中藥黃耆刺激周邊神經膠細胞Rsc 96增生之分子機轉; Mechanisms of the proliferate effects of Huangqi on Rsc 96 peripheral Schwann cells
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(2) 中 文 摘. 要. 中藥黃耆刺激周邊神經細胞 Rsc 96 增生之分子機轉 研究生:柯富揚 指導教授：黃志揚 教授 協同指導教授：林昭庚 教授 陳悅生 教授 中國醫藥大學 中國醫學研究所. 黃耆為坊間經常使用之中藥材，其傳統的療效為增強心臟收縮 力、擴張血管以及抗病毒等功能。而近年來則有文獻指出，黃耆具有 促進軸突成熟、保固神經以及刺激血管內皮細胞生長之作用；因此， 我們可以合理的猜測黃耆似乎具有促進神經細胞再生的作用。本實驗 採用 Rsc 96 史旺細胞株，加入不同濃度之黃耆(1.25μg/ml，12.5 μg/ml，125μg/ml，250μg/ml，500μg/ml)；由 MTT 及傷口癒合實 驗得知，黃耆具有促進史旺細胞增生的能力，細胞增生抗原 PCNA 的 蛋白表現量亦隨著加藥濃度增加而上升。在分子傳遞路徑方面，以 RT-PCR 及 western blot 偵測 cell cycle 以及 FGF-2-UPA 訊息因子 的表現量；結果發現，這兩條路徑之調控因子之 mRNA 及蛋白質表現 量皆被明顯活化；而 UPA 的抑制蛋白 PAI-1 的表現量則被抑制。以 zymography 和 migration assay 實驗結果得知，黃耆會經由活化 MMP 9 刺激 Rsc 96 史旺細胞的轉移能力。除此之外，我們更以 MEK、JUK 以及 P38 之化學抑制劑證明出，黃耆同時亦會經由活化 ERK 和 P38 蛋 白，刺激史旺細胞增生。統整以上之實驗結果，可知黃耆會經由活化 I.
(3) FGF-2 pathway，刺激史旺細胞的轉移能力；並同時活化了 MAPK 及 Cell cycle signaling，進而刺激史旺細胞之細胞增生的能力；因此 促進了神經細胞的再生作用。. II.
(4) Abstract Mechanisms of the proliferate effects of Huangqi on Rsc 96 peripheral Schwann cells Student: Fu-Yang Ke Adviser：Chih-Yang Huang Ph D Co-advisor：Jaung-Geng Lin Ph D Yueh-Sheng Chen Ph D Institute of Chinese Medical Science of China Medical University. The aim of the present study was to evaluate the proliferative effects of huangqi on neuron regeneration. RSC96, Schwann cells. We investigate the molecular mechanisms, which include :(1) proliferative signaling, HGF-cMET-Cell cycle factors and EGFR-MEK-ERK pathways, and survival signaling. (2) anti-scar signaling, FGF-2-UPAMMPs. After treat with different concentrations (1.25μg/ml，12.5μ g/ml，125μg/ml，250μg/ml，500μg/ml) of Huangqi, we confirmed it can increase Rsc 96 cell proliferation in the best concentration of 12.5μ g/ml(P<0.01) by MTT and wound healing test. In addition , examined by RT-PCR and western blotting assay , Huangqi enable to stimulate FGF-2-UPA-MMPs. pathway regulator and cell cycle controlling. protein mRNA and protein expression，and then excite MAPK signaling pathway to promote the proliferation. Using chemical inhibitors, U0126, SB203580, and SP600125, the proliferative effects of huangqi on RSC cells were identified to be ERK signaling-dependent. On the basis of the results, applying appropriate dose of huangqi with biomedical materials would be a potential approach for enhancing neuron regeneration.. III.
(5) 目. 錄. 中文摘要-------------------------------------------------Ι 英文摘要-------------------------------------------------Ⅲ 第一章. 前言----------------------------------------------1. 第二章. 文獻探討------------------------------------------2. 第一節. 神經系統---------------------------------------2. 第二節. 周邊神經損傷與神經再生-------------------------3. 第三節. 史旺神經細胞與神經再生-------------------------5. 第四節. 黃耆-------------------------------------------7. 第五節. 神經再生的訊息傳遞路徑-------------------------9. 第三章 材料與方法---------------------------------------14 第一節 實驗材料---------------------------------------14 1.1 細胞培養-----------------------------------------14 1.2 MTT----------------------------------------------15 1.3 細胞 mRNA 萃取------------------------------------15 1.4 RT-PCR-------------------------------------------15 1.5 DNA 電泳------------------------------------------16 1.6 蛋白質定量---------------------------------------16 1.7 西方墨點(Western blotting)-----------------------16. IV.
(6) 1.8 細胞移動實驗(Migration assay)--------------------18 1.9 蛋白分解酵素膠電泳法(Gelatin Zymography)--------19 第二節 實驗方法---------------------------------------20 2.1 細胞培養----------------------------------------20 2.2 冷凍保存細胞------------------------------------20 2.3 黃耆之萃取--------------------------------------21 2.4 藥劑處理時間點----------------------------------21 2.5 MTT (細胞存活測定)-----------------------------22 2.6 傷口癒合實驗(Wound healing assay)--------------22 2.7 細胞 mRNA 萃取----------------------------------23 2.8 反轉錄作用(RT)---------------------------------23 2.9 引子合成 (Primer Synthesis)--------------------24 2.10 聚合酵素連鎖反應(PCR)------------------------25 2.11 DNA 電泳-------------------------------------25 2.12 細胞總蛋白萃取------------------------------26 2.13 蛋白質定量----------------------------------26 2.14 西方墨點(Western blotting)------------------27 2.15 細胞移動實驗(Migration assay)---------------28 2.16 蛋白分解酵素膠電泳法(Zymography)------------29. V.
(7) 2.17 分析膠原蛋白酵素定量法----------------------29 2.18 統計分析----------------------------------------30 第四章 實驗結果-----------------------------------------31 第一節：黃耆能促進 Rsc 96 細胞的增生能力---------------31 第二節：黃耆能活化細胞週期蛋白(Cell cycle protein)的 mRNA 以及蛋白質表現量-------------------------------------33 第三節：黃耆經由活化 MAPK signaling pathway 促進 Rsc 96 史 旺神經膠細胞增生--------------------------------------35 第四節：黃耆經由活化抗結痂(scar)FGF-2-UPA-MMPs 途徑因子促 進 RSC 96 史旺神經膠細胞的移動作用---------------------38 第五章 討論---------------------------------------------42 第六章 結論---------------------------------------------47 參考文獻------------------------------------------------49. VI.
(8) 圖 目 錄 圖 2.1 細胞週期(Cell cycle)-----------------------------10 圖 2.2 MAPK 訊息路徑------------------------------------12 圖 4.1 黃耆刺激後 MTT 之實驗結果-------------------------31 圖 4.2 黃耆刺激後 PCNA 之表現量--------------------------32 圖 4.3 傷口癒合實驗-------------------------------------32 圖 4.4 傷口癒合實驗結果量畫圖---------------------------33 圖 4.5. RT-PCR 實驗偵測細胞週期調控因子之 mRNA 表現量----34. 圖 4.6. 西方墨點法偵測細胞週期調控因子之蛋白質表現量----35. 圖 4.7. 西方墨點法偵測 MAPK 訊息調控蛋白表現量-----------36. 圖 4.8. 加入 MAPK 抑制劑後 MTT 之實驗結果-----------------37. 圖 4.9. 加入 MAPK 抑制劑後 PCNA 之表現量------------------37. 圖 4.10. 加入黃耆刺激後 RSC 96 細胞的移動情形------------39. 圖 4.11. 移動細胞數目之量化圖---------------------------39. 圖 4.12. RT-PCR 實驗偵測 FGF-2-UPA 調控因子之 mRNA 表現量-40. 圖 4.13. 西方墨點法偵測 FGF-2-UPA 調控因子之蛋白質表現量-40. 圖 4.14. Zymography 實驗結果----------------------------41. 圖 6.1. 總結黃耆在 RSC96 史旺細胞株中，活化其增生及移動之分. VII.
(9) 子機制--------------------------------------------------48. 表 目 錄 表 3.1 抗體詳細資料-----------------------------------18~19. VIII.
