已有研究指出 (洪，2014)，以各種延緩褐化藥劑處理未含維管束的結球萵苣 主莖圓片，其可有效延緩創傷後主莖圓片切面褐化所需的濃度與藥劑浸泡處理所 需的時間。創傷後主莖圓片，經 1.5%及 3%之醋酸溶液浸泡處理 5 分鐘後，貯藏 於 5℃下有延緩褐化之效果，並可維持正常色澤達 10 天。而經具有硫氫基 (sulfhydryl group, -SH) 的半胱胺酸(cysteine)衍生物藥劑處理結果顯示，以 2% CySH 浸泡五分鐘後可延緩圓片褐化，但會產生黃綠色外觀。以 3% NAC 浸泡五分鐘可
49 持不變，與前人結果相符 (洪, 2014；Tomás-Barberán et al.,1997)，雖然使用的材料 為具有維管束的主莖圓片，3%醋酸處理仍可有效延緩褐化。
創傷後主莖切片經 3%醋酸處理後，其總酚類含量並未於 8 天貯藏期間內上 升，且其外觀可維持白色色澤至第八天，顯示若創傷後組織內酚類含量降低，使得 PPO 可氧化的基質減少，即可以有效地延緩褐化。Tomás-Barberán 等人 (1997)指 出醋酸可降低萵苣莖部切片內 PAL 活性，即使將 PAL 回復至適合的環境仍不具活
後可維持圓片呈現白色色澤至第八天，而以 2%處理後圓片則會逐漸轉變為黃綠色。
51
三、CySH 處理對創傷萵苣主莖切片中酚類代謝之影響
半胱氨酸鹽酸鹽 (L-cysteine hydrochloride, CysH)與 NAC 同為半胱胺酸衍生 物，分子結構具有硫氫基，以不同濃度處理主莖圓片後其延緩褐化效果不同。洪 (2014)以 2% CySH 浸泡五分鐘後可延緩圓片褐化，但會產生黃綠色外觀。本試驗 採用濃度 2%與 3%的 CySH 溶液浸泡主莖切片五分鐘。
(一) 外觀變化與總酚類物質含量變化
主莖切片經 2%半胱胺酸鹽酸鹽 (L-cysteine hydrochloride, CysH)處理後圓片於 第 6 天維管束開始轉變為黃色，於第八天維管束與切面呈現黃色；經 3% CySH 處
含量則比 2%處理組再晚兩天上升，含量約上升 2.3 倍。
53
啡酸衍生物含量受到延緩的效果相近，且兩者生成的類黃酮含量也相近，並且高於
55
總酚類含量與總咖啡酸含量變化趨勢在 2% NAC 處理以及 3% CySH 處理組 中開始上升的時間點相同；但於 3%NAC 以及 2%CySH 處理中，總酚類含量與總 咖啡酸含量上升時間點則不一致，且此兩組產生的總類黃酮含量較高，推測總酚類 含量與延緩褐化效果的相關性降低的原因可能為受到類黃酮或其餘物質干擾。因 此，主莖切片經不同硫氫基化合物處理後延緩外觀褐化之效果，與其延緩總咖啡酸 衍生物含量上升之效果較相關。
綜合主莖切片之總咖啡酸衍生物含量與總類黃酮含量變化可以比較不同硫氫 基化合物處理延緩褐化的效果高低。延緩褐化效果較不佳的 2% NAC 處理組，其 總咖啡酸衍生物含量晚對照組兩天開始上升，因此褐化程度較對照組低。主莖切片 經 3% NAC 或 2% CySH 處理後，皆於第六天外觀出現褐化徵狀，其中以 2% CySH 處理後的維管束褐化較明顯；3% NAC 處理組其總咖啡酸衍生物含量於第六天後 開始上升，2% CySH 組處理則是於第四天後開始，且在第六天的 2% CySH 處理組 其總類黃酮含量高於 3% NAC 處理組，因而造成其減緩褐化效果較 3% NAC 差。
而以 3% CySH 處理組延緩效果最佳，於創傷第六天後其總咖啡酸衍生物與總類黃 酮含量才開始上升，因此其延緩褐化效果為最佳。
CySH 與 NAC 處理效果會因咖啡酸衍生物種類而異，兩種處理主要的差異為 延緩綠原酸與菊苣酸含量上升。兩種濃度下的 CySH 處理皆可以有效延緩菊苣酸 含量上升，且在濃度 2%下，CySH 延緩綠原酸含量上升的效果較 NAC 處理佳。綜 合以上顯示以 CySH 處理延緩萵苣主莖切片褐化的效果優於 NAC 處理的原因為其 延緩菊苣酸與綠原酸含量上升的效果較佳，且於濃度 3%下可延緩類黃酮含量開始 上升的時間。
57
圖 2. 不同褐化抑制溶液處理之主莖圓片在 5°C 下貯藏 8 天期間外觀之變化。
Fig. 2. The appearance of stem disk treated with different browning inhibitor changed during 8 days storage at 5°C.
