第二章 文獻探討
第五節 神經再生的訊息傳遞路徑
第五節:神經再生的訊息傳遞路徑
因神經再生作用其中兩項重要機制為史旺細胞的增生作用以及其 移動功能；因此，在本篇論文中，針對增生作用我們偵測了細胞週期 (Cell cycle)以及有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)兩個與細胞生長極為相關的訊息路徑。再者，
從已經確定的動物模式中，在老鼠的坐骨神經之近端及遠端中間插入 導管讓史旺細胞充填在其中之後，發現類纖維生長因子-2
(Fibroblast growth factor-2 ，FGF-2)大量表現[17]；由此我們針 對史旺細胞的移動功能則偵測了FGF-2-MMPs 訊息路徑；希望能藉此 找出黃耆對於神經細胞再生的分子調控機制。而以上所敘述之訊息傳 導作用則詳述於下:
1. 細胞週期(Cell cycle)
細胞分裂週期分為幾個階段，依照其發生順序可分為 G1:DNA 合 成前期、S：DNA 合成時期、G2：有絲分裂(Mitosis)前期以及 M: 有 絲分裂時期。細胞在 G1 時期會開始準備 DNA 複製的材料，接著進入 DNA 複製的 S 期；當 DNA 複製完全後，會進入 G2 時期準備細胞分裂 的材料；最後進入有絲分裂時期，完成整個細胞週期[35]。
圖2.1 細胞週期(Cell cycle)
細胞週期的進行是由不同的週期素(Cyclin)所調控。週期素意味著這 些蛋白質的表現量會隨著細胞週期的進行而有所變化，在G1期首先會 大量表現週期素D (Cyclin D)，漸漸則由週期素E (Cyclin E)取代，
而之後的變化則是E->A->B [36]。
在細胞進行複製週期時，Cyclin D1會在早期G1時期會大量表現，
與依賴週期素激脢 (Cyclin-dependent kinase 4/6；CDK4/6)形成複 合體後，進而磷酸化視網膜細胞瘤(Retinoblastoma；Rb) 蛋白，促 使轉錄因子E2F從Rb上游離出來開啓基因的轉錄作用(Transcript- tion)；刺激細胞週期由G1時期進入S時期[37]。Cyclin E 則會在G1 末期開始表現，並大量生成於S時期；它的功能主要是協助調控細胞 由G1時期進入S時期以及啟動DNA的複製作用[38]。其調控方式與 Cyclin D1雷同；Cyclin E 亦會與Cyclin-dependent kinase (CDK) 之一的CDK2結合後，磷酸化視網膜細胞瘤(Retinoblastoma；Rb) 蛋 白，開啓基因的轉錄作用(Transcription) [39]。而Cyclin A同時調 控了S進入G2以及有絲分裂(Mitosis)時期，當Cyclin A會與CDK2結 合，並受到Cyclin B的調節；Cyclin A與Cyclin B會共同調控細胞的 有絲分裂[40]。
2. 有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，
MAPK)訊息傳遞路徑
當細胞受到生長因子(Growth factor)或細胞激素(cytokine)刺激 後，MAPKKK (MAP kinase kinase kinase)，如C-RAF、ASK-1、MEKK1&4，
會最先被活化；進而磷酸化MAPKK (MAP kinase kinase) ，如MEK1/2、
MKK3/6、MKK4/7；接著再進一步活化磷酸化MAPK(mitogen-activated protein kinase)，如ERK1/2、P38、JNK1/2。最後，細胞會透過MAPK 的被活化，刺激細胞增生(proliferation)、分化(differentiation)、
發炎反應(inflammation)以及凋亡作用(apoptosis)[41]。
圖2.2 MAPK 訊息路徑 3. FGF-2-MMPs 訊息路徑
FGF-2 為纖維母細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor)，經 由腦下垂體分泌出，分子量為 18kDa。FGF-2 在 in vivo 及 in vitro 中為有效的血管增生因子，並且刺激平滑肌細胞的生長，負傷治癒，
及組織修補。除此之外，更已經有文獻指出，在受損的神經組織中，
FGF-2 會大量表現，並促進神經修復的功能[42]。同時，在傷口瘀合 的過程中 UPA(Urokinase plasminogen activater)會活化基質金屬 蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)調控細胞外基質
(Extracellular matrix，ECM)的重建及參與傷口的復原及細胞的再 生(
43
)。除此之外，UPA 若同時活化了 MMPs，以及促進胞漿素原 (Plasminogen)轉換成胞漿素(Plasmin)時，這兩種細胞外基質的分解 蛋白會不斷進行降解作用，促使細胞的轉移功能增加[44]。而 FGF-2 的活化亦能促進 UPA 基因表現量增加，UPA 之專一性抑制蛋白 PAI-1 則會抑制 UPA 的蛋白活性[45]。