(10) 第 一 章 前. 言. 神經再生的過程是相當複雜且漫長的。當週邊神經細胞發生損傷 後，依個人年齡的不同，其神經生長速度約為每個月1到3公分不等。 若神經發生損傷，卻沒有經過適當的處理，則很容易產生神經瘤，近 而使得受損神經無法重整恢復；因此，多年來不斷有學者積極研究， 如何提升週邊神經受損時的修補機制。中藥黃耆為藥膳中最常用的中 藥之一，其主要生長於中國北方；在一般傳統療法中，常用於補益脾 胃、強心、擴張血管、提高免疫功能等虛弱性所引起的疾病。近期有 文獻指出，黃耆不但可以提昇癌症病患的免疫功能；其更有促進神經 軸突的成熟，以及刺激血管上皮細胞生長的效用。因此，我們可以合 理的推測，中藥黃耆對於神經細胞的生長機制，應該能有一定程度的 刺激作用。為證明這個論點，在本篇論文中，我們使用了Rsc 96史旺 神經膠細胞株，加入不同濃度的黃耆刺激(1.25、12.5、125、250 與 500μg/ml)。同時偵測史旺神經膠細胞的增生作用以及移動情形，用 來驗證黃耆對神經再生的刺激教果；並進一步的偵測與神經再生相關 的訊息傳遞路徑，藉此探討出黃耆刺激神經再生的分子機制。. 1.
(11) 第 二 章 文 獻 探. 討. 第一節:神經系統 人類的神經系統可以分為中樞神經系統 (Central Nervous System, CNS) 和周邊神經系統(Peripheral Nervous System, PNS) 兩大類。藉由複雜的神經纖維連結這兩個神經系統,我們才能夠因應 外界的環境變化而產生適當的身體反應,並且有思考、記憶、情緒變 化的能力。. 而中樞神經系統包含了大腦以及脊髓，在胚胎時期是由神經管 (Neural tube)分化形成[1]；由其構造與組成上可分為灰質(Gray matter)與白質(White matter)。灰質負責心智運算與儲存記憶，由 神經細胞本體緊密組裝而成；主要由神經元(Soma)、神經膠細胞 (Neuroglia)及血管所構成；其在新鮮未染色狀態時呈灰色，故稱灰 質。大腦白質則由神經細胞的軸突組成；一般認為大腦白質只是被動 的基礎構造，但最近的研究指出，白質與學習或精神疾病有密切關係 [2]。大腦白質中大部份包有髓鞘；並含有神經纖維，神經膠細胞及 血管[3]。而白質組織因含高量之磷脂質，在新鮮未染色狀態時呈白 色，故稱白質。 2.
(12) 周邊神經系統也可以分為兩個主要的部份：軀體神經系統 (Somatic nervous system) 以及自主神經系統 (Antonomic nervous system)。軀體神經系統中的感覺神經纖維 (Sensory nerve fibers) 可將身體各部份的感覺器官所搜集到的視覺、嗅覺、味覺、觸覺等資 訊傳送到大腦或脊髓。而運動神經纖維 (Motor nerve fibers) 則負 責將中樞神經系統所下達的命令傳到骨骼肌以產生所需的運動。自主 神經系統包含了交感神經系統 (Sympathetic nervous system) 以及 副交感神經系統 (Parasympathetic nervous system) 。其功能主要 在於調控內臟的平滑肌運動以及內分泌腺體產生內分泌激素。. 第二節:周邊神經損傷與神經再生 周邊神經損傷依嚴重程度可分為 5 級； 第一級:僅神經傳導功能 喪失，損傷當時雖可有神經功能的完全喪失，但在傷後數天或數週可 完全恢復；第二級:軸突斷裂但神經髓鞘無斷裂；第三級:軸突和神經 鞘均斷裂；第四級:神經束斷裂以及第五級:神經橫斷傷。若神經整個 被截斷，則軸突的再生需要經由神經外膜的縫合，將被切斷端接合起 來。但若神經損傷屬於壓碎性傷害，軸突雖然會斷裂，但神經束以及 神經髓鞘中的結締組織保留完整；因此，此種傷害並不需要手術加以 3.
(13) 復原[4, 5]。而以下敘述的神經再生程序乃應用於完全切除乾淨且重 新修復神經中。. 神經再生過程可分為三個階段：軸突芽生；再生軸突的生長、延 伸以及恢復神經支配原靶器官 [6]。當神經被切斷時，許多的變質性 變化（Degenerative changes）會發生，而干擾神經的傳導路徑。在 受傷的前 3~5 天內，軸突（Axon）末梢到切斷部分會開始變質，並且 分裂成許多不規則的片段；巨噬細胞和纖維母細胞會充斥於被切斷的 神經端之間的空間中，並將變質的軸突片段清除。而連接細胞體的軸 突部分，受傷之初亦會產生些微的變質，然後便會開始再生，產生球 狀的肥大，並生成許多軸突芽（Sprout）。在軸突芽生成的同時，史 旺細胞則開始大量的增生，並移動到受損的部位；最後便形成替代軸 突的細胞索套。大約在神經截斷後 2 週，這些軸突芽會被切斷部位生 成的結痂所包裹，隨後連結上史旺神經膠細胞形成的細胞索套[7]。 當連接完成之後，只有一個軸突芽可生成新的軸突，其餘的將會變質 分解。隨後，史旺神經膠細胞便會生成新的髓鞘質，圍繞在新的軸突 上，最後，整條神經再生完成[8]。. 4.
(14) 第三節:史旺神經細胞與神經再生 一個完整的神經細胞包含了細胞本體(Cell body)、樹突 (Dendrite)和軸突(Axon)；樹突負責將資訊帶回細胞; 而軸突則是負 責將訊息傳遞出去。而軸突的外部會有一層史旺神經膠細胞(Schwann cell)包覆，其可以隔離每個神經細胞間的電子傳遞作用，避免各種 不同的神經傳導路徑相互干擾。. 約在 20 年前，柏恩奇[9]提出了一個假說，質疑是否可將史旺神 經膠細胞從自體神經組織中分離培養，並將培養後的史旺細胞植入於 受損的神經組織中，以促進神經的再生。如今，史旺細胞對於受損神 經中，軸突再生的促進作用，早已被肯定；而其在週邊神經結構組成 中的特殊地位和作用，一直是研究的重點。史旺神經膠細胞促進神經 再生的作用機制，可統整出以下兩點:. 1. 史旺神經膠細胞可促進軸突再生－周邊神經受損時，史旺細胞會 移動到受損的部位[10]；此時，史旺神經膠細胞會不斷分裂增殖， 並對再生軸突起引導作用，誘導其生遷移之方向。其同時能分泌神 經生長因子（Nerve growth factor，NGF）、神經元營養因子 （Neurotrophic factors，NTFs）、促神經軸突生長因子（Neurite promoting factor，NPFs)、基膜索（Laminin）和纖維連結素等 5.
(15) 20 多種多肽類活性物質，誘導刺激和調控軸突的再生和髓鞘的形 成[11]。. 2 史旺神經膠細胞促進再生軸突的髓鞘化. 在神經受損後，神經纖維變性的同時，包圍在軸突外之史旺神經 膠細胞受損傷之刺激，會重新進行細胞分裂，並大量的增生；一旦變 性的軸突及髓鞘被清除後，就形成了史旺神經膠細胞包圍而成之套 管。損傷不嚴重的神經元不久會在切斷的軸突處產生許多小芽體，這 些芽體漸漸生長，如其中一個芽體尋得且進入史旺神經膠細胞所形成 之套管內，則繼續生長，最後到達其原來終止的區域或構造上，其他 未進入史旺神經膠細胞套管之芽會消失；重新在新長出的軸突其上方 之史旺神經膠細胞則會形成新的髓鞘[12-14]。另一方面，schwann cell 表達的細胞粘附分子（如 Neural cell adhesion molecule，NCAM 和 NCAM-L1） 、髓磷脂相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein， MAG)和 P0 核糖蛋白均參與週圍神經系統的髓磷脂形成，其中 P0 核糖 蛋白起核心作用，NCAM、NCAM-L1L1 和 MAG 則主要起穩定髓鞘的作用 [15]。. 近年來，有研究者便將截斷神經的兩斷端，縫入已事先填入史旺 神經膠細胞之生醫材料製成的神經管中，並藉由史旺氏細胞的刺激來 6.