圖 3. 創傷後於 5°C 下貯藏第四天之萵苣主莖切片萃取液經 HPLC 分離後偵測波長 320 nm 下所得層析圖。(A.為主莖萃取液；B.為標準品綠原酸與菊苣酸)
Fig. 3. HPLC chromatogram of extracts of the wounded lettuce stem disk storaged for 4 days at 5°C. (A：the extracts of the wounded lettuce stem disk；B：chlorogenic acid standard and chicoric acid standard)
column: Dikama InspireTM C18 (5 μm, 12 nm，150 x 4.6 nm) mobile phase A: water added with 5% formic acid (v/v)
mobile phase B: methanol added with 5% formic acid (v/v) flow rate: 1 ml/min
gradient: 90% A 72% A (at 18min) 65% A (at 32min) 43% A (at 54min) volume of injection: 50 μl
temperature: 40°C
detector: UV detector at 320 nm
59
圖 4. 創傷後於 5°C 下貯藏第八天之萵苣主莖切片萃取液經 HPLC 分離後偵測波長 320 nm 下所得之層析圖與文獻層析圖比較。(A.為創傷後主莖切片萃取液；B.為文 獻中創傷後萵苣中肋萃取液；C.為文獻中創傷後萵苣中肋萃取液內相對應之酚類物 質(modified from Tomás-Barberán et al., 1997)
Fig. 4. The comparison between the HPLC chromatogram of the extracts of the wounded lettuce stem disk storaged for 8 days at 5°C and the previously reported chromatogram of the extracts of the wounded midrib. (A：the extracts of the wounded lettuce stem disk；
B：the previously reported chromatogram of wounded lettuce midrib extracts, modified from Tomás-Barberán et al., 1997 ；C：the corresponded compounds of previously reported chromatogram of wounded lettuce midrib, modified from Tomás-Barberán et al., 1997)
61
圖 5. 創傷後第八天萵苣主莖切片萃取液經不同 HPLC 梯度分離後之層析圖。(A.
為以 1.2% min-1等梯度進行分離；B.為以修正後梯度進行分離)
Fig. 5. HPLC chromatogram of the extracts of the wounded lettuce stem disk storaged for 8 days at 5°C with different separation gradient. (A：with gradient 1.2% min-1；B：
with gradient 1% min-1 followed by 0.5 % min-1 between signal of chicoric acid and isochlorogenic acid.)
