第三章 材料與方法
第二節 實驗方法
2.9 引子合成 (Primer Synthesis)
本實驗所需的引子(Primer)皆為生工公司製備，各組引子之條件 設定請參閱下述：
(a) sense primer of FGF -2(5,-GCATCACTTCGCTTCCCGCA-3,) antisense primer of FGF- 2 (5,-TCTGTCCAGGCCCCGTTTTG-3,) (b) sense primer of UPA(5,-GTGCAGGACTGCTCTCTCAG-3,)
antisense primer of UPA(5,-GAGGTCCTCCTGAATCTCCC-3,) (c) sense primer of PAI-I (5,-TGAGATCAGTACTGCGGACG-3,)
antisense primer of PAI-I(5,-GAGGGGCACATCTTTTTCAA-3,) (d) sense primer of Cyclin A (5,-GCAGAGTTCTGATGGAGAGA-3,) antisense primer of Cyclin A (5,-ACAGTCTTGCAGGTGACATC-3,) (e) sense primer of Cyclin B (5,-CTGCTGCAGGAGACCATGTA-3,) antisense primer of Cyclin B (5,-CTCCGTGTGGGACAGGTAGT-3,) (f) sense primer of Cyclin D (5,-AGGAGACCATTCCCCTGACT-3,)
antisense primer of Cyclin D (5,-TTCTTCCTCCACTTCCCCTT-3,) (g) sense primer of Cyclin E (5,-CTTACCTGAGAGATGAGCAC-3,)
antisense primer of Cyclin E (5,-CACCACTGATAACCTGAGAC-3,) (h) sense primer of GAPDH(5,-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3,)
antisense primer of GAPDH(5,-CCACAGTCTTCTGAGTGGCA-3,)
2.10 聚合酵素連鎖反應(polymerase Chain Reaction，PCR)
取 5μl cDNA 加入 11μl ddH2O、2.5μl forward primer、2.5 μl reverse primer、1μl dNTP (10 mM)、25μl 10 × PCR buffer (DyNA；10 Mm Tris- HCl、1.5 mM MgCl2、50 mM KCl 0.1% Triton X-100) 和 0,5μl DNA polymerase (DyNA；2U/μl)，混合均勻後，再將樣 品放回 PCR 機器中，以 94℃反應 5 分鐘之後，進入 PCR 循環：94℃
ㄧ分鐘、primer 煉合(annealing)溫度，30 秒、72℃，一分鐘。其中 循環次數依及煉合溫度則依 RNA 表現量及 primer Tm 値來決定，接著 再以 72℃反應 10 分鐘，最後以 4℃保存。
2.11 DNA 電泳
依照不同產物的片段大小分別配製 0.8、1.2、1.6 % DNA 電泳膠 片(agarose gel)。取 5 或 10μl PCR 產物加入 1 或 2μl 之 6 × DNA loading dye，混合均勻，再將其緩慢注入 DNA 電泳膠片之 well 中。
以 100 伏特強度之電壓進行約 35 分鐘電泳；最後以 Ethidium bromide (EtBr)作用於電泳膠片約 10~20 分鐘，利用 UV 光分析 PCR 產物其表 現情形為何。
2.12 細胞總蛋白萃取
細胞依實驗需求處理過後，倒掉培養液，用 PBS 清洗細胞 2~3 次；再加入適量(150~200μl/dish)的 lysis buffer (50mM PH7.5 Tris- base、0.5M NaCl、1 mM pH8 EDTA、1 Mm beta-mercaptoethanol、
1% NP40、1% Glycerol、protein kinase inhibitor 兩錠，溶於二 次水中，總體積 20ml)，以細胞刮棒收集細胞。收集的細胞置於冰上 反應 30 分鐘，每隔 5 分鐘震蕩一次，接著以 12000 rpm、4℃ 離心 20 分鐘，收取上清液即為細胞之總蛋白，可保存於-80℃。
2.13 蛋白質定量
