第二章 前人研究
四、 影響萵苣主莖褐化程度的因子
Hisaminato et al., 2001)。
Ke與Saltveit (1989) 指出萵苣內PPO活性並不受創傷影響，在萵苣中肋原本組 織內或創傷後組織內的PPO皆有很高的活性，約為PAL活性的100倍且作用快速，
因此創傷後生成之酚類皆足以被PPO氧化。
PPO主要以兩種狀態存在於細胞內，分別為游離態 (soluble form) 或於類囊體 膜上 (thylakoid membrane-bound)，於萵苣內以此兩種狀態存在之PPO的比例各占 一半，創傷後於5℃下貯藏七天後只有少部份轉變為游離態，因此PPO存在狀態與 創傷後褐化不具有相關性 (Cantos et al., 2001)。萵苣組織內約有57.5%-72%的PPO
以潛伏狀態 (latent form) 存在，於創傷後，細胞膜降解導致脂肪酸的釋放，並活化 潛伏狀態的PPO，因栽培種的不同，於5℃下約需3.7~6.3天可達到PPO最大活性，
同時間PPO總量並未增加，創傷後並未重新合成PPO，因此在創傷後PPO活性增加 之主要原因為部分潛伏狀態的PPO被活化，即使萵苣中肋於創傷後PPO活性會隨貯 藏期間增加，但品種間褐化程度與PPO活性並沒有相關性 (Mayer, 1986；Cantos et al., 2001)。Hisaminato等 (2001) 也指出萵苣中肋經創傷後三天，PO活性與外觀褐
化程度則無相關性，顯示PPO活性並非影響褐化程度的主要因素 (Cantos et al., 2001；Hisaminato et al., 2001)。
雖然PPO活性並非影響萵苣創傷後褐化程度的主要因素，但為造成褐化的必要 (López-Gálvez et al., 1996)。
2-Aminoindan-2-phosphonic acid (AIP) 為對PAL具有專一性的競爭型抑制劑，
並且對萵苣PAL也有相同的抑制效果，在4℃下以10 mM AIP溶液浸泡可抑制PAL活 性上升與組織內酚類含量上升，並且可以有效抑制萵苣中肋褐化，顯示控制創傷後
25
酚類生成為抑制褐化的關鍵因素(Hisaminato et al., 2001；Peiser et al., 1998)。
(三) 創傷後萵苣生成酚類種類
創傷後萵苣內 PAL 首先催化生成反式肉桂酸 (trans-cinnamic acid)，此為植物 生成最初之酚類，經過苯丙途徑 (phenylpropanoid pathway) 可生成其他同樣為 C6 -C3結構的 hydroxycinnamic acid，如: 阿魏酸 (ferulic acid)、芥子酸 (sinapic acid)、
咖啡酸 (caffeic acid)，於植物內通常與有機酸酯化或以糖苷 (glycoside) 形式存在，
形成 hydroxycinnamic acid derivatives，如：與奎寧酸 (quinic acid) 酯化形成的綠原 酸 (chlorogenic acid) 、與酒石酸 (tartaric acid) 酯化形成的卡夫塔酸 (caftaric acid) 與菊苣酸 (chicoric acid) ，另外也會與蛋白質或細胞壁結合，只有少部分會以自由 酸 (free acid) 的形式存在細胞 (Clifford, 2000)。
萵苣在創傷後生成的主要酚類為咖啡酸衍生物，雖然於結球萵苣葉內原本就 含一定量之類黃酮，但因含量相對較創傷生成之咖啡酸衍生物較少，對創傷引起的 褐化影響不大。結球萵苣葉內之類黃酮主要為榭皮素配醣體 (quercetin glycoside) 與木樨草素配醣體 (luteolin glycoside)，約含有 0.3 μg/g FW，創傷後含量會減少 (DuPont et al., 2000；Mai et al., 2013)。
(1) 與奎寧酸酯化之咖啡酸衍生物
綠原酸 (5-O-caffeoylquinic acid, chlorogenic acid) 於許多植物內皆生成，如:番 茄 (Solanum lycopersicum, tomato)、煙草 (Nicotiana tabacum, tobbaco)、蘋果 (Malus domestica, apple)、西洋梨 (Pyrus communis, pear)、咖啡 (Coffea arabica, coffee) 與