(16) 促進神經的再生[16]。另外，有研究指出史旺細胞對於類似轉植的臨 床應用來說是需要的；所需的史旺神經膠細胞也可從新生老鼠的周邊 神經大量取得[17]。. 第四節:黃耆 中藥黃耆為豆科植物蒙古黃耆 ( Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. Var. mongholicus (Bge.) Hsiao)或膜莢黃耆 ( Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.)的乾燥根；其化學成分 含多糖、單糖、黃酮類、生物鹼（膽鹼、甜菜鹼）、多種氨基酸、葡 萄糖醛酸及微量葉酸等，及硒、硅等多種微量金屬元素[18, 19]。主 要產於甘肅、陜西、蒙古、河北、山西等地 [19, 20]。 黃耆為常用中藥，始載於《神農本草經》。甘，微溫。歸肺、脾 經。生黃耆具有能補氣升陽、興奮呼吸、利水消腫、脫毒排膿、改善 貧血的功能。常用於慢性衰弱症，中氣虛弱，體倦乏力，中氣下陷之 脫肛，子宮脫垂，內臟下垂，周圍神經麻痺，慢性風濕關節炎，肩關 節周圍炎，急性慢性腎炎，肢體浮腫，蛋白尿，糖尿病(消渴)等病症 [20, 21]。而除了其傳統療法之外，如今已經有許多的學者研究出， 黃耆對於現代臨床醫學的應用以及治療功效；在此將較為廣泛探討的. 7.
(17) 療效統整如下: 1.具抗氧化能力: 已有實驗證明黃耆皂素(Astragalosides)可增加心肌細胞自由基 的移除以及減緩脂質過氧化作用[22]。在動物實驗中發現，黃耆皂Ⅳ （Astragaloside Ⅳ）可提升心臟中超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase,SOD) 的表現量，對於心臟缺氧(Myocardial ischemia) 具有保護作用[23]。黃耆皂苷(Astragalus saponin)因具有多酚結 構，所以有抗氧化的效果，可以保護腦部神經細胞，免受腦部缺血時， 其中組織所釋放出的自由基造成傷害[24]。 2.增強免疫功能: 水煎黃耆可明顯促進自然殺手細胞（Natural Killer Cells）活 性，其單一成份黃耆多醣體可以提昇人體中的免疫球蛋白的免疫能 力，並活化B細胞和巨噬細胞[25, 26]；對細胞免疫和體液免疫均有 增強作用。另外，黃耆更可以提升癌症病患其原本被抑制之T細胞以 及巨噬細胞的作用能力[9, 26]。 3.降血糖: 黃耆皂 I（Astragaloside I）可降低糖尿病早期之大白鼠血中葡 萄糖濃度[27]。由STZ(Streptozotocin)所誘導之第二型糖尿病鼠， 長期服用黃耆後，可以降肌肉對胰島素接受的敏感性，進而間接降低. 8.
(18) 糖尿病的血糖[28]。 4.其它: 其餘一些較不廣泛使用之黃耆療效簡述如下: (1). 促進大白鼠的腦下垂體分泌生長激素[29]。. (2). 在大白鼠的實驗中，可以抑制特異性過敏皮膚炎[30]。. (3). 可降低不孕症發生的機率，提升精蟲活動的能力[31]。. (4). 可以有效降低長期菸癮患者，在戒斷時所造成的煙癮戒斷中 不適的症狀[32]。. (5). 黃耆同時能作為替代雌激素的植物荷爾蒙[33]。. 近期則有文獻指出，黃耆有促進神經軸突的成熟，以及活化血管 上皮細胞生長週期(Cell cycle)的效用[34]。因此，我們可以合理的 推測，中藥黃耆對於神經細胞的生長機制，必定有相當程度的刺激作 用。. 第五節:神經再生的訊息傳遞路徑 因神經再生作用其中兩項重要機制為史旺細胞的增生作用以及其 移動功能；因此，在本篇論文中，針對增生作用我們偵測了細胞週期 (Cell cycle)以及有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)兩個與細胞生長極為相關的訊息路徑。再者，. 9.
(19) 從已經確定的動物模式中，在老鼠的坐骨神經之近端及遠端中間插入 導管讓史旺細胞充填在其中之後，發現類纖維生長因子-2 (Fibroblast growth factor-2 ，FGF-2)大量表現[17]；由此我們針 對史旺細胞的移動功能則偵測了FGF-2-MMPs 訊息路徑；希望能藉此 找出黃耆對於神經細胞再生的分子調控機制。而以上所敘述之訊息傳 導作用則詳述於下: 1. 細胞週期(Cell cycle) 細胞分裂週期分為幾個階段，依照其發生順序可分為 G1:DNA 合 成前期、S：DNA 合成時期、G2：有絲分裂(Mitosis)前期以及 M: 有 絲分裂時期。細胞在 G1 時期會開始準備 DNA 複製的材料，接著進入 DNA 複製的 S 期；當 DNA 複製完全後，會進入 G2 時期準備細胞分裂 的材料；最後進入有絲分裂時期，完成整個細胞週期[35]。. 圖2.1 細胞週期(Cell cycle). 10.
(20) 細胞週期的進行是由不同的週期素(Cyclin)所調控。週期素意味著這 些蛋白質的表現量會隨著細胞週期的進行而有所變化，在G1期首先會 大量表現週期素D (Cyclin D)，漸漸則由週期素E (Cyclin E)取代， 而之後的變化則是E->A->B [36]。 在細胞進行複製週期時，Cyclin D1會在早期G1時期會大量表現， 與依賴週期素激脢 (Cyclin-dependent kinase 4/6；CDK4/6)形成複 合體後，進而磷酸化視網膜細胞瘤(Retinoblastoma；Rb) 蛋白，促 使轉錄因子E2F從Rb上游離出來開啓基因的轉錄作用(Transcripttion)；刺激細胞週期由G1時期進入S時期[37]。Cyclin E 則會在G1 末期開始表現，並大量生成於S時期；它的功能主要是協助調控細胞 由G1時期進入S時期以及啟動DNA的複製作用[38]。其調控方式與 Cyclin D1雷同；Cyclin E 亦會與Cyclin-dependent kinase (CDK) 之一的CDK2結合後，磷酸化視網膜細胞瘤(Retinoblastoma；Rb) 蛋 白，開啓基因的轉錄作用(Transcription) [39]。而Cyclin A同時調 控了S進入G2以及有絲分裂(Mitosis)時期，當Cyclin A會與CDK2結 合，並受到Cyclin B的調節；Cyclin A與Cyclin B會共同調控細胞的 有絲分裂[40]。 2. 有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase， MAPK)訊息傳遞路徑. 11.
(21) 當細胞受到生長因子(Growth factor)或細胞激素(cytokine)刺激 後，MAPKKK (MAP kinase kinase kinase)，如C-RAF、ASK-1、MEKK1&4， 會最先被活化；進而磷酸化MAPKK (MAP kinase kinase) ，如MEK1/2、 MKK3/6、MKK4/7；接著再進一步活化磷酸化MAPK(mitogen-activated protein kinase)，如ERK1/2、P38、JNK1/2。最後，細胞會透過MAPK 的被活化，刺激細胞增生(proliferation)、分化(differentiation)、 發炎反應(inflammation)以及凋亡作用(apoptosis) [41]。. 圖2.2 MAPK 訊息路徑 3. FGF-2-MMPs 訊息路徑 FGF-2 為纖維母細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor)，經 由腦下垂體分泌出，分子量為 18kDa。FGF-2 在 in vivo 及 in vitro 中為有效的血管增生因子，並且刺激平滑肌細胞的生長，負傷治癒， 12.