第 三 章 材 料 與 方 法 第一節 實驗材料
1.1 細胞培養
DMEM (Gibco，12100-046；USA)
DMEM；No phenol red (Sigma,D2902；USA) PBS (Gibco,21600-010；USA)
CCS (Cosmic Calf Serum；HyClone,DMK0096；USA) Sodium bicarbonate (Sigma,S-5761；NaHCO3 ；USA) Non-essential amino acid (HyClone,SH30238.01；USA) Antibiotic-Antimycotic (Gibco，15240-062；USA) Trypsin-EDTA(Gibco，25200-056；USA)
DMSO (Sigma,D2650；USA)
處理用藥
U0126=MEK inhibitor (Promega,V1121；USA) SB203580=p38 inhibitor (Promega,V1161；USA) SP600125=JNK inhibitor (BIOMOL, EI-305；USA)
1.2 MTT
Thiazolyl blue tetrazilium bromide (MTT)(Sigma,M5655；USA)
1.3 細胞 mRNA 萃取
UltraSpecTM RNA reagent (Biotecx,BL-10500；USA) Chloroform (Merck,1.02445.1000；Germany)
2-Propanol (Sigma,I-9516；USA)
Ethanol (Merk,1.00983.2500；Germany)
Diethyl pyrocabonate (DEPC；Sigma,D-5758；USA)
1.4 RT-PCR
M-MLV Reverse Transcriptase (Promega,M-170A；USA) M-MLV Reverse 5 × Buffer (Promega,M-531A；USA)
Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Promega,N-251B；
USA)
Deoxynucleotide Triphosphate (dNTPs) (Promega,U-1240；USA) Oligo–dT (明欣生物技術有限公司；台灣)
Taq (DNA polymerase；Finnzymes,F501L；Finland) 10 × PCR Buffer (Finnzymes,F511L；Finland)
1.5 DNA 電泳
Agarose (Amresco,0710；USA)
100 bp ET marker (Progema,G-2101；USA)
Ethidium bromide (EtBr；Progema,H-5041；USA) 5 × TBE solution (Amresco,J885；USA)
1.6 蛋白質定量
Lowry Protein assay
Na-K tartrate (Potassium Sodium Tartrate；(Sigma,P-0165；USA) CuSO4．5H2O（Copper[II] Sulfate Pentahydrate；和光,030-04425）
Na2CO3 （Sodium Carbonate；和光,199-01585；台灣）
NaOH （Sigma,S-5881）
Folin – Ciocalteu phenol reagent（合光,279-08895；台灣）
1.7
西方墨點(Western blotting)
A. Cell lysis buffer
Tris-base（USB,T8600；USA）
NaCl (Sigma,S-7653；USA)
EDTA (Sigma,E-5134；USA)
β-mercaptoethanol（Pharmacia Bioetch,17-1317-01；Sweden）
NP 40（Sigma,I-3021；USA）
Glycerol（Angus,07-52305；USA）
Protease inhibitor cocktail tablet(Roche,D68298；Switzerland）
B. Western blot buffer
40% Acrylamide / Bis Solution 29:1（MDBio,Inc.903039；USA）
Solution B
Tris-base(PH 8.8) (USB,T8600；USA）
Sodium dodecyl sulfate（SDS；Sigma,S-5761；USA）
Solution C
Tris-base(PH 6.8) (USB,T8600；USA）
Sodium dodecyl sulfate（SDS；Sigma,S-5761；USA）
Ammonium persulfate（APS；Amresco,0486-25G；USA）
TEMED（platinum Plus【CPG】,P-E90051）