朝鮮薊 (Cynara scolymus L., artichoke)等等。綠原酸在各物種內的合成路徑不盡相 同，萵苣內是由 hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase (HQT) 利用 caffeoyl-CoA 與 quinic acid 生成綠原酸 (Hisaminato et al.,2001；Ricarda et al.,2004；Steck, 1968；Tomás-Barberán et al.,1997)。在萵苣內綠原酸具有其他同分
異構物 (圖 1)，如: neochlorogenic acid (3-O-caffeoylquinic acid)、kryptochlorogenic acid (4-O-caffeoylquinic acid) (Clifford, 2000)。兩個 caffeoyl-CoA 與奎寧酸酯化之咖 啡酸衍生物 (di-esters of caffeic acid))可生成異綠原酸 (3,5-dicaffeoylquinic acid, isochlorogenic acid) (Tomás-Barberán et al.,1997)。
(2) 與酒石酸化酯化之咖啡酸衍生物
菊苣酸 (dicaffeoyltartaric acid, chicoric acid)，為酒石酸 (tartaric acid) 與兩個 caffeoyl-CoA 酯化的咖啡酸衍生物，其生合成路徑由一個 caffeoyl-CoA 與酒石酸酯 化產生的 caffeoyltartaric acid，再接上一個 caffeoyl-CoA 即生成菊苣酸 (圖 1)。菊 苣酸與異綠原酸其結構較綠原酸複雜，生合成所需的催化步驟較多。
(3) 咖啡酸衍生物與 PPO 親和性
酚類為 PPO 主要作用的基質，但 PPO 對不同酚類的專一性會因栽培種而異，
例如：不同葡萄栽培種中的多酚氧化酶對咖啡酸 (caffeic acid)、綠原酸 (chlorogenic acid)、兒茶酚 (catechol) 、兒茶素 (d-catechin) 親和性不同 (Yoruk and Marshll, 織於創傷後三天，羅曼萵苣、結球萵苣、butter leaf 皆生成 caffeoyltataric acid、菊 苣酸(3,5-dicaffeoyltataric acid, chicoric acid)、綠原酸 (chlorogenic acid)、異綠原酸 (3,5-dicaffeoylquinic acid, isochlorogenic acid)。創傷後三天以結球萵苣生成的總酚 類量最低，其綠原酸含量增加 4.7 倍、異綠原酸增加 3.8 倍、菊苣酸增加 3 倍 (Tom
27 ás-Barberán et al., 1997)。
萵苣不同部位組織創傷後生成的酚類物質組成不同。於紅色葉用萵苣品種
‘lollo rosso’中，將葉部組織分為三個部分，分別為中肋組織、富含葉綠素的葉 基組織、富含花青素的葉尖組織，創傷後於 5℃下貯藏 14 天，中肋組織中酚酸含 量增加為兩倍，主要生成為異綠原酸 (isochlorogenic acid)，且其花青素含量也上 升；而其餘部位酚類含量則沒有顯著變化 (Ferreres et al., 1997)。
圖 1. 咖啡酸衍生物與類黃酮物質生合成途徑
Fig. 1. Biosynthesis pathway of caffeic acid derivative and flavonoids
29
氣調貯藏 (control atmosphere storage) 是調節氣體貯藏的簡稱，是指將貯藏環 境內的氣體組成調整至目標比例，使之異於正常大氣的組成。通常藉由添加或移除 特定氣體達到，以降低氧氣濃度或提高二氧化碳濃度來改變園產品原本的代謝速 率 (Kader, 2002)。若是利用包裝材料本身對氣體通透性與園產品呼吸速率達到動 態平衡，並在包裝內形成的特定氣體組成則稱為氣變包裝 (modified atmosphere packaging, MAP)。以氣變包裝使袋內的氧氣濃度維持氧於 0.2-0.5 kPa，可有效控制 截切萵苣褐化，並且不會產生不良風味 (Martinez-Sanchez et al., 2011)。
(二) 熱處理
熱處理為園產品於貯藏前，經過短時間的高溫處理，可分為溫湯、蒸熱及熱風 三種方法，多用於殺死檢疫害蟲或減輕寒害徵狀。植物經熱休克處理後會重新生成 熱休克蛋白 (heat shock protein)，而創傷後萵苣經熱處理後會優先生成熱休克蛋白，
使創傷誘導後的 PAL mRNA 無法被轉譯生成，因此熱處理也具有減輕褐化的效果 (Saltveit, 2000；Campos-Vargas et al.,2005)。
