第三章 材料與方法
第二節 實驗方法
2.18 統計分析
每個檢體的結果皆為三重複實驗之平均值，採用 student t-test 分析軟體；P<0.05 表示顯著性差異，P<0.01 表示極顯著性 差異，P<0.001 表示超顯著性差異。
第 四 章 實 驗 結 果
第一節：黃耆能促進 Rsc 96 細胞的增生能力。
先將史旺神經膠細胞 Rsc 96 轉殖至 24 孔盤培養皿中，經過隔 夜使細胞貼盤，接著更換只含有 1% 胎牛血清的培養液與細胞反應 4 小時；使細胞飢餓；再加入不同濃度(1.25、12.5、125、250 與 500 μg/ml)的黃耆刺激 24 小時後；由圖 4.1 MTT 的實驗結果發現，Rsc 96 的細胞活性隨著黃耆的濃度增加，有明顯上升的趨勢；而於濃度為 12.5μg/ml 時，效用最好 (P<0.01)；而在高濃度(125~500μg/ml) 的黃耆刺激下，細胞活性雖然沒有低濃度(12.5μg/ml)時佳，但與沒 有加藥的控制組相比，其仍然有顯著性差異(P<0.05)。
圖 4.1 黃耆刺激後 MTT 之實驗結果
我們同時也偵測了細胞增生之標定因子，細胞增生抗原 PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)的蛋白質表現量；由西方墨 點法的實驗結果得知，同樣在濃度 1.25~500μg/ml 的黃耆刺激之 下，PCNA 蛋白的表現量有逐漸增加的趨勢，圖 4.2。
圖 4.2 黃耆刺激後 PCNA 之表現量 最後，利用傷口癒合實驗(wound healing assay) 偵測在
1.25~500μg/ml 的濃度之黃耆刺激之下，Rsc 96 史旺神經膠細胞的 增生情形；由圖 4.3 實驗結果則觀察黃耆可明顯促進 Rsc 96 細胞快 速生長。
圖 4.3 傷口癒合實驗 Fold 1 1.04 1.07 1.11 1.55 2.14
將傷口癒合實驗中，每個組別的移動細胞數目進行統計後發現，
黃耆對於促進 Rsc 96 細胞增生的作用，有超顯著性的差異(P<0.001) 圖 4.4。
圖 4.4 傷口癒合實驗結果量畫圖
第二節：黃耆能活化細胞週期蛋白(Cell cycle protein)的 mRNA 以及蛋白質表現量。
將 Rsc 96 史旺細胞培養在 10 公分的培養皿中，當培養至 8 分滿 時，更換只含有 1% 胎牛血清的培養液與細胞反應 4 小時；使細胞飢 餓；再加入不同濃度(1.25、12.5、125、250 and 500μg/ml)的黃耆 刺激 24 小時；接著抽取細胞 mRNA，利用 RT-PCR 觀察細胞週期蛋白，
Cyclin D1、Cyclin E 和 Cyclin A 之 mRNA 表現量。抽取細總胞蛋白 質，利用西方墨點法觀察細胞週期蛋白，Cyclin D1、Cyclin E 和
Cyclin A 的蛋白質表現量。在圖 4.5 之 RT-PCR 實驗結果發現，在濃 度為 1.25~125μg/ml 時，Cyclin D1、Cyclin E 以及 Cyclin A 的 mRNA 表現量明顯上升，但在 250 和 500μg/ml 的黃耆刺激下，mRNA 的表 現量則開始下降。
圖 4.5 RT-PCR 實驗偵測細胞週期調控因子之 mRNA 表現量
而由西方墨點法的實驗結果中則發現，Cyclin D1、Cyclin E 以 及 Cyclin A 的蛋白質表現量有逐漸上升的趨勢，但唯獨 Cyclin E 的 蛋白質 500μg/ml 的黃耆刺激下的表現量則有稍微下降的情形，圖 4.6。
圖 4.6 西方墨點法偵測細胞週期調控因子之蛋白質表現量
第三節：黃耆經由活化 MAPK signaling pathway 促進 Rsc 96 史旺神經膠細胞增生。
我們利用 Western blot 觀察，以 1.25-500 μg/ml 的黃耆刺激 後，MAPK signaling Pathway 中主要的訊息傳遞因子 ERK1/2, JNK1/2, P38 以及其磷酸化態的蛋白表現情形。由實驗結果得知，在濃度在 12.5~500 μg/ml 的黃耆刺激下，可活化磷酸化態的 ERK1/2 和 P38 蛋白，使其大量表現；而在濃度為 125~250 μg/ml 時，則可促使磷 酸化態的 JNK1/2 蛋白表現量上升。同時，在濃度高達 500 μg/ml 的 黃耆刺激後，則因生長活性被抑制了，其使磷酸化態的 JNK1/2 及 P38 蛋白質表現量也因此下降，圖 4.7。
圖 4.7 西方墨點法偵測 MAPK 訊息調控蛋白表現量
