此作為定量的標準 (圖 15)。

首先以舊晶片上機，清除管路間氣泡，再換上新的晶片置入 flow cell 內測 頻率，代頻率穩定後 (5 Hz/500 sec)，便可開始實驗。實驗步驟依序注入戊二醛

(2.5% glutaldehyde, GA)400 μl 作為 coupling reagent，以活化晶片表面的功能性集 團。繼續注入 100 µg/ml COX-2 antibody 400μl，使其一端黏附在晶體表面，而另 一端則負責與樣品中的抗原結合，注入 blocking reagent(1M glycine)400 μl，填補 晶片表面空隙，防止非代測物與晶片薄膜結合，造成誤差，之後注入樣品 400 μl，

以測定各組 COX-2 之含變化⁽¹³⁰⁾。 實驗步驟

圖 15. QCM 偵測 COX-2 濃度圖

圖中:A:注入 2.5% GA 活化晶片表面功能集團 B:注入單株抗體 C:注入 blocking

reagent D:注入檢品後的變化 1:注入檢品前，晶片的振動頻率 (Hz)；2: 注入檢品後，

晶片的振動頻率 (Hz)；3:為兩者相減後得到的振幅

2. IL-6 濃度測定

本分析是採用定量的三明治酵素免疫分析法 (quantitative sandwich enzyme immunoassay technique)來測定 mouse IL-6 的濃度。一種對 IL-6 有特異性的 monoclonal antibody 已經先被結合在 microplate 上，當標準品和樣品被加入 wells 後，加入對 IL-6 有特異性的 enzyme-linked polyclonal antibody，最後加入 substrate

reagent 等顏色呈現後便終止反應，在波長 450 nm 的吸光值下得到樣本中 IL-6 的濃度。所呈現的顏色深度和 IL-6 的濃度成正比⁽¹³¹⁾。

首先以連續稀釋法方式配置標準溶液，濃度分別為 1000、250、62.5 與 15.6 B

A

C

D 1 2

3

pg/mL 四組，配置流程如表 2，另外將 IL-6 抗體(50 μL)加入 96 孔盤，再將標準 品及檢品加 50 μL 到指定 wells (除 Blank 外)，室溫下，振搖 2 小時，之後以 400 μL wash buffer 沖洗 3 次，再加入 100 μL streptavidin-HRP conjugat 後，室溫下振

搖 2 小時，用400 μL wash buffer 沖洗 3 次，加入 100 μL TMB substrate 後，避光 振搖 30 分鐘，最後加入 100 μL stop solution，然後以 ELISA 在波長 405 nm 下測 定其吸光值。流程如表 3 之說明

表 2. IL-6 標準品濃度之配製表

Test tube Standard diluent Standard 4,000 (pg/mL) IL-6 Concentration

Stock 300 μL 100 μL 1,000 (pg/mL)

Streptavidin-HRP conjugate 100 μL 100 μL 100 μL

Room temperature 2 hr, sealed →→→ →→→ →→→

3. TNF-α濃度測定

本分析是採用定量的三明治酵素免疫分析法 (quantitative sandwich enzyme immunoassay technique)來測定 mouse TNF-α 的濃度。一種對 TNF-α 有特異性的 monoclonal antibody 已經先被結合在 microplate 上，當標準品和樣品被加入 wells 後，加入對 TNF-α 有特異性的 enzyme-linked polyclonal antibody，加入 substrate solution，incubation 一段時間後，加入 substrate reagent 使顏色呈現出來，終止 反應後，在波長 490 nm 下測得該樣品所含 TNF-α 濃度⁽¹³²⁾。

首先製備 TNF-α 標準曲線，以連續稀釋法製備八個濃度的標準溶液

(2000~15.625 pg/kg)。配製流程如表 4。另外將 TNF-α 抗體(50 μL)加入 96 孔盤，

再將標準品及檢品加 50 μL 到指定 wells (除 Blank 外)，室溫下，振搖 2 小時，

之後以400 μL wash buffer 沖洗 3 次，再加入 100 μL streptavidin-HRP conjugat 後，

室溫下振搖 2 小時，用 400 μL wash buffer 沖洗 3 次，加入 100 μL TMB substrate 後，避光振搖 30 分鐘，最後加入 100 μL stop solution，然後以 ELISA 在波長 405 nm 下測定其吸光值。流程如表 5 之說明。