(三) 藥劑處理
常見的抗褐化藥劑種類包含抗氧化劑、有機酸、PPO 抑制劑及含鈣化合物。
抗褐化藥劑延緩褐化的效果可能是綜合的結果。抗氧化劑延緩褐化的機制主要是 將多酚氧化酶氧化產生的醌類再還原回雙酚結構，藉此減少醌類累積，因此當抗氧
化劑完全被氧化消耗後，酚類仍會被 PPO 氧化並導致褐化發生；也因此抗氧化劑 延緩褐化的效果會因園產品種類與抗氧化劑濃度不同而改變，常見的抗氧化劑為 抗壞血酸(ascorbic acid)、異抗壞血酸 (isoascorbic acid)、異抗壞血酸鈉 (sodium erythorbate)與含硫氫基化合物，而含硫氫基化合物除了具有還原力外，也具有抑制 褐化，並使截切產品維持其脆度與硬度 (Martinez and Whitaker, 1995)。
含硫氫基 (sulfhydryl group, -SH) 之化合物有半胱胺酸 (cysteine, Cys)、麩胱 甘肽 (glutathione)、半胱氨酸鹽酸鹽 (L-cysteine hydrochloride, CysH) 及乙醯半胱 胺酸 (N-acetyl-L-cysteine, NAC)，其延緩褐化的機制可能有三種：
(1) 硫氫基與醌類(O-quinone)反應生成無色或淺黃色物質 (Pierpoint,1966 ； Richard et al.,1991；Richard et al.,1992)，使醌類無法聚合導致褐化。
如： 綠原 酸經 PPO 氧化生成的醌類與 L-cysteine 反應後可生成 2-cysteinyl-chlorogenic acid (Cabezas-Serrano et al., 2013)。
(2) 本身或與醌類反應的生成物具有抑制 PPO 活性特性
L-cysteine 抑制 PPO 活性程度因濃度而異 (Valero et al., 1991；Ding et al., 1998)。在枇杷內的 PPO，以 1 mM L-cysteine 可抑制 87%的活性
(Ding et al., 1998)。另外，與醌類反應的生成物也可與 PPO 競爭活性部 位，作為 PPO 競爭型抑制物 (competitive inhibition)，並抑制 PPO 作 用，使酚類不被氧化成醌類 (Altunkaya and Gökmen, 2008)。
(3) 本身具還原力可將醌類還原回雙酚 (Martinez and Whitaker, 1995)。
31
含硫氫基化合物與醌類反應生成無色物質，避免醌類聚合產生褐化，因此當硫 氫基化合物被完全消耗後，氧化生成的醌類變會開始聚合並造成褐化，也因此特 性，含硫氫基化合物延緩褐化的效果會因園產品種類及施用濃度而異，另外含硫氫
基化合物延緩褐化的效果也會因PH 值改變 (Cabezas-Serrano et al., 2013；Molnar-Perl and Friedman, 1990)。
六、 結球萵苣內咖啡酸衍生物質測定 肋內存在 caffeoyl-CoA 與奎尼酸(quinic acid) 酯化形成的 3-caffeoylquinic acid (neochlorogenic acid)、4-caffeoylquinic acid (kryptochlorogenic acid)、5-caffeoylquinic acid (chlorogenic acid) 、 3,4-dicaffeoylquinic acid 、 3,5-dicaffeoylquinic acid (isochlorogenic acid)、4,5-dicaffeoylquinic acid，以及 caffeoyl-CoA 與酒石酸酯化形 成的 caffeoyltartaric acid、dicaffeoyltartaric acid，但其主要成份為 caffeoyltartaric acid、
綠原酸(chlorogenic acid)、異綠原酸 (isochlorogenic acid) 、菊苣酸 (chicoric acid)，
結球萵苣中肋於 5℃下貯藏三天後，綠原酸含量為 15 μg․g-1 FW 增加了 4.8 倍、
異綠原酸含量約為 4 μg․g-1 FW 增加了 3.8 倍、菊苣酸含量約為 10 μg․g-1 FW 增 加了 3 倍，而 caffeoyltartaric acid 含量則增加了 30%。
Hisaminato 等 (2001) 以兩倍重甲醇與組織均質，震盪 10 分鐘後過濾，濾液