(22) 及組織修補。除此之外，更已經有文獻指出，在受損的神經組織中， FGF-2 會大量表現，並促進神經修復的功能[42]。同時，在傷口瘀合 的過程中 UPA(Urokinase plasminogen activater)會活化基質金屬 蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)調控細胞外基質 (Extracellular matrix，ECM)的重建及參與傷口的復原及細胞的再 生(43)。除此之外，UPA 若同時活化了 MMPs，以及促進胞漿素原 (Plasminogen)轉換成胞漿素(Plasmin)時，這兩種細胞外基質的分解 蛋白會不斷進行降解作用，促使細胞的轉移功能增加[44]。而 FGF-2 的活化亦能促進 UPA 基因表現量增加，UPA 之專一性抑制蛋白 PAI-1 則會抑制 UPA 的蛋白活性[45]。. 13.
(23) 第 三 章 材 料 與 方 法 第一節 實驗材料 1.1 細胞培養 DMEM (Gibco，12100-046；USA) DMEM；No phenol red (Sigma,D2902；USA) PBS (Gibco,21600-010；USA) CCS (Cosmic Calf Serum；HyClone,DMK0096；USA) Sodium bicarbonate (Sigma,S-5761；NaHCO3 ；USA) Non-essential amino acid (HyClone,SH30238.01；USA) Antibiotic-Antimycotic (Gibco，15240-062；USA) Trypsin-EDTA(Gibco，25200-056；USA) DMSO (Sigma,D2650；USA). 處理用藥 U0126=MEK inhibitor (Promega,V1121；USA) SB203580=p38 inhibitor (Promega,V1161；USA) SP600125=JNK inhibitor (BIOMOL, EI-305；USA). 14.
(24) 1.2 MTT Thiazolyl blue tetrazilium bromide (MTT)(Sigma,M5655；USA). 1.3 細胞 mRNA 萃取 UltraSpecTM RNA reagent (Biotecx,BL-10500；USA) Chloroform (Merck,1.02445.1000；Germany) 2-Propanol (Sigma,I-9516；USA) Ethanol (Merk,1.00983.2500；Germany) Diethyl pyrocabonate (DEPC；Sigma,D-5758；USA). 1.4 RT-PCR M-MLV Reverse Transcriptase (Promega,M-170A；USA) M-MLV Reverse 5 × Buffer (Promega,M-531A；USA) Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Promega,N-251B； USA) Deoxynucleotide Triphosphate (dNTPs) (Promega,U-1240；USA) Oligo–dT (明欣生物技術有限公司；台灣) Taq (DNA polymerase；Finnzymes,F501L；Finland) 10 × PCR Buffer (Finnzymes,F511L；Finland). 15.
(25) 1.5 DNA 電泳 Agarose (Amresco,0710；USA) 100 bp ET marker (Progema,G-2101；USA) Ethidium bromide (EtBr；Progema,H-5041；USA) 5 × TBE solution (Amresco,J885；USA). 1.6 蛋白質定量 Lowry Protein assay Na-K tartrate (Potassium Sodium Tartrate；(Sigma,P-0165；USA) CuSO4．5H2O（Copper[II] Sulfate Pentahydrate；和光,030-04425） Na2CO3 （Sodium Carbonate；和光,199-01585；台灣） NaOH （Sigma,S-5881） Folin – Ciocalteu phenol reagent（合光,279-08895；台灣）. 1.7 西方墨點(Western blotting) A. Cell lysis buffer Tris-base（USB,T8600；USA） NaCl (Sigma,S-7653；USA). 16.
(26) EDTA (Sigma,E-5134；USA) β-mercaptoethanol（Pharmacia Bioetch,17-1317-01；Sweden） NP 40（Sigma,I-3021；USA） Glycerol（Angus,07-52305；USA） Protease inhibitor cocktail tablet(Roche,D68298；Switzerland） B. Western blot buffer 40% Acrylamide / Bis Solution 29:1（MDBio,Inc.903039；USA） Solution B Tris-base(PH 8.8) (USB,T8600；USA） Sodium dodecyl sulfate（SDS；Sigma,S-5761；USA） Solution C Tris-base(PH 6.8) (USB,T8600；USA） Sodium dodecyl sulfate（SDS；Sigma,S-5761；USA） Ammonium persulfate（APS；Amresco,0486-25G；USA） TEMED（platinum Plus【CPG】,P-E90051） Glycine（USB,G-8165；USA） Glycerol（Angus,07-52305；USA） Methanol（台灣聯工,940103） Tween 20（Pharmacia Biotech,17-1316-01；USA）. 17.
(27) Sodium chloride（NaCl；Sigma,S-7653；USA） Ponceau S solution（Sigma,P-7170；USA） Blocking buffer（安佳脫脂奶粉；Anchor New Zealand Milk） Enhanced chemiluminescence(ECL) reagent（Santa Cruz Biotechnology,C2604；USA） C.5x loading dye Bromophenol Blue（Sigma, B-525；USA） β-mercaptoethanol（Pharmacia Bioetch,17-1317-01；Sweden） Sodium dodeccl sulfate（SDS；Sigma,S-5761；USA） Glycerol（Angus,07-52305；USA） Tris-HCl（USB,T-8650；USA） D.抗體 1.st Ab. M.W.(KDa). 2.st Ab. 廠牌. 貨號. PCNA. 34~43. rabbit. SANTA CRUZ. SC-7907. FGF-2. 19. rabbit. Upstate. SC-79. UPA. 29~36. rabbit. SANTA CRUZ. SC-14019. PAI-1. 50. rabbit. SANTA CRUZ. SC-8979. Cyclin D1. 36. mouse. SANTA CRUZ. SC-246. Cyclin E. 53. mouse. SANTA CRUZ. SC-25303. Cyclin A. 60. rabbit. SANTA CRUZ. SC-751. 18.
(28) P38. 38. mouse. SANTA CRUZ. SC-535. P-P38. 38. mouse. SANTA CRUZ. SC-7973. ERK. 44. rabbit. SANTA CRUZ. SC-94. P-ERK. 44. mouse. SANTA CRUZ. SC-7383. JNK1/2. 49/54. mouse. SANTA CRUZ. SC-571. P-JNK. 49/54. mouse. SANTA CRUZ. SC-6254. α-tubulin. 57. mouse. SANTA CRUZ. SC-5286. 表 3.1 抗體詳細資料. 1.8 細胞移動實驗(Migration assay) Boyden chamber Polyvinyl-pyrrolidone-free polycarbonate membranes with 8μm pore(Neuro Probes,Inc.249447；USA） Giemsa stain（Sigma, GS-500；USA）. 1.9 蛋白分解酵素膠電泳法 (Gelatin Zymography Protease Assay) Geletin （Sigma, G-9382；USA） Triton X-100 (TEDIA,612026) Tris-HCl (USB,22676；USA） CaCl2 (SHOWA,0305-2250；Japan) 19.
(29) NaN3 (Merck, 1.06688.0100 ；USA）. Coomassie blue R-250 (BIOLOGICAL, C.I.42660,USA). 第二節 : 實 驗 方 法 2.1 細胞培養 以含有 10％ 胎牛血清、1.5 g/l Sodium bicarbonate、0.1 mM Nonesseneial amino acid、0.1 mΜ Sodium pyruvate 及 1％ 抗生 素之 DMEM 培養液培養 RSC96 史旺神經膠細胞株。將 RSC96 培養於 37 ℃，5% 二氧化碳的環境之下；每隔兩天更換一次培養液，並於細胞 生長至八分滿時，先以 PBS 清洗細胞兩次，再用 1％ Trypsin 將細 胞從培養皿上游離下來，取約 1/5~1/10 之細胞量至新的培養皿做繼 代培養。. 2.2 冷凍保存細胞 以 10 公分培養皿培養細胞至八~九分滿，並在準備凍細胞的前一 天先換上新鮮的培養液。先用 PBS 清洗細胞兩次，並以 1％ Trypsin 將細胞從培養皿上游離下來，裝入 15 ml 離心管中；離心 800rpm、5 分鐘後吸掉上清液，再用 10％的 DMSO-DMEM 稀釋液回溶細胞並均勻 打散；最後各取 1ml 含有細胞的稀釋液至冷凍管中，置入-80℃冰箱. 20.