Glycine（USB,G-8165；USA）
Glycerol（Angus,07-52305；USA）
Methanol（台灣聯工,940103）
Tween 20（Pharmacia Biotech,17-1316-01；USA）
Sodium chloride（NaCl；Sigma,S-7653；USA）
Ponceau S solution（Sigma,P-7170；USA）
Blocking buffer（安佳脫脂奶粉；Anchor New Zealand Milk）
Enhanced chemiluminescence(ECL) reagent（Santa Cruz Biotechnology,C2604；USA）
C.5x loading dye
Bromophenol Blue（Sigma, B-525；USA）
β-mercaptoethanol（Pharmacia Bioetch,17-1317-01；Sweden）
Sodium dodeccl sulfate（SDS；Sigma,S-5761；USA）
Glycerol（Angus,07-52305；USA）
P38 38 mouse SANTA CRUZ SC-535 P-P38 38 mouse SANTA CRUZ SC-7973
ERK 44 rabbit SANTA CRUZ SC-94 P-ERK 44 mouse SANTA CRUZ SC-7383 JNK1/2 49/54 mouse SANTA CRUZ SC-571
P-JNK 49/54 mouse SANTA CRUZ SC-6254 α-tubulin 57 mouse SANTA CRUZ SC-5286
表 3.1 抗體詳細資料
1.8 細胞移動實驗(Migration assay)
Boyden chamber
Polyvinyl-pyrrolidone-free polycarbonate membranes with 8μm pore(Neuro Probes,Inc.249447；USA）
Giemsa stain（Sigma, GS-500；USA）
1.9 蛋白分解酵素膠電泳法 (Gelatin Zymography Protease Assay)
Geletin （Sigma, G-9382；USA）
Triton X-100 (TEDIA,612026) Tris-HCl (USB,22676；USA）
NaN3 (Merck, 1.06688.0100 ；USA）
Coomassie blue R-250 (BIOLOGICAL, C.I.42660,USA)
第二節 : 實 驗 方 法 2.1 細胞培養
以含有 10％ 胎牛血清、1.5 g/l Sodium bicarbonate、0.1 mM Nonesseneial amino acid、0.1 mΜ Sodium pyruvate 及 1％ 抗生 素之 DMEM 培養液培養 RSC96 史旺神經膠細胞株。將 RSC96 培養於 37
℃，5% 二氧化碳的環境之下；每隔兩天更換一次培養液，並於細胞 生長至八分滿時，先以 PBS 清洗細胞兩次，再用 1％ Trypsin 將細 胞從培養皿上游離下來，取約 1/5~1/10 之細胞量至新的培養皿做繼 代培養。
2.2 冷凍保存細胞
以 10 公分培養皿培養細胞至八~九分滿，並在準備凍細胞的前一 天先換上新鮮的培養液。先用 PBS 清洗細胞兩次，並以 1％ Trypsin 將細胞從培養皿上游離下來，裝入 15 ml 離心管中；離心 800rpm、5 分鐘後吸掉上清液，再用 10％的 DMSO-DMEM 稀釋液回溶細胞並均勻 打散；最後各取 1ml 含有細胞的稀釋液至冷凍管中，置入-80℃冰箱
overnight，隔天放入液態氮桶中保存。若要解凍細胞，則將細 胞快速的從液態氮桶中取到 37℃水浴槽中回溫溶解；培養於 10 公分 培養皿，並在隔天更換新的培養液即可。
2.3 黃耆之萃取
本實驗所使用的中草藥黃耆皆冷凍乾燥完成之粉狀藥物，平常 保存在-80℃冰箱；要拿去作細胞加藥處裡前是先秤取所需的量再 到無菌操作台中，用滅菌過的二次水來稀釋成1.25 μg/ml，12.5 μg/ml，125μg/ml，250μg/ml，500μg/ml的濃度裝在1.5ml的 Eppendrof中;並以0.8μm 之 filter 過濾。為避免污染，稀釋好 的中草藥用Parafilm膜將Eppendrof的蓋子封好，可以放置-20℃
冰箱保存。
2.4 藥劑處理時間點
2.5 MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl- terazolium bromide,細胞存活測定)
將 Rsc96 神經膠細胞株培養在 24 孔盤中，加藥前先將細胞以沒 有酚紅及胎牛血清(FBS)的培養基培養 4 小時，使細胞飢餓；再分別 加入不同濃度的黃耆反應 24 小時。接著去掉培養基，用 PBS 清洗細 胞 2 次，加 1 ml 0.5mg/ml MTT(1x)；培養在 37℃，5％CO2 ，4hrs。