進行減壓濃縮，濃縮後加入乙酸乙酯萃取，再進行減壓濃縮，以甲醇回溶後用 Sep-pak C18 層析純化，再經 0.45 μm 濾膜過濾得到樣品進行 HPLC 分離。HPLC 分 析條件為為氰甲烷有機相與水相添加 5%醋酸進行梯度分離，於波長 320 nn 下吸 光，顯示含有主要成份為 caffeoyltartaric acid、綠原酸 (chlorogenic acid) 、異綠原 酸 (isochlorogenic acid) 、菊苣酸 (chicoric acid)，經綠原酸標準曲線換算後濃度總 和，萵苣中肋內總酚類含量第 0 天含量約為 10μg․g-1 FW，於 4℃下貯藏三天後總 酚類含量開始上升，第八天含量約為 35μg․g-1 FW，總量增加為 3.5 倍。
兩者分析方法主要相差在於樣品前處理純化步驟與分離使用之流動相不同，
以氰甲烷與水或甲醇與水進行梯度分離後，顯示萵苣中肋創傷後主要生成的酚類 物質為咖啡酸衍生物，包含綠原酸、異綠原酸、菊苣酸。
33
2. Aluminum Chloride: Sigma。
3. Chlorogenic acid (綠原酸) : Aldrich。
4. Chicoric acid (菊苣酸) : Aldrich。
5. N-acetyl-L-cysteine：Merck。
6. L-cysteine hydrochloride：Merck。
7. Formic acid (甲酸): Sigma-Aldrich。
8. Gallic acid (沒食子酸) : Sigma。
9. Methanol: HPLC grade 及 ACS 試藥級, Macron。
10. Rutin hydrates: Sigma。
11. Sodium dihydrogen phosphate dodecahydrate:
(三) 試驗儀器:
1. 色差儀：德國，Dr LANGE，LMG-160。
2. 切片機：美國，Chef's Choice，Electric food slicer 610。
3. 電子天平：瑞士，Mettler Toledo，AB104-S/FACT。
4. 分光光度計：日本，SHIMADZU，UV-1800。
5. 分光光度計紀錄軟體：日本，SHIMADZU，UVProbe Version 2.42。
6. -20°C 凍箱：美國，Kenmore Model-31205。
7. -80°C 凍箱：日本，Sanyo。
8. 超高速冷凍離心機：日本，HITACHI，CR21GⅢ。
9. 高效能液態層析系統：Intelligent HPLC system LC-800 series，Jasco。
整套系統組成包含六個部分：
0.45μm，diameter：47mm)。
11. 脫氣用濾紙 (樣品)：美國，PALL，PTFE membrane (pore size：0.45μm，
diameter：13mm)。 (acetic acid, AcA)、N-乙醯-L-半胱胺酸 (N-acetyl cysteine, NAC)、半胱胺酸鹽酸鹽 (L-cysteine hydrochloride, CysH) ，浸泡五分鐘後取出切片並吸去表面殘餘溶液。將
35
試驗方法參考 Campos-Vargas 和 Saltveit (2002) 之酚類萃取方法，以組織重 量比甲醇體積 1:2 萃取 (w/v)。取 3 克冷凍萵苣主莖切片組織於研缽內經液態氮 研磨至粉狀，將組織粉末置於 50 ml 離心管內，再加入 6 ml 甲醇均勻混和，經 10 分鐘超音波震盪萃取後，以 15000 g 離心 25 分鐘，取上清液至 15 ml 離心管，再 次離心取上清液，置於-20℃下待接續測定。
(二) 總酚類含量測定
試驗方法參考 Loaiza-Velarde 等(1997)、Campos-Vargas 和 Saltveit (2002)之 萵苣組織萃取液內總酚類測定，測定萃取液於波長 320nm 下吸光值。將萃取液以 甲醇等體積稀釋一倍後，以分光光度計測量萃取液於波長 320nm 下吸光值。萃取 液於波長 320 nm 下的吸光值經由綠原酸標準曲線換算為含量，結果以 equivalent chlorogenic acid μg/g FW 表示。
(三) 以 HPLC 分析主要酚類含量變化 1. 萃取液前處理
萃取液於 40℃水浴恆溫震盪機內，減壓濃縮 50 分鐘後以 0.5 ml 甲醇回溶，
經0.45 μm 濾膜過濾得到樣品進行 HPLC 分析。
2. HPLC 分析條件
試驗方法修改自 Tomas-Barberan 等(1997)之分離方法，管柱溫度維持於 40
試驗方法修改自 Tomas-Barberan 等(1997)之分離方法，管柱溫度維持於 40