萃取好的蛋白以二次水做適量稀釋(10 公分培養皿培養之細胞 以 200μl lysis buffer 收集的總蛋白約稀釋成 10~20 倍用以定量) 同時以 Bovine Serum Albumin(BSA)做出蛋白質標準曲線當作對照，
分別稀釋成 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml 的標準品。以相同體
積的標準品以及蛋白稀釋液，分別加入 250μl 之 Alkaline Copper reagent(2% Na-K tartrate、1% CuSO4．5H2O、2% Na2CO3 in 0.1N NaOH；
三者以 1：1：98 之比例混合)，室溫作用 10 分鐘，接著加入 25μl 之 Folin – Ciocalteu phenol reagent，室溫作用 30 分鐘，抽取 200μl 至 96 孔盤中，以 750 nm 波長測定吸光值，待測蛋白之數值 回歸到標準品所作出標準曲線，即可得知待測蛋白濃度。
2.14 西方墨點(Western blotting)
取樣品蛋白質 40~50 μg，再加入 5μl loading dye，並用 1 倍 的 PBS 將總體積補至 25μl；混合均勻後，將樣品蛋白以 99℃
denature 5 分鐘，將水氣 spin down 後，即可進行 SDS-PAGE 電泳分 析。SDS-PAGE 之上層膠為 4% 之 stacking gel，下層膠為 8%~15% (依 所預測定之蛋白質分子量大小決定) 之 separating gel。把
denature 過的樣品蛋白 loading 至上層膠的 U 型槽(well)中，以 running buffer 跑膠 75 伏特、兩個小時。待電泳結束即可進行轉漬 (transfer)，以 transfer holder 的白色部份為底部，逐一平鋪浸 濕之菜瓜布、Whatman 3M 濾紙、預先以甲醇浸泡的 PVDF 膜、下層膠 (separating gel)、Whatman 3M 濾紙、菜瓜布；要注意每層物質間 不能含有氣泡。將 transfer holder 固定後，即可置於
electrotransfer tank，並注入 transfer buffer，於 4℃下進行電 轉漬(transfer)100 伏特、90 分鐘。轉漬完成後，取出 PVDF 膜並加 入 blocking buffer 於室溫下搖動 1 小時；加入 1 級抗體(2μl/ml with blocking buffer)，於 4℃下反應 overnight；之後以 1 倍的 TBS buffer 清洗 PVDF 膜三次，每次 15 分鐘。而後加入 2 級抗體(2 μl/ml with TBS buffer)，並於室溫下反應 1 小時，再用 1 倍的 TBS buffer 清洗 PVDF 膜三次，每次 15 分鐘；最後以 ECL kit 進行冷光 呈色反應。
2.15 細胞移動實驗(Migration assay)
將細胞株培養在 6 公分培養皿，養至約 7 分滿時，換上不含酚紅 的培養液，並將細胞做不同試劑處理。接著，把反應過後的細胞利用 PBS 清洗後，加入 1％ Trypsin 將細胞從培養皿上游離下來，溶於 1 ml 含有 1% Charcoal FBS 的培養液中，計算細胞總數，並將每盤細 胞稀釋成 1.5 × 104 cells / 50μl( 30 × 104 cells / 1 ml)之濃 度。細胞的前處理完成之後，便可將 48 well Boyden chambers (Neuro Probe，MD，USA) 打開，於下層 chamber 注入含有 10% Charcoal FBS 的培養液；其含量為 32μl/well。下層 chamber 上再進一步依序放 置 8μm pore size 的 polycarbonate filter、塑膠墊、上層 chamber
，用螺絲將 chamber 的 6 個角落都鎖緊後，於上層 chamber 加入 50 μl 之前所稀釋的細胞溶液，過程中應注意避免氣泡的產生。用保鮮 膜蓋上 chamber，在 37℃，5% 二氧化碳的環境之下培養 4~6 小時後，
把 chamber 拆開，小心把 filter 拿出，將接近下層較粗糙的那面以 甲醇固定 10 分鐘，再利用 0.5% Giemsa 染色 1 小時；用二次水退染，
之後用拭鏡紙將 filter 背面擦拭乾淨，並將 filter 固定在新的培 養皿上，在光學顯微鏡下觀察且計算移動之細胞數目。
2.16 蛋白分解酵素膠電泳法 (Gelatin Zymography Protease Assay)