去掉 DMEM(不要吸到紫色物質)，加 Isopropanol 1 ml 搖 10 分鐘後，
取出放入 eppendorf 中，離心 1000rpm，4℃，5 分鐘；取 200λ到 96well 測 570nm 的吸光值。
2.6 傷口癒合實驗(Wound healing assay)
首先將細胞培養至 8 分滿。隔天，以黃色 tip 的尖頭從培養皿正 中央劃一條直線，然後以 PBS 清洗 3 次把漂浮的細胞清洗乾淨；隨 後換上不含酚紅的培養液(內含 1% Charcoal 處理過之 FBS) ，並將 細胞依實驗需要做不同試劑處理。於 37℃，5% 二氧化碳的環境之下 培養細胞 48 小時後以 PBS 清洗 3 次，最後再利用正相位差顯微鏡觀 查及照相。
2.7 細胞 mRNA 萃取
將加藥處理後的細胞，除去培養液，以 PBS buffer 洗滌 2 次，
加入 1ml UltraSpec (BIOTECX)，接著將細胞由培養皿刮下來，置 於 1.5ml 之離心管(Eppendrof tube)，並於冰上(4℃)靜置 5 分鐘，
而後加入 200μl 氯仿(Chloroform)並劇烈搖晃混合均勻後，於冰上 (Ethanol)清洗兩次，每次皆以 12000 rpm，4℃條件離心 5 分鐘。
最後使移除酒精之沈澱物自然乾燥(約 20~30 分鐘)後，加入 50μl 之滅菌 0.1% DEPC-H2O 溶解沈澱物，並於 55℃ Incubator 中反應 10 分鐘，接著於 4℃冰箱中貯存隔夜(Overnight)。最後測其吸光 值(OD260)以便換算所萃取之 RNA 濃度。
RNA 濃度(μg/ml)＝稀釋倍數 × OD260 × 40 (μg/ml)
2.8 反轉錄作用(Reverse Transcription ,RT)
取 2μg 之 RNA，加入適量之 0.1% DEPC-H2O 至體積為 25.75μl，
以 70 ℃ 處 理 5 分 鐘 後 ， 再 分 別 加 入 0.25μl RNase inhibitor (40U/μl)、10μl 5× RT buffer (Promega；50mM Tris-HCl、75mM KCl、
3mM MgCl2 及 10mM DTT)、4μl dNTP (Promega；10mM)及 5μl Oligo dT，
接著於溫度循環處理機 42℃執行 5 分鐘後，加入 5μl 40U reverse
transcriptase (1μl 200U reverse transcriptase ＋ 4μl 0.1%
DEPC-H2O)，並於 42℃反應一小時後，再以 99℃執行 5 分鐘，最後維 持於 4℃保存反轉錄所得之 cDNA 產物。
2.9 引子合成 (Primer Synthesis)
本實驗所需的引子(Primer)皆為生工公司製備，各組引子之條件 設定請參閱下述：
(a) sense primer of FGF -2(5,-GCATCACTTCGCTTCCCGCA-3,) antisense primer of FGF- 2 (5,-TCTGTCCAGGCCCCGTTTTG-3,) (b) sense primer of UPA(5,-GTGCAGGACTGCTCTCTCAG-3,)
antisense primer of UPA(5,-GAGGTCCTCCTGAATCTCCC-3,) (c) sense primer of PAI-I (5,-TGAGATCAGTACTGCGGACG-3,)
antisense primer of PAI-I(5,-GAGGGGCACATCTTTTTCAA-3,) (d) sense primer of Cyclin A (5,-GCAGAGTTCTGATGGAGAGA-3,) antisense primer of Cyclin A (5,-ACAGTCTTGCAGGTGACATC-3,) (e) sense primer of Cyclin B (5,-CTGCTGCAGGAGACCATGTA-3,) antisense primer of Cyclin B (5,-CTCCGTGTGGGACAGGTAGT-3,) (f) sense primer of Cyclin D (5,-AGGAGACCATTCCCCTGACT-3,)
antisense primer of Cyclin D (5,-TTCTTCCTCCACTTCCCCTT-3,) (g) sense primer of Cyclin E (5,-CTTACCTGAGAGATGAGCAC-3,)
antisense primer of Cyclin E (5,-CACCACTGATAACCTGAGAC-3,) (h) sense primer of GAPDH(5,-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3,)
antisense primer of GAPDH(5,-CCACAGTCTTCTGAGTGGCA-3,)
2.10 聚合酵素連鎖反應(polymerase Chain Reaction，PCR)