A: 起始條件 10%甲醇相經 40 分鐘等梯度升至 58%甲醇相，以 1.2% min-1上升
B: 起始條件 10%甲醇相以 1%min-1上升 18 分鐘，再以 0.5% min-1上升 14 分鐘，
最後以 1% min-1上升 22 分鐘。
圖 6. 添加綠原酸與菊苣酸標準品於創傷後第四天之對照組主莖切片萃取液，經 HPLC 分離後所得之層析圖。(A.為 40 μg/ml 綠原酸標準品與 20 μg/ml 菊苣酸標準 品；B.為創傷後第四天之對照組主莖切片萃取液；C.為以標準品體積:樣品體積 (1:1) 添加後之混合溶液)
Fig. 6. HPLC chromatogram of the standard addition to the extracts of the 4-days-wounded control stem disk sample. (A: standards of 40 μg/ml chlorogenic acid and 20 μg/ml chicoric acid；B: the extracts of 4-days-wounded control stem disk；C: the mixture after 1:1(v/v) standard addition)
column: Dikama InspireTM C18 (5 μm, 12 nm，150 x 4.6 nm) mobile phase A: water added with 5% formic acid (v/v)
mobile phase B: methanol added with 5% formic acid (v/v) flow rate: 1 ml/min
gradient: 90% A 72% A (at 18min) 65% A (at 32min) 43% A (at 54min) volume of injection: 50 μl
temperature: 40°C detector: UV detector at 320 nm
63
圖 7. 添加綠原酸與菊苣酸標準品於創傷後第八天 3%CySH 處理組主莖切片之萃 取液中，經 HPLC 分離後所得之層析圖。(A.為 40 μg/ml 綠原酸標準品與 20 μg/ml 菊苣酸標準品；B.為創傷後第八天 3%CySH 處理組之主莖切片萃取液；C.為以標 準品體積:樣品體積 (1:1) 添加後之混合溶液)
Fig. 7. HPLC chromatogram of the standard addition to the extracts of 8-days-3%CySH treated stem disk. (A: standards of 40 μg/ml chlorogenic acid and 20 μg/ml chicoric acid；
B: the extracts of 8-days-3%CySH treated stem disk；C: the mixture after 1:1(v/v) standard addition)
column: Dikama InspireTM C18 (5 μm, 12 nm，150 x 4.6 nm) mobile phase A: water added with 5% formic acid (v/v)
mobile phase B: methanol added with 5% formic acid (v/v) flow rate: 1 ml/min
gradient: 90% A 72% A (at 18min) 65% A (at 32min) 43% A (at 54min) volume of injection: 50 μl
temperature: 40°C detector: UV detector at 320 nm
圖 8. 添加綠原酸與菊苣酸標準品於創傷後第八天 3%NAC 處理組主莖切片之萃取 液中，經 HPLC 分離後所得之層析圖。(A.為 40 μg/ml 綠原酸標準品與 20 μg/ml 菊 苣酸標準品；B.為創傷後第八天 3%NAC 處理組之主莖切片萃取液；C.為以標準品 體積:樣品體積 (1:1) 添加後之混合溶液)
Fig. 8. HPLC chromatogram of the standard addition to the extracts of 8-days-3%NAC treated stem disk. (A: standards of 40 μg/ml chlorogenic acid and 20 μg/ml chicoric acid；
B: the extracts of 8-days-3%NAC treated stem disk；C: the mixture after 1:1(v/v) standard addition)
column: Dikama InspireTM C18 (5 μm, 12 nm，150 x 4.6 nm) mobile phase A: water added with 5% formic acid (v/v)
mobile phase B: methanol added with 5% formic acid (v/v) flow rate: 1 ml/min
gradient: 90% A 72% A (at 18min) 65% A (at 32min) 43% A (at 54min) volume of injection: 50 μl
temperature: 40°C detector: UV detector at 320 nm
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表 1. 高效能液相層析*內綠原酸與菊苣酸標準品之標準曲線的迴歸方程式 Table 1. Standard curve of standard chlorogenic acid and chicoric acid in HPLC.
標準品
Table 2. Quantification error of standard addition
Chlorogenic acid Chicoric acid
CK 5.0% 7.2%
CySH 3.5% 2.8%
NAC 6.4% 11.0%
column: Dikama InspireTM C18 (5 μm, 12 nm，150 x 4.6 nm) mobile phase A: water added with 5% formic acid (v/v)
mobile phase B: methanol added with 5% formic acid (v/v) flow rate: 1 ml/min
gradient: 90% A 72% A (at 18min) 65% A (at 32min) 43% A (at 54min) volume of injection: 50 μl
temperature: 40°C
detector: UV detector at 320 nm
圖 9. 綠原酸、菊苣酸與類黃酮標準品經結球萵苣葉片內多酚氧化酶氧化後褐化過 程外觀之變化，由上而下分別為經過 0、3、10、25、55 分鐘。
Fig. 9. Browning progress of chlorogenic acid, chicoric acid standard solution incubated with polyphenol oxidase for 0,3,10,25,55 min.