接著，為了要進一步的確定黃耆促進 Rsc 96 細胞增生確實是經 由活化 MAPK signaling pathway 而產生的；我們將細胞處理 125μ g/ml 濃度的黃耆刺激後，再分別加入 MEK 的抑制劑 U0126、P38 的抑 制劑 SB203580，以及 JNK 的抑制劑 SP600125，抑制上述三種蛋白的 表現量；最後用 MTT 偵側細胞的活性，並以西方墨點法偵測 PCNA 的 蛋白表現情形。而由圖 4.8 中 MTT 的實驗結果發現，利用 MEK 的抑制 劑 U0126，抑制 MEK 蛋白表現後，原本被黃耆刺激的細胞活性明顯降 低(P<0.001) ；同樣的，加入 P38 的抑制劑 SB203580 後，細胞活性 也有被抑制的情形(P<0.05)。
圖 4.8 加入 MAPK 抑制劑後 MTT 之實驗結果
以西方墨點法觀察到 PCNA 的蛋白表現量亦明顯下降，證明了黃耆確 實是經由活化 MAPK signaling pathway 中的 P38 和 ERK 路徑來促進 Rsc 96 神經細胞增生，圖 4.9。
圖 4.9 加入 MAPK 抑制劑後 PCNA 之表現量
Fold 1 1.63 1.41 1.40 1.64
第四節：黃耆經由活化抗結痂(Scar)FGF-2-UPA-MMPs 途徑因 子促進 RSC 96 史旺神經膠細胞的移動作用 。
將 Rsc 96 史旺細胞培養在六孔盤的培養皿中，當培養至 8 分滿 時，更換只含有 1% 胎牛血清的培養液與細胞反應 4 小時；使細胞飢 餓；再加入不同濃度(1.25、12.5、125、250 and 500μg/ml)的黃耆 刺激 24 小時後；首先，蒐集細胞之培養液，利用 Zymography 實驗偵 測基質金屬蛋白酶-9 & -2(MMP -9 & -2) 之活性。將細胞取下後，
利用 Boyden chamber system 偵測 Rsc 96 史旺神經膠細胞的移動作 用；接著抽取細胞 mRNA，利用 RT-PCR 觀察 FGF-2-UPA-MMPs 途徑因 子，FGF-2、UPA 和 PAI-1 之 mRNA 表現量。抽取細總胞蛋白質，利用 西方墨點法觀察 FGF-2-UPA-MMPs 途徑因子，FGF-2、UPA 和 PAI-1 的 蛋白質表現量。由細胞移動實驗(Boyden chamber system)結果發現，
加入黃耆的刺激後，Rsc 96 史旺神經膠細胞的移動作用有明顯增加，
其中又以 1.25μg/ml 的效果最佳，圖 4.10。
圖 4.10 加入黃耆刺激後 RSC 96 細胞的移動情形 將實驗中每個組別的移動細胞數目進行統計後可知，黃耆對於促 進 Rsc 96 細胞的移動作用，有超顯著性的差異 P<0.001，圖 4.11。
圖 4.11 移動細胞數目之量化圖
在 RT-PCR 實驗結果發現隨著黃耆的濃度增加， FGF-2 和 UPA 的 mRNA 表現量明顯上升；而 UPA 的抑制劑 PAI-1，其 mRNA 表現量則在 125-500 μg/ml 的黃耆刺激後，有逐漸下降的趨勢，圖 4.12。
圖 4.12 RT-PCR 實驗偵測 FGF-2-UPA 調控因子之 mRNA 表現量 由西方墨點法觀察出的蛋白質表現量，也有相同的趨勢，圖 4.13。
圖 4.13 西方墨點法偵測 FGF-2-UPA 調控因子之蛋白質表現量 最後，在 Zymography 實驗，我們更偵測到 MMP 9 的酵素活性，
隨著黃耆的藥物濃度增加，有逐漸上升的趨勢；至於在此作為實驗操
作之控制組的 MMP 2，酵素活性則沒有任何變化，圖 4.14。
圖 4.14 Zymography 實驗結果
第 五 章 討 論
在早期的年代，中藥醫學一直被視為沒有科學根據的傳統療法；
但由於研究技術的逐漸發達，許多的中草藥經由科學的方式，將有效 成分加以分析並深入探討；中醫治療逐漸與臨床醫學結合，甚至在學 術界佔有一席之地。近年來，以中草藥結合生醫材料，強化周邊神經 受損後的治療作用；如此的創意研究，逐漸受到學術界之關注[46, 47]。依據之前所發表的文獻，已知史旺神經膠細胞所分泌的附著物 質(Adhesion molecular)以及生長因子(Growth factor)，對於神經 細胞受損後的修復和再生作用，有著關鍵性的調控功能[48]。而黃耆 是自古以來最為熟知並廣泛應用的中藥材之一，常被用於補中益氣以 及增強免疫力等；近期則有文獻指出，黃耆有促進神經軸突的成熟，
以及活化血管上皮細胞生長、增加DNA合成的效用[49]。因此，在本 篇論文中，我們將會偵測中藥黃耆對於神經膠細胞RSC 96的生長機 制，是否有促進的功用，以及其生長調控機制之分子機制。
為了釐清黃耆對於神經細胞的增生機制是否有著加強的功效，我 們首先利用細胞存活測試(MTT)實驗偵測處理黃耆後，RSC 96 史旺神 經細胞的代謝活性。當細胞加入不同濃度(1.25、12.5、125、250 與 500μg/ml)的黃耆刺激，由實驗結果發現，與控制組比較之 RSC 96