(30) overnight，隔天放入液態氮桶中保存。若要解凍細胞，則將細 胞快速的從液態氮桶中取到 37℃水浴槽中回溫溶解；培養於 10 公分 培養皿，並在隔天更換新的培養液即可。. 2.3 黃耆之萃取 本實驗所使用的中草藥黃耆皆冷凍乾燥完成之粉狀藥物，平常 保存在-80℃冰箱；要拿去作細胞加藥處裡前是先秤取所需的量再 到無菌操作台中，用滅菌過的二次水來稀釋成1.25 μg/ml，12.5 μg/ml，125μg/ml，250μg/ml，500μg/ml的濃度裝在1.5ml的 Eppendrof中;並以0.8μm 之 filter 過濾。為避免污染，稀釋好 的中草藥用Parafilm膜將Eppendrof的蓋子封好，可以放置-20℃ 冰箱保存。. 2.4 藥劑處理時間點. 21.
(31) 2.5 MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenylterazolium bromide,細胞存活測定) 將 Rsc96 神經膠細胞株培養在 24 孔盤中，加藥前先將細胞以沒 有酚紅及胎牛血清(FBS)的培養基培養 4 小時，使細胞飢餓；再分別 加入不同濃度的黃耆反應 24 小時。接著去掉培養基，用 PBS 清洗細 胞 2 次，加 1 ml 0.5mg/ml MTT(1x)；培養在 37℃，5％CO2 ，4hrs。 去掉 DMEM(不要吸到紫色物質)，加 Isopropanol 1 ml 搖 10 分鐘後， 取出放入 eppendorf 中，離心 1000rpm，4℃，5 分鐘；取 200λ到 96well 測 570nm 的吸光值。. 2.6 傷口癒合實驗(Wound healing assay) 首先將細胞培養至 8 分滿。隔天，以黃色 tip 的尖頭從培養皿正 中央劃一條直線，然後以 PBS 清洗 3 次把漂浮的細胞清洗乾淨；隨 後換上不含酚紅的培養液(內含 1% Charcoal 處理過之 FBS) ，並將 細胞依實驗需要做不同試劑處理。於 37℃，5% 二氧化碳的環境之下 培養細胞 48 小時後以 PBS 清洗 3 次，最後再利用正相位差顯微鏡觀 查及照相。. 2.7 細胞 mRNA 萃取 22.
(32) 將加藥處理後的細胞，除去培養液，以 PBS buffer 洗滌 2 次， 加入 1ml UltraSpec (BIOTECX)，接著將細胞由培養皿刮下來，置 於 1.5ml 之離心管(Eppendrof tube)，並於冰上(4℃)靜置 5 分鐘， 而後加入 200μl 氯仿(Chloroform)並劇烈搖晃混合均勻後，於冰上 靜置 5 分鐘，接著以 12000 rpm，4℃條件離心 15 分鐘。離心後將 上層液移至另一新的離心管，加入等體積之 Phenol-chloroform 混 合液混合均勻，再以 12000 rpm，4℃條件離心 10 分鐘。接著將上 層液移至新離心管，加入等體積之 Isopropanol，混合均勻後於冰 上靜置 10 分鐘，以 12000 rpm，4℃條件離心 10 分鐘，接著將 Isopropanol 移 除 ， 所 得 之 白 色 沈 澱 物 (Pellet) 再 以 75% 酒 精 (Ethanol)清洗兩次，每次皆以 12000 rpm，4℃條件離心 5 分鐘。 最後使移除酒精之沈澱物自然乾燥(約 20~30 分鐘)後，加入 50μl 之滅菌 0.1% DEPC-H2O 溶解沈澱物，並於 55℃ Incubator 中反應 10 分鐘，接著於 4℃冰箱中貯存隔夜(Overnight)。最後測其吸光 值(OD260)以便換算所萃取之 RNA 濃度。 RNA 濃度(μg/ml)＝稀釋倍數 × OD260 × 40 (μg/ml). 2.8 反轉錄作用(Reverse Transcription ,RT) 取 2μg 之 RNA，加入適量之 0.1% DEPC-H2O 至體積為 25.75μl， 以 70 ℃ 處 理 5 分 鐘 後 ， 再 分 別 加 入 0.25μl RNase inhibitor (40U/μl)、10μl 5× RT buffer (Promega；50mM Tris-HCl、75mM KCl、 3mM MgCl2 及 10mM DTT)、4μl dNTP (Promega；10mM)及 5μl Oligo dT， 接著於溫度循環處理機 42℃執行 5 分鐘後，加入 5μl 40U reverse 23.
(33) transcriptase (1μl 200U reverse transcriptase ＋ 4μl 0.1% DEPC-H2O)，並於 42℃反應一小時後，再以 99℃執行 5 分鐘，最後維 持於 4℃保存反轉錄所得之 cDNA 產物。. 2.9 引子合成 (Primer Synthesis) 本實驗所需的引子(Primer)皆為生工公司製備，各組引子之條件 設定請參閱下述： (a) sense primer of FGF -2(5,-GCATCACTTCGCTTCCCGCA-3,) antisense primer of FGF- 2 (5,-TCTGTCCAGGCCCCGTTTTG-3,) (b) sense primer of UPA(5,-GTGCAGGACTGCTCTCTCAG-3,) antisense primer of UPA(5,-GAGGTCCTCCTGAATCTCCC-3,) (c) sense primer of PAI-I (5,-TGAGATCAGTACTGCGGACG-3,) antisense primer of PAI-I(5,-GAGGGGCACATCTTTTTCAA-3,) (d) sense primer of Cyclin A (5,-GCAGAGTTCTGATGGAGAGA-3,) antisense primer of Cyclin A (5,-ACAGTCTTGCAGGTGACATC-3,) (e) sense primer of Cyclin B (5,-CTGCTGCAGGAGACCATGTA-3,) antisense primer of Cyclin B (5,-CTCCGTGTGGGACAGGTAGT-3,) (f) sense primer of Cyclin D (5,-AGGAGACCATTCCCCTGACT-3,) antisense primer of Cyclin D (5,-TTCTTCCTCCACTTCCCCTT-3,) (g) sense primer of Cyclin E (5,-CTTACCTGAGAGATGAGCAC-3,) 24.
(34) antisense primer of Cyclin E (5,-CACCACTGATAACCTGAGAC-3,) (h) sense primer of GAPDH(5,-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3,) antisense primer of GAPDH(5,-CCACAGTCTTCTGAGTGGCA-3,). 2.10 聚合酵素連鎖反應(polymerase Chain Reaction，PCR) 取 5μl cDNA 加入 11μl ddH2O、2.5μl forward primer、2.5 μl reverse primer、1μl dNTP (10 mM)、25μl 10 × PCR buffer (DyNA；10 Mm Tris- HCl、1.5 mM MgCl2、50 mM KCl 0.1% Triton X-100) 和 0,5μl DNA polymerase (DyNA；2U/μl)，混合均勻後，再將樣 品放回 PCR 機器中，以 94℃反應 5 分鐘之後，進入 PCR 循環：94℃ ㄧ分鐘、primer 煉合(annealing)溫度，30 秒、72℃，一分鐘。其中 循環次數依及煉合溫度則依 RNA 表現量及 primer Tm 値來決定，接著 再以 72℃反應 10 分鐘，最後以 4℃保存。. 2.11 DNA 電泳 依照不同產物的片段大小分別配製 0.8、1.2、1.6 % DNA 電泳膠 片(agarose gel)。取 5 或 10μl PCR 產物加入 1 或 2μl 之 6 × DNA loading dye，混合均勻，再將其緩慢注入 DNA 電泳膠片之 well 中。. 25.
(35) 以 100 伏特強度之電壓進行約 35 分鐘電泳；最後以 Ethidium bromide (EtBr)作用於電泳膠片約 10~20 分鐘，利用 UV 光分析 PCR 產物其表 現情形為何。. 2.12 細胞總蛋白萃取 細胞依實驗需求處理過後，倒掉培養液，用 PBS 清洗細胞 2~3 次；再加入適量(150~200μl/dish)的 lysis buffer (50mM PH7.5 Tris- base、0.5M NaCl、1 mM pH8 EDTA、1 Mm beta-mercaptoethanol、 1% NP40、1% Glycerol、protein kinase inhibitor 兩錠，溶於二 次水中，總體積 20ml)，以細胞刮棒收集細胞。收集的細胞置於冰上 反應 30 分鐘，每隔 5 分鐘震蕩一次，接著以 12000 rpm、4℃ 離心 20 分鐘，收取上清液即為細胞之總蛋白，可保存於-80℃。. 2.13 蛋白質定量 萃取好的蛋白以二次水做適量稀釋(10 公分培養皿培養之細胞 以 200μl lysis buffer 收集的總蛋白約稀釋成 10~20 倍用以定量) 同時以 Bovine Serum Albumin(BSA)做出蛋白質標準曲線當作對照， 分別稀釋成 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml 的標準品。以相同體. 26.