將已經與黃耆反應 24 小時後的細胞培養液與 5 倍蛋白質 loading dye 混合後，置入 0.1 % gelatin – 8 % SDS-PAGE 中，在 120 V 下 跑電泳 3~4 小時。接著將電泳膠片取下，以 2.5 % Triton X-100 溶 液搖晃沖洗 30 分鐘兩次，使蛋白酵素功能還原。再將此電泳膠片培 養於 200 ml 的反應液中( 40 mM Tris-HCl , pH 8.0 ; 10 mM CaCl2 , 0.01 % NaN3 ) , 37 ℃、16 小時；最後以 0.25 % 的 Coomassie blue R-250 染 色 30 分 鐘 ， 再 以 退 色 劑 溶 液 ( 875 ml dH20 , 50 ml methanol ,和 75 ml 醋酸 ) 脫色。
2.17 分析膠原蛋白酵素定量法(Quantitative Analysis of
Zymography)
表現出來的 92 kDa (proMMP-9)，72 kDa (proMMP-2) 和 62 kDa (活化 MMP-2) 膠原蛋白脢的 bands，將以 AlphaImager 2000 密度 儀測其相對密度結果，將以 student t-test 做統計分析，P < 0.05 表現顯著差異。
2.18 統計分析
每個檢體的結果皆為三重複實驗之平均值，採用 student t-test 分析軟體；P<0.05 表示顯著性差異，P<0.01 表示極顯著性 差異，P<0.001 表示超顯著性差異。
第 四 章 實 驗 結 果
第一節：黃耆能促進 Rsc 96 細胞的增生能力。
先將史旺神經膠細胞 Rsc 96 轉殖至 24 孔盤培養皿中，經過隔 夜使細胞貼盤，接著更換只含有 1% 胎牛血清的培養液與細胞反應 4 小時；使細胞飢餓；再加入不同濃度(1.25、12.5、125、250 與 500 μg/ml)的黃耆刺激 24 小時後；由圖 4.1 MTT 的實驗結果發現，Rsc 96 的細胞活性隨著黃耆的濃度增加，有明顯上升的趨勢；而於濃度為 12.5μg/ml 時，效用最好 (P<0.01)；而在高濃度(125~500μg/ml) 的黃耆刺激下，細胞活性雖然沒有低濃度(12.5μg/ml)時佳，但與沒 有加藥的控制組相比，其仍然有顯著性差異(P<0.05)。
圖 4.1 黃耆刺激後 MTT 之實驗結果
我們同時也偵測了細胞增生之標定因子，細胞增生抗原 PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)的蛋白質表現量；由西方墨 點法的實驗結果得知，同樣在濃度 1.25~500μg/ml 的黃耆刺激之 下，PCNA 蛋白的表現量有逐漸增加的趨勢，圖 4.2。
圖 4.2 黃耆刺激後 PCNA 之表現量 最後，利用傷口癒合實驗(wound healing assay) 偵測在
1.25~500μg/ml 的濃度之黃耆刺激之下，Rsc 96 史旺神經膠細胞的 增生情形；由圖 4.3 實驗結果則觀察黃耆可明顯促進 Rsc 96 細胞快 速生長。
圖 4.3 傷口癒合實驗 Fold 1 1.04 1.07 1.11 1.55 2.14
將傷口癒合實驗中，每個組別的移動細胞數目進行統計後發現，
黃耆對於促進 Rsc 96 細胞增生的作用，有超顯著性的差異(P<0.001) 圖 4.4。
圖 4.4 傷口癒合實驗結果量畫圖
第二節：黃耆能活化細胞週期蛋白(Cell cycle protein)的 mRNA 以及蛋白質表現量。
將 Rsc 96 史旺細胞培養在 10 公分的培養皿中，當培養至 8 分滿 時，更換只含有 1% 胎牛血清的培養液與細胞反應 4 小時；使細胞飢 餓；再加入不同濃度(1.25、12.5、125、250 and 500μg/ml)的黃耆 刺激 24 小時；接著抽取細胞 mRNA，利用 RT-PCR 觀察細胞週期蛋白，
Cyclin D1、Cyclin E 和 Cyclin A 之 mRNA 表現量。抽取細總胞蛋白 質，利用西方墨點法觀察細胞週期蛋白，Cyclin D1、Cyclin E 和
Cyclin A 的蛋白質表現量。在圖 4.5 之 RT-PCR 實驗結果發現，在濃 度為 1.25~125μg/ml 時，Cyclin D1、Cyclin E 以及 Cyclin A 的 mRNA 表現量明顯上升，但在 250 和 500μg/ml 的黃耆刺激下，mRNA 的表 現量則開始下降。
圖 4.5 RT-PCR 實驗偵測細胞週期調控因子之 mRNA 表現量
而由西方墨點法的實驗結果中則發現，Cyclin D1、Cyclin E 以 及 Cyclin A 的蛋白質表現量有逐漸上升的趨勢，但唯獨 Cyclin E 的 蛋白質 500μg/ml 的黃耆刺激下的表現量則有稍微下降的情形，圖 4.6。
圖 4.6 西方墨點法偵測細胞週期調控因子之蛋白質表現量