取 5μl cDNA 加入 11μl ddH2O、2.5μl forward primer、2.5 μl reverse primer、1μl dNTP (10 mM)、25μl 10 × PCR buffer (DyNA；10 Mm Tris- HCl、1.5 mM MgCl2、50 mM KCl 0.1% Triton X-100) 和 0,5μl DNA polymerase (DyNA；2U/μl)，混合均勻後，再將樣 品放回 PCR 機器中，以 94℃反應 5 分鐘之後，進入 PCR 循環：94℃
ㄧ分鐘、primer 煉合(annealing)溫度，30 秒、72℃，一分鐘。其中 循環次數依及煉合溫度則依 RNA 表現量及 primer Tm 値來決定，接著 再以 72℃反應 10 分鐘，最後以 4℃保存。
2.11 DNA 電泳
依照不同產物的片段大小分別配製 0.8、1.2、1.6 % DNA 電泳膠 片(agarose gel)。取 5 或 10μl PCR 產物加入 1 或 2μl 之 6 × DNA loading dye，混合均勻，再將其緩慢注入 DNA 電泳膠片之 well 中。
以 100 伏特強度之電壓進行約 35 分鐘電泳；最後以 Ethidium bromide (EtBr)作用於電泳膠片約 10~20 分鐘，利用 UV 光分析 PCR 產物其表 現情形為何。
2.12 細胞總蛋白萃取
細胞依實驗需求處理過後，倒掉培養液，用 PBS 清洗細胞 2~3 次；再加入適量(150~200μl/dish)的 lysis buffer (50mM PH7.5 Tris- base、0.5M NaCl、1 mM pH8 EDTA、1 Mm beta-mercaptoethanol、
1% NP40、1% Glycerol、protein kinase inhibitor 兩錠，溶於二 次水中，總體積 20ml)，以細胞刮棒收集細胞。收集的細胞置於冰上 反應 30 分鐘，每隔 5 分鐘震蕩一次，接著以 12000 rpm、4℃ 離心 20 分鐘，收取上清液即為細胞之總蛋白，可保存於-80℃。
2.13 蛋白質定量
萃取好的蛋白以二次水做適量稀釋(10 公分培養皿培養之細胞 以 200μl lysis buffer 收集的總蛋白約稀釋成 10~20 倍用以定量) 同時以 Bovine Serum Albumin(BSA)做出蛋白質標準曲線當作對照，
分別稀釋成 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml 的標準品。以相同體
積的標準品以及蛋白稀釋液，分別加入 250μl 之 Alkaline Copper reagent(2% Na-K tartrate、1% CuSO4．5H2O、2% Na2CO3 in 0.1N NaOH；
三者以 1：1：98 之比例混合)，室溫作用 10 分鐘，接著加入 25μl 之 Folin – Ciocalteu phenol reagent，室溫作用 30 分鐘，抽取 200μl 至 96 孔盤中，以 750 nm 波長測定吸光值，待測蛋白之數值 回歸到標準品所作出標準曲線，即可得知待測蛋白濃度。
2.14 西方墨點(Western blotting)
取樣品蛋白質 40~50 μg，再加入 5μl loading dye，並用 1 倍 的 PBS 將總體積補至 25μl；混合均勻後，將樣品蛋白以 99℃
denature 5 分鐘，將水氣 spin down 後，即可進行 SDS-PAGE 電泳分 析。SDS-PAGE 之上層膠為 4% 之 stacking gel，下層膠為 8%~15% (依 所預測定之蛋白質分子量大小決定) 之 separating gel。把
denature 過的樣品蛋白 loading 至上層膠的 U 型槽(well)中，以 running buffer 跑膠 75 伏特、兩個小時。待電泳結束即可進行轉漬 (transfer)，以 transfer holder 的白色部份為底部，逐一平鋪浸 濕之菜瓜布、Whatman 3M 濾紙、預先以甲醇浸泡的 PVDF 膜、下層膠 (separating gel)、Whatman 3M 濾紙、菜瓜布；要注意每層物質間 不能含有氣泡。將 transfer holder 固定後，即可置於
electrotransfer tank，並注入 transfer buffer，於 4℃下進行電 轉漬(transfer)100 伏特、90 分鐘。轉漬完成後，取出 PVDF 膜並加 入 blocking buffer 於室溫下搖動 1 小時；加入 1 級抗體(2μl/ml with blocking buffer)，於 4℃下反應 overnight；之後以 1 倍的 TBS buffer 清洗 PVDF 膜三次，每次 15 分鐘。而後加入 2 級抗體(2 μl/ml with TBS buffer)，並於室溫下反應 1 小時，再用 1 倍的 TBS buffer 清洗 PVDF 膜三次，每次 15 分鐘；最後以 ECL kit 進行冷光 呈色反應。