(36) 積的標準品以及蛋白稀釋液，分別加入 250μl 之 Alkaline Copper reagent(2% Na-K tartrate、1% CuSO4．5H2O、2% Na2CO3 in 0.1N NaOH； 三者以 1：1：98 之比例混合)，室溫作用 10 分鐘，接著加入 25μl 之 Folin – Ciocalteu phenol reagent，室溫作用 30 分鐘，抽取 200μl 至 96 孔盤中，以 750 nm 波長測定吸光值，待測蛋白之數值 回歸到標準品所作出標準曲線，即可得知待測蛋白濃度。. 2.14 西方墨點(Western blotting) 取樣品蛋白質 40~50 μg，再加入 5μl loading dye，並用 1 倍 的 PBS 將總體積補至 25μl；混合均勻後，將樣品蛋白以 99℃ denature 5 分鐘，將水氣 spin down 後，即可進行 SDS-PAGE 電泳分 析。SDS-PAGE 之上層膠為 4% 之 stacking gel，下層膠為 8%~15% (依 所預測定之蛋白質分子量大小決定) 之 separating gel。把 denature 過的樣品蛋白 loading 至上層膠的 U 型槽(well)中，以 running buffer 跑膠 75 伏特、兩個小時。待電泳結束即可進行轉漬 (transfer)，以 transfer holder 的白色部份為底部，逐一平鋪浸 濕之菜瓜布、Whatman 3M 濾紙、預先以甲醇浸泡的 PVDF 膜、下層膠 (separating gel)、Whatman 3M 濾紙、菜瓜布；要注意每層物質間 不能含有氣泡。將 transfer holder 固定後，即可置於. 27.
(37) electrotransfer tank，並注入 transfer buffer，於 4℃下進行電 轉漬(transfer)100 伏特、90 分鐘。轉漬完成後，取出 PVDF 膜並加 入 blocking buffer 於室溫下搖動 1 小時；加入 1 級抗體(2μl/ml with blocking buffer)，於 4℃下反應 overnight；之後以 1 倍的 TBS buffer 清洗 PVDF 膜三次，每次 15 分鐘。而後加入 2 級抗體(2 μl/ml with TBS buffer)，並於室溫下反應 1 小時，再用 1 倍的 TBS buffer 清洗 PVDF 膜三次，每次 15 分鐘；最後以 ECL kit 進行冷光 呈色反應。. 2.15 細胞移動實驗(Migration assay) 將細胞株培養在 6 公分培養皿，養至約 7 分滿時，換上不含酚紅 的培養液，並將細胞做不同試劑處理。接著，把反應過後的細胞利用 PBS 清洗後，加入 1％ Trypsin 將細胞從培養皿上游離下來，溶於 1 ml 含有 1% Charcoal FBS 的培養液中，計算細胞總數，並將每盤細 4. 胞稀釋成 1.5 × 10 cells / 50μl( 30 ×. 4. 10 cells / 1 ml)之濃. 度。細胞的前處理完成之後，便可將 48 well Boyden chambers (Neuro Probe，MD，USA) 打開，於下層 chamber 注入含有 10% Charcoal FBS 的培養液；其含量為 32μl/well。下層 chamber 上再進一步依序放 置 8μm pore size 的 polycarbonate filter、塑膠墊、上層 chamber. 28.
(38) ，用螺絲將 chamber 的 6 個角落都鎖緊後，於上層 chamber 加入 50 μl 之前所稀釋的細胞溶液，過程中應注意避免氣泡的產生。用保鮮 膜蓋上 chamber，在 37℃，5% 二氧化碳的環境之下培養 4~6 小時後， 把 chamber 拆開，小心把 filter 拿出，將接近下層較粗糙的那面以 甲醇固定 10 分鐘，再利用 0.5% Giemsa 染色 1 小時；用二次水退染， 之後用拭鏡紙將 filter 背面擦拭乾淨，並將 filter 固定在新的培 養皿上，在光學顯微鏡下觀察且計算移動之細胞數目。. 2.16 蛋白分解酵素膠電泳法 (Gelatin Zymography Protease Assay) 將已經與黃耆反應 24 小時後的細胞培養液與 5 倍蛋白質 loading dye 混合後，置入 0.1 % gelatin – 8 % SDS-PAGE 中，在 120 V 下 跑電泳 3~4 小時。接著將電泳膠片取下，以 2.5 % Triton X-100 溶 液搖晃沖洗 30 分鐘兩次，使蛋白酵素功能還原。再將此電泳膠片培 養於 200 ml 的反應液中( 40 mM Tris-HCl , pH 8.0 ; 10 mM CaCl2 , 0.01 % NaN3 ) , 37 ℃、16 小時；最後以 0.25 % 的 Coomassie blue R-250 染 色 30 分 鐘 ， 再 以 退 色 劑 溶 液 ( 875 ml dH20 , 50 ml methanol ,和 75 ml 醋酸 ) 脫色。. 2.17 分析膠原蛋白酵素定量法(Quantitative Analysis of 29.
(39) Zymography) 表現出來的 92 kDa (proMMP-9)，72 kDa (proMMP-2) 和 62 kDa (活化 MMP-2) 膠原蛋白脢的 bands，將以 AlphaImager 2000 密度 儀測其相對密度結果，將以 student t-test 做統計分析，P < 0.05 表現顯著差異。. 2.18 統計分析 每個檢體的結果皆為三重複實驗之平均值，採用 student t-test 分析軟體；P<0.05 表示顯著性差異，P<0.01 表示極顯著性 差異，P<0.001 表示超顯著性差異。. 30.
(40) 第 四 章 實 驗 結 果 第一節：黃耆能促進 Rsc 96 細胞的增生能力。 先將史旺神經膠細胞 Rsc 96 轉殖至 24 孔盤培養皿中，經過隔 夜使細胞貼盤，接著更換只含有 1% 胎牛血清的培養液與細胞反應 4 小時；使細胞飢餓；再加入不同濃度(1.25、12.5、125、250 與 500 μg/ml)的黃耆刺激 24 小時後；由圖 4.1 MTT 的實驗結果發現，Rsc 96 的細胞活性隨著黃耆的濃度增加，有明顯上升的趨勢；而於濃度為 12.5μg/ml 時，效用最好 (P<0.01)；而在高濃度(125~500μg/ml) 的黃耆刺激下，細胞活性雖然沒有低濃度(12.5μg/ml)時佳，但與沒 有加藥的控制組相比，其仍然有顯著性差異(P<0.05)。. 圖 4.1 黃耆刺激後 MTT 之實驗結果. 31.
(41) 我們同時也偵測了細胞增生之標定因子，細胞增生抗原 PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)的蛋白質表現量；由西方墨 點法的實驗結果得知，同樣在濃度 1.25~500μg/ml 的黃耆刺激之 下，PCNA 蛋白的表現量有逐漸增加的趨勢，圖 4.2。. Fold. 1. 1.04 1.07. 1.11. 1.55. 2.14. 圖 4.2 黃耆刺激後 PCNA 之表現量 最後，利用傷口癒合實驗(wound healing assay) 偵測在 1.25~500μg/ml 的濃度之黃耆刺激之下，Rsc 96 史旺神經膠細胞的 增生情形；由圖 4.3 實驗結果則觀察黃耆可明顯促進 Rsc 96 細胞快 速生長。. 圖 4.3 傷口癒合實驗 32.