第三節：黃耆經由活化 MAPK signaling pathway 促進 Rsc 96 史旺神經膠細胞增生。
我們利用 Western blot 觀察，以 1.25-500 μg/ml 的黃耆刺激 後，MAPK signaling Pathway 中主要的訊息傳遞因子 ERK1/2, JNK1/2, P38 以及其磷酸化態的蛋白表現情形。由實驗結果得知，在濃度在 12.5~500 μg/ml 的黃耆刺激下，可活化磷酸化態的 ERK1/2 和 P38 蛋白，使其大量表現；而在濃度為 125~250 μg/ml 時，則可促使磷 酸化態的 JNK1/2 蛋白表現量上升。同時，在濃度高達 500 μg/ml 的 黃耆刺激後，則因生長活性被抑制了，其使磷酸化態的 JNK1/2 及 P38 蛋白質表現量也因此下降，圖 4.7。
圖 4.7 西方墨點法偵測 MAPK 訊息調控蛋白表現量
接著，為了要進一步的確定黃耆促進 Rsc 96 細胞增生確實是經 由活化 MAPK signaling pathway 而產生的；我們將細胞處理 125μ g/ml 濃度的黃耆刺激後，再分別加入 MEK 的抑制劑 U0126、P38 的抑 制劑 SB203580，以及 JNK 的抑制劑 SP600125，抑制上述三種蛋白的 表現量；最後用 MTT 偵側細胞的活性，並以西方墨點法偵測 PCNA 的 蛋白表現情形。而由圖 4.8 中 MTT 的實驗結果發現，利用 MEK 的抑制 劑 U0126，抑制 MEK 蛋白表現後，原本被黃耆刺激的細胞活性明顯降 低(P<0.001) ；同樣的，加入 P38 的抑制劑 SB203580 後，細胞活性 也有被抑制的情形(P<0.05)。
圖 4.8 加入 MAPK 抑制劑後 MTT 之實驗結果
以西方墨點法觀察到 PCNA 的蛋白表現量亦明顯下降，證明了黃耆確 實是經由活化 MAPK signaling pathway 中的 P38 和 ERK 路徑來促進 Rsc 96 神經細胞增生，圖 4.9。
圖 4.9 加入 MAPK 抑制劑後 PCNA 之表現量
Fold 1 1.63 1.41 1.40 1.64
第四節：黃耆經由活化抗結痂(Scar)FGF-2-UPA-MMPs 途徑因 子促進 RSC 96 史旺神經膠細胞的移動作用 。
將 Rsc 96 史旺細胞培養在六孔盤的培養皿中，當培養至 8 分滿 時，更換只含有 1% 胎牛血清的培養液與細胞反應 4 小時；使細胞飢 餓；再加入不同濃度(1.25、12.5、125、250 and 500μg/ml)的黃耆 刺激 24 小時後；首先，蒐集細胞之培養液，利用 Zymography 實驗偵 測基質金屬蛋白酶-9 & -2(MMP -9 & -2) 之活性。將細胞取下後，
利用 Boyden chamber system 偵測 Rsc 96 史旺神經膠細胞的移動作 用；接著抽取細胞 mRNA，利用 RT-PCR 觀察 FGF-2-UPA-MMPs 途徑因 子，FGF-2、UPA 和 PAI-1 之 mRNA 表現量。抽取細總胞蛋白質，利用 西方墨點法觀察 FGF-2-UPA-MMPs 途徑因子，FGF-2、UPA 和 PAI-1 的 蛋白質表現量。由細胞移動實驗(Boyden chamber system)結果發現，
加入黃耆的刺激後，Rsc 96 史旺神經膠細胞的移動作用有明顯增加，
其中又以 1.25μg/ml 的效果最佳，圖 4.10。
圖 4.10 加入黃耆刺激後 RSC 96 細胞的移動情形 將實驗中每個組別的移動細胞數目進行統計後可知，黃耆對於促 進 Rsc 96 細胞的移動作用，有超顯著性的差異 P<0.001，圖 4.11。
圖 4.11 移動細胞數目之量化圖
在 RT-PCR 實驗結果發現隨著黃耆的濃度增加， FGF-2 和 UPA 的 mRNA 表現量明顯上升；而 UPA 的抑制劑 PAI-1，其 mRNA 表現量則在 125-500 μg/ml 的黃耆刺激後，有逐漸下降的趨勢，圖 4.12。
圖 4.12 RT-PCR 實驗偵測 FGF-2-UPA 調控因子之 mRNA 表現量 由西方墨點法觀察出的蛋白質表現量，也有相同的趨勢，圖 4.13。
圖 4.13 西方墨點法偵測 FGF-2-UPA 調控因子之蛋白質表現量 最後，在 Zymography 實驗，我們更偵測到 MMP 9 的酵素活性，
隨著黃耆的藥物濃度增加，有逐漸上升的趨勢；至於在此作為實驗操
作之控制組的 MMP 2，酵素活性則沒有任何變化，圖 4.14。
圖 4.14 Zymography 實驗結果
第 五 章 討 論
在早期的年代，中藥醫學一直被視為沒有科學根據的傳統療法；
在早期的年代，中藥醫學一直被視為沒有科學根據的傳統療法；