表 4. TNF-α 標準品濃度之配製表

Test tube Assay buffer TNF standard

20,000 (pg/mL)

TNF

Streptavidin-HRP conjugate 100 μL 100 μL 100 μL

Room temperature 30 min, sealed →→→ →→→ →→→

4. MDA 濃度測定

參考 Nakhai 等人於 2007 年的方法⁽¹³³⁾，即 MDA 與 thiobarbituric acid (TBA) 在酸性高溫下會形成紅色複合物 TBARS。此複合物在波長 532 nm 下，具有吸 光值，利用此原理可測定樣品所含 MDA 濃度。

首先將 TEP 以 0.01 N 的 HCl 依表 6 稀釋配置成 20~0.625 μM 六個濃度，作 為 MDA 標準溶液 (表 6)。取100 μL 樣品及標準品置入 eppendorf (包鋁箔)中，

依序加入 BHT 及 TBA (300μL)(表 7)，再以震盪器混合均勻後，置於 90 ℃水浴 鍋中加熱 45 分鐘。之後取出，置於室溫冷卻 10 分鐘，加入 445 μL 正丁醇，混 合搖盪 1 分鐘。然後離心 (3,000 g, 4 ℃, 5 分鐘) ，吸取上層液 (粉紅色)，以 ELISA 於 532 nm 波長下測吸光值。

表 6. MDA 標準品濃度配製表

MDA 濃度 ( μM) 0.625 1.25 2.5 5 10 20

TEP intermediate standard solution (mL) 0.15 0.3 0.6 1.2 2.4 4.8

0.01 N HCl (mL) 9.85 9.7 9.4 8.8 7.6 5.2

表 7. 加入 MDA 試劑流程表

標準品或樣品

(μL) BHT 試液 (μL) TBA 試液 (μL)

Blank 100 (0.01N HCl) 45 300

MDA standard 100 45 300

Sample 100 45 300

(六) 組織切片染色實驗方法

1. 蘇木紫－伊紅染色 (H.E. stain)

剪取實驗鼠之右後肢足蹠，於 10%的中性福馬林固定一段時間 (約一週) 後，再將此足蹠組織以脫水浸蠟機先進行脫水，再進行石臘包埋。包埋後以旋 轉式切片機切成約4~5 μm之足蹠組織切片。進行蘇木紫－伊紅染色(Hematoxylin

& Eosin stain)，於光學顯微境下觀察各組足蹠組織之特異情況及組織病理變化，

比較並拍照評估足蹠發炎程度⁽¹³⁴⁾。

2. 免疫組織化學染色 (immunohistochemical stain, IHC stain)

剪取實驗鼠之右後肢足蹠，於 10%的中性福馬林固定一段時間 (約一週) 後，再將此足蹠組織以脫水浸蠟機先進行脫水，再進行石臘包埋。包埋後以旋 轉式切片機切成約 4~5 μm 之足蹠組織切片。分別針對 COX-2 及 iNOS 進行免疫 組織化學染色，於光學顯微境下觀察各組足蹠組織之 COX-2 及 iNOS 之表現程 度，以褐色表示陽性反應，亦即染色片上褐色區域越多，表示 COX-2 及 iNOS

剪取實驗鼠之右後肢足蹠，於 10%的中性福馬林固定一段時間 (約一週) 後，再將此足蹠組織以脫水浸蠟機先進行脫水，再進行石臘包埋。包埋後以旋 轉式切片機切成約 4~5 μm 之足蹠組織切片。分別針對 COX-2 及 iNOS 進行免疫 組織化學染色，於光學顯微境下觀察各組足蹠組織之 COX-2 及 iNOS 之表現程 度，以褐色表示陽性反應，亦即染色片上褐色區域越多，表示 COX-2 及 iNOS