(42) 將傷口癒合實驗中，每個組別的移動細胞數目進行統計後發現， 黃耆對於促進 Rsc 96 細胞增生的作用，有超顯著性的差異(P<0.001) 圖 4.4。. 圖 4.4 傷口癒合實驗結果量畫圖. 第二節：黃耆能活化細胞週期蛋白(Cell cycle protein)的 mRNA 以及蛋白質表現量。 將 Rsc 96 史旺細胞培養在 10 公分的培養皿中，當培養至 8 分滿 時，更換只含有 1% 胎牛血清的培養液與細胞反應 4 小時；使細胞飢 餓；再加入不同濃度(1.25、12.5、125、250 and 500μg/ml)的黃耆 刺激 24 小時；接著抽取細胞 mRNA，利用 RT-PCR 觀察細胞週期蛋白， Cyclin D1、Cyclin E 和 Cyclin A 之 mRNA 表現量。抽取細總胞蛋白 質，利用西方墨點法觀察細胞週期蛋白，Cyclin D1、Cyclin E 和 33.
(43) Cyclin A 的蛋白質表現量。在圖 4.5 之 RT-PCR 實驗結果發現，在濃 度為 1.25~125μg/ml 時，Cyclin D1、Cyclin E 以及 Cyclin A 的 mRNA 表現量明顯上升，但在 250 和 500μg/ml 的黃耆刺激下，mRNA 的表 現量則開始下降。. 圖 4.5. RT-PCR 實驗偵測細胞週期調控因子之 mRNA 表現量. 而由西方墨點法的實驗結果中則發現，Cyclin D1、Cyclin E 以 及 Cyclin A 的蛋白質表現量有逐漸上升的趨勢，但唯獨 Cyclin E 的 蛋白質 500μg/ml 的黃耆刺激下的表現量則有稍微下降的情形，圖 4.6。. 34.
(44) 圖 4.6. 西方墨點法偵測細胞週期調控因子之蛋白質表現量. 第三節：黃耆經由活化 MAPK signaling pathway 促進 Rsc 96 史旺神經膠細胞增生。 我們利用 Western blot 觀察，以 1.25-500 μg/ml 的黃耆刺激 後，MAPK signaling Pathway 中主要的訊息傳遞因子 ERK1/2, JNK1/2, P38 以及其磷酸化態的蛋白表現情形。由實驗結果得知，在濃度在 12.5~500 μg/ml 的黃耆刺激下，可活化磷酸化態的 ERK1/2 和 P38 蛋白，使其大量表現；而在濃度為 125~250 μg/ml 時，則可促使磷 酸化態的 JNK1/2 蛋白表現量上升。同時，在濃度高達 500 μg/ml 的 黃耆刺激後，則因生長活性被抑制了，其使磷酸化態的 JNK1/2 及 P38 蛋白質表現量也因此下降，圖 4.7。. 35.
(45) 圖 4.7. 西方墨點法偵測 MAPK 訊息調控蛋白表現量. 接著，為了要進一步的確定黃耆促進 Rsc 96 細胞增生確實是經 由活化 MAPK signaling pathway 而產生的；我們將細胞處理 125μ g/ml 濃度的黃耆刺激後，再分別加入 MEK 的抑制劑 U0126、P38 的抑 制劑 SB203580，以及 JNK 的抑制劑 SP600125，抑制上述三種蛋白的 表現量；最後用 MTT 偵側細胞的活性，並以西方墨點法偵測 PCNA 的 蛋白表現情形。而由圖 4.8 中 MTT 的實驗結果發現，利用 MEK 的抑制 劑 U0126，抑制 MEK 蛋白表現後，原本被黃耆刺激的細胞活性明顯降 低(P<0.001) ；同樣的，加入 P38 的抑制劑 SB203580 後，細胞活性 也有被抑制的情形(P<0.05)。. 36.
(46) 圖 4.8. 加入 MAPK 抑制劑後 MTT 之實驗結果. 以西方墨點法觀察到 PCNA 的蛋白表現量亦明顯下降，證明了黃耆確 實是經由活化 MAPK signaling pathway 中的 P38 和 ERK 路徑來促進 Rsc 96 神經細胞增生，圖 4.9。. Fold. 圖 4.9. 1. 1.63. 1.41. 1.40. 1.64. 加入 MAPK 抑制劑後 PCNA 之表現量. 37.
(47) 第四節：黃耆經由活化抗結痂(Scar)FGF-2-UPA-MMPs 途徑因 子促進 RSC 96 史旺神經膠細胞的移動作用 。 將 Rsc 96 史旺細胞培養在六孔盤的培養皿中，當培養至 8 分滿 時，更換只含有 1% 胎牛血清的培養液與細胞反應 4 小時；使細胞飢 餓；再加入不同濃度(1.25、12.5、125、250 and 500μg/ml)的黃耆 刺激 24 小時後；首先，蒐集細胞之培養液，利用 Zymography 實驗偵 測基質金屬蛋白酶-9 & -2(MMP -9 & -2) 之活性。將細胞取下後， 利用 Boyden chamber system 偵測 Rsc 96 史旺神經膠細胞的移動作 用；接著抽取細胞 mRNA，利用 RT-PCR 觀察 FGF-2-UPA-MMPs 途徑因 子，FGF-2、UPA 和 PAI-1 之 mRNA 表現量。抽取細總胞蛋白質，利用 西方墨點法觀察 FGF-2-UPA-MMPs 途徑因子，FGF-2、UPA 和 PAI-1 的 蛋白質表現量。由細胞移動實驗(Boyden chamber system)結果發現， 加入黃耆的刺激後，Rsc 96 史旺神經膠細胞的移動作用有明顯增加， 其中又以 1.25μg/ml 的效果最佳，圖 4.10。. 38.
(48) 圖 4.10. 加入黃耆刺激後 RSC 96 細胞的移動情形. 將實驗中每個組別的移動細胞數目進行統計後可知，黃耆對於促 進 Rsc 96 細胞的移動作用，有超顯著性的差異 P<0.001，圖 4.11。. 圖 4.11 39. 移動細胞數目之量化圖.
(49) 在 RT-PCR 實驗結果發現隨著黃耆的濃度增加， FGF-2 和 UPA 的 mRNA 表現量明顯上升；而 UPA 的抑制劑 PAI-1，其 mRNA 表現量則在 125-500 μg/ml 的黃耆刺激後，有逐漸下降的趨勢，圖 4.12。. 圖 4.12. RT-PCR 實驗偵測 FGF-2-UPA 調控因子之 mRNA 表現量. 由西方墨點法觀察出的蛋白質表現量，也有相同的趨勢，圖 4.13。. 圖 4.13. 西方墨點法偵測 FGF-2-UPA 調控因子之蛋白質表現量. 最後，在 Zymography 實驗，我們更偵測到 MMP 9 的酵素活性， 隨著黃耆的藥物濃度增加，有逐漸上升的趨勢；至於在此作為實驗操 40.
(50) 作之控制組的 MMP 2，酵素活性則沒有任何變化，圖 4.14。. 圖 4.14. 41. Zymography 實驗結果.
(51) 第 五 章 討. 論. 在早期的年代，中藥醫學一直被視為沒有科學根據的傳統療法； 但由於研究技術的逐漸發達，許多的中草藥經由科學的方式，將有效 成分加以分析並深入探討；中醫治療逐漸與臨床醫學結合，甚至在學 術界佔有一席之地。近年來，以中草藥結合生醫材料，強化周邊神經 受損後的治療作用；如此的創意研究，逐漸受到學術界之關注[46, 47]。依據之前所發表的文獻，已知史旺神經膠細胞所分泌的附著物 質(Adhesion molecular)以及生長因子(Growth factor)，對於神經 細胞受損後的修復和再生作用，有著關鍵性的調控功能[48]。而黃耆 是自古以來最為熟知並廣泛應用的中藥材之一，常被用於補中益氣以 及增強免疫力等；近期則有文獻指出，黃耆有促進神經軸突的成熟， 以及活化血管上皮細胞生長、增加DNA合成的效用[49]。因此，在本 篇論文中，我們將會偵測中藥黃耆對於神經膠細胞RSC 96的生長機 制，是否有促進的功用，以及其生長調控機制之分子機制。 為了釐清黃耆對於神經細胞的增生機制是否有著加強的功效，我 們首先利用細胞存活測試(MTT)實驗偵測處理黃耆後，RSC 96 史旺神 經細胞的代謝活性。當細胞加入不同濃度(1.25、12.5、125、250 與 500μg/ml)的黃耆刺激，由實驗結果發現，與控制組比較之 RSC 96. 42.