細胞活性明顯增加(P<0.05)；但所有的藥物濃度中，又以 12.5μg/ml 的藥效最佳(P<0.01)；由此可知，RSC 96 史旺神經膠細胞的代謝活 性確實會因黃耆的刺激而增加。接著，我們也利用西方墨點法偵測了 細胞增生之標定因子，細胞增生抗原 PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen)的蛋白質表現量[50]；以此觀察黃耆對於促進神經 細胞複製能力(replication)的效用。由實驗結果得知，隨著黃耆的 加藥濃度增加，PCNA 蛋白的表現量有逐漸上升的趨勢。同時，我們 更以另一個偵測細胞增生的相關實驗，傷口癒合實驗(wound healing assay)，再次測定黃耆促進 RSC 96 史旺神經膠細胞增生的能力。實 驗發現，黃耆增加了神經細胞的複製(replication)效率，使細胞生 長的速度明顯加快(P<0.001)，但其中又以 1.25~125μg/ml 的加藥濃 度效果最為顯著。綜合 PCNA 的蛋白表現量以及傷口癒合實驗(wound healing assay)之結果，證明了黃耆有促進神經細胞增生的功能。
已知當細胞在進行複製(replication)作用時，會活化細胞週期 (Cell cycle)(
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)以及有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)[52]訊息傳遞路徑。為了進一步 探討黃耆對於 RSC 96 史旺神經膠細胞增生作用的分子機制，我們抽 取細胞了細胞之 mRNA，利用 RT-PCR 觀察細胞週期蛋白，Cyclin D1、
Cyclin E 和 Cyclin A mRNA 表現量。由實驗結果得知，在 1.25~125
μg/ml 濃度的黃耆刺激之下，能有效促進這三個蛋白質的 mRNA 合 成。接著，抽取細胞總蛋白質，並同時偵測細胞週期蛋白和 MAPK 訊 息調控因子 ERK1/2, JNK1/2, P38 以及其磷酸化態的蛋白表現情形。
實驗發現，Cyclin D1、Cyclin E 和 Cyclin A 的蛋白表現量會隨著 黃耆的濃度增加而上升；代表著 RSC 96 史旺神經膠細胞的複製能力 (Replication) [37]
與
有絲分裂能力(Miotosis)[40]皆能因黃耆的 刺激而被活化。有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)是一群經由磷酸化才能展現活性的蛋白酶 [53]，在加入黃耆的刺激後，結果顯示 12.5~500 μg/ml 的藥物濃 度，可使磷酸化態的 ERK1/2 和 P38 蛋白大量表現；而在濃度為 125~250 μg/ml 時，則可促使磷酸化態的 JNK1/2 蛋白表現量上升；但若觀察這三個 MAPK 激酶原態蛋白的表現量，則發現它們並不會因 黃耆的刺激而有所改變。由此可知，黃耆在活化 MAPK 訊息傳遞路徑 時，是經由促進其蛋白活性而產生，而非蛋白質的生合成作用；其中 又以磷酸化態的 ERK1/2 和 P38 蛋白的感受性最強。
接著，為了要確定黃耆促進 Rsc 96 細胞增生確實是經由活化 MAPK signaling pathway 而產生的；我們以 MEK 的抑制劑 U0126[54]、P38 的抑制劑 SB203580 [55]，以及 JNK 的抑制劑 SP600125[56]，抑制 上述三種蛋白的表現量；接著以 MTT 偵側細胞的活性，並以西方墨點
法偵測 PCNA 的蛋白表現情形。而由 MTT 的實驗結果發現，當 MEK 以 及 P38 的蛋白表現量被抑制之後，RSC96 史旺細胞的活性也有被抑制 的情形；以西方墨點法觀察到 PCNA 的蛋白表現量亦明顯下降。另一 方面，當我們以抑制劑抑制 JNK 蛋白時，不管是細胞活性或者是 PCNA 蛋白的表現量，皆未受到任何影響。綜合以上的實驗結果，證明了黃 耆是經由活化 MAPK 訊息傳遞中的 P38 和 ERK 路徑來促進 Rsc 96 神經 膠細胞增生，JUK 路徑並沒有參與其中。
法偵測 PCNA 的蛋白表現情形。而由 MTT 的實驗結果發現，當 MEK 以 及 P38 的蛋白表現量被抑制之後，RSC96 史旺細胞的活性也有被抑制 的情形；以西方墨點法觀察到 PCNA 的蛋白表現量亦明顯下降。另一 方面，當我們以抑制劑抑制 JNK 蛋白時，不管是細胞活性或者是 PCNA 蛋白的表現量，皆未受到任何影響。綜合以上的實驗結果，證明了黃 耆是經由活化 MAPK 訊息傳遞中的 P38 和 ERK 路徑來促進 Rsc 96 神經 膠細胞增生，JUK 路徑並沒有參與其中。