(52) 細胞活性明顯增加(P<0.05)；但所有的藥物濃度中，又以 12.5μg/ml 的藥效最佳(P<0.01)；由此可知，RSC 96 史旺神經膠細胞的代謝活 性確實會因黃耆的刺激而增加。接著，我們也利用西方墨點法偵測了 細胞增生之標定因子，細胞增生抗原 PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen)的蛋白質表現量[50]；以此觀察黃耆對於促進神經 細胞複製能力(replication)的效用。由實驗結果得知，隨著黃耆的 加藥濃度增加，PCNA 蛋白的表現量有逐漸上升的趨勢。同時，我們 更以另一個偵測細胞增生的相關實驗，傷口癒合實驗(wound healing assay)，再次測定黃耆促進 RSC 96 史旺神經膠細胞增生的能力。實 驗發現，黃耆增加了神經細胞的複製(replication)效率，使細胞生 長的速度明顯加快(P<0.001)，但其中又以 1.25~125μg/ml 的加藥濃 度效果最為顯著。綜合 PCNA 的蛋白表現量以及傷口癒合實驗(wound healing assay)之結果，證明了黃耆有促進神經細胞增生的功能。 已知當細胞在進行複製(replication)作用時，會活化細胞週期 (Cell cycle)(51)以及有絲分裂原活化蛋白激酶(MitogenActivated Protein Kinase，MAPK) [52]訊息傳遞路徑。為了進一步 探討黃耆對於 RSC 96 史旺神經膠細胞增生作用的分子機制，我們抽 取細胞了細胞之 mRNA，利用 RT-PCR 觀察細胞週期蛋白，Cyclin D1、 Cyclin E 和 Cyclin A mRNA 表現量。由實驗結果得知，在 1.25~125. 43.
(53) μg/ml 濃度的黃耆刺激之下，能有效促進這三個蛋白質的 mRNA 合 成。接著，抽取細胞總蛋白質，並同時偵測細胞週期蛋白和 MAPK 訊 息調控因子 ERK1/2, JNK1/2, P38 以及其磷酸化態的蛋白表現情形。 實驗發現，Cyclin D1、Cyclin E 和 Cyclin A 的蛋白表現量會隨著 黃耆的濃度增加而上升；代表著 RSC 96 史旺神經膠細胞的複製能力 (Replication) [37]與有絲分裂能力(Miotosis)[40]皆能因黃耆的 刺激而被活化。有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)是一群經由磷酸化才能展現活性的蛋白酶 [53]，在加入黃耆的刺激後，結果顯示 12.5~500 μg/ml 的藥物濃 度，可使磷酸化態的 ERK1/2 和 P38 蛋白大量表現；而在濃度為 125~250 μg/ml 時，則可促使磷酸化態的 JNK1/2 蛋白表現量上升； 但若觀察這三個 MAPK 激酶原態蛋白的表現量，則發現它們並不會因 黃耆的刺激而有所改變。由此可知，黃耆在活化 MAPK 訊息傳遞路徑 時，是經由促進其蛋白活性而產生，而非蛋白質的生合成作用；其中 又以磷酸化態的 ERK1/2 和 P38 蛋白的感受性最強。 接著，為了要確定黃耆促進 Rsc 96 細胞增生確實是經由活化 MAPK signaling pathway 而產生的；我們以 MEK 的抑制劑 U0126 [54]、P38 的抑制劑 SB203580 [55]，以及 JNK 的抑制劑 SP600125[56]，抑制 上述三種蛋白的表現量；接著以 MTT 偵側細胞的活性，並以西方墨點. 44.
(54) 法偵測 PCNA 的蛋白表現情形。而由 MTT 的實驗結果發現，當 MEK 以 及 P38 的蛋白表現量被抑制之後，RSC96 史旺細胞的活性也有被抑制 的情形；以西方墨點法觀察到 PCNA 的蛋白表現量亦明顯下降。另一 方面，當我們以抑制劑抑制 JNK 蛋白時，不管是細胞活性或者是 PCNA 蛋白的表現量，皆未受到任何影響。綜合以上的實驗結果，證明了黃 耆是經由活化 MAPK 訊息傳遞中的 P38 和 ERK 路徑來促進 Rsc 96 神經 膠細胞增生，JUK 路徑並沒有參與其中。 當周邊神經受損時，史旺細胞會移動到受損的部位，經由其不斷 的分裂增殖以及神經生長因子(NGF)之分泌，可誘導刺激軸突的再生 和髓鞘的形成[57, 58]；因此我們下一步將探討史旺細胞之移動作 用。在以 Boyden chambers 觀測 RSC96 史旺神經膠細胞之移動情形 後，發現黃耆能明顯增加細胞的轉移功能(Migration)。然而，黃耆 是經由何種分子機制調控 RSC96 史旺神經細胞的移動能力?在將近期 發表之文獻做一番統整後發現，在受損的神經組織中，FGF-2 會大量 表現，並提升 UPA 基因表現量；接著 UPA 會活化基質金屬蛋白酶(MMPs) 以及刺激胞漿素原(Plasminogen)轉換成胞漿素(Plasmin)，這兩種細 胞外基質的分解蛋白會不斷進行降解作用，促使細胞的轉移功能增加 [44]。因此，本實驗同時以 RT-PCR 以及西方墨點法觀察 FGF-2-UPAMMPs 途徑因子，FGF-2、UPA 和 UPA 的專一抑制蛋白 PAI-1 之 mRNA. 45.
(55) 及蛋白質表現量。實驗結果得知，黃耆能同時活化 FGF-2 和 UPA 的 mRNA 及蛋白質，使其大量表現；至於 PAI-1 則會因黃耆的作用而表 現量下降。接著，已知 MMP 9 能活化 uPA/plasmin 系統，並促進細胞 的移動性 [59]；我們以蛋白分解酵素膠電泳法 (Gelatin Zymography Protease Assay)觀察到 MMP 9 的酵素活性會因為黃耆刺 激濃度的上升而增加。透過以上分子機轉的偵測，可知黃耆確實會透 過活化 FGF-2-UPA-MMPs 訊息傳遞路徑，增加 RSC96 史旺神經膠細胞 之移動作用。 在眾多的細胞生長因子中，除了上述所提到之神經生長因子(NGF) 以及纖維母細胞生長因子(FGF)能刺激神經的再生作用，更有學者指 出肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)對於神經幹細 胞的生長及分化有促進的功能[60]，它同時為史旺細胞的有絲分裂源 (Mitogen) [61]。類胰島素生長因子(Insulin-like Growth Factor-1，IGF-1)，則會透過活化Ras-Raf路徑增加cyclin D1蛋白質 表現量，促進骨骼肌(Skeletal muscle)的再生作用[62]。未來，我 們不但會將這兩個訊息傳遞路徑套用於黃耆對RSC96史旺神經膠細胞 增生作用之分子機制，做進一步的探討；更會與陳悅生老師實驗室合 作，將黃耆的功效套用到動物模式中，觀測其對於SD大鼠坐股神經的 再生，是否也有刺激活化之功能。. 46.
(56) 第 六 章 結. 論. 已知MAPK訊息路徑可調控許多生理機制，如器官發展、細胞增生 及分化等功能，而其中也包含了細胞週期(Cell cycle)的調節[63, 64]。因此，統整本篇所有的實驗結果後得知:黃耆促進RSC 96史旺神 經膠細胞的再生機制可分為刺激細胞增生以及增加細胞移動性兩大 路徑。如圖6.1所示，在刺激細胞增生的訊息路徑中，黃耆會活化磷 酸化MAPK家族中的ERK及P38蛋白，接著調控細胞週期蛋白Cyclin D1、Cyclin E和Cyclin A，使其大量表現，促進了RSC 96史旺神經細 胞的增殖(Replication)作用。而在細胞移動訊息路徑中，黃耆首先 會刺激FGF-2蛋白大量表現，接著再透過UPA活化MMP 9的酵素活性， 增加了RSC 96史旺神經細胞的移動作用；經由這兩方面的調節，黃耆 便能有效的促進神經細胞的再生。. 47.
(57) 圖 6.1 總結黃耆在 RSC96 史旺細胞株中，活化其增生及移動之分子 機制. 48.
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