(A) Polyphenoloxidase(PPO) in phosphate buffer，PH 6.8 (B) 60 μg/ml Chlorogenic acid and PPO
(C) 60 μg/ml Chicoric acid and PPO (D) 20 μg/ml Chlorogenic acid and PPO (E) 20 μg/ml Chicoric acid and PPO
(F) 20 μg/ml Chlorogenic acid 、20 μg/ml Rutin hydrate and PPO (G) 20 μg/ml Chicoric acid、20 μg/ml Rutin hydrate and PPO (H) 30 μg/ml Chlorogenic acid、30 μg/ml Chicoric acid and PPO (I) 20 μg/ml Rutin hydrate
(J) 20 μg/ml Rutin hydrate and PPO
67 (A)
(B)
圖 10. 不同濃度之綠原酸、菊苣酸與芸香苷標準品經結球萵苣葉片多酚氧化酶於 植物體外氧化後 40 分鐘之 (A) 溶液外觀 (B) 標準品溶液氧化後顏色值。
Fig. 10. Different concentration of chlorogenic acid, chicoric acid and rutin hydrate standard solution incubated with polyphenol oxidase from lettuce leaf tissue for 40 minutes (A) appearance of PPO oxidized standard solution (B) L a* b* value of PPO oxidized standard solution.
圖 11. 標準品於波長 200-600 nm 間連續吸收光譜。(a 為 20 μg/ml 菊苣酸；b 為 20 μg/ml 綠原酸；c 為 10 μg/ml 咖啡酸)
Fig. 11. Absorption spectra of standard solution between wavelength 200-600 nm. (a:
Chicoric acid, 20 μg/ml；b: Chlorogenic acid, 20 μg/ml；c: Caffeic acid, 10 μg/ml)
69
圖 12. 綠原酸標準品 (20 μg/ml) 經萵苣主莖 PPO (30 U/ml) 氧化過程每隔五分鐘 紀錄之吸收光譜變化，(右上)為波長 370-450 nm 間放大。
Fig. 12. Absorption spectra of chlorogenic acid (20 μg/ml) incubated with polyphenol oxidase (30 U/ml) at every five mintues incubation times, (right) the zoom in the spectra between wavelength 370-450 nm.
圖 13. 菊苣酸標準品 (20 μg/ml) 經萵苣主莖 PPO (30 U/ml) 氧化過程每隔五分鐘 紀錄之吸收光譜變化，(右上)為波長 370-450 nm 間放大。
Fig 13. Absorption spectra of chicoric acid (20 μg/ml) incubated with polyphenol oxidase (30 U/ml) at every five mintues incubation times (right) the zoom in the spectra between wavelength 370-450 nm.
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圖 14. 標準品溶液經萵苣葉片 PPO 氧化過程，於反應後 0、15、90、180、300、
600、900、1200、1800 秒紀錄波長 270-450 nm 間之吸收光譜。(A.為 20 μg/ml 綠原 酸；B.為 20 μg/ml 菊苣酸；C.為 30 μg/ml 綠原酸與 30 μg/ml 菊苣酸之混合溶液)。
Fig. 14. Absorption spectra of standard solution incubated with polyphenol oxidase recorded at 0、15、90、180、300、600、900、1200、1800 seconds after oxidation between wavelength 370-450 nm. (A: 20 μg/ml chlorogenic acid；B: 20 μg/ml chicoric acid；C:
mixture of 30 μg/ml chlorogenic acid and 30 μg/ml chicoric acid standard solution)
圖 15. 標準品溶液經萵苣葉片 PPO 氧化過程，於反應後 0、15、90、180、300、
秒於 (A)波長 320 nm 與 (B) 410 nm 下吸光值變化。
(CHL20: 20 μg/ml 綠原酸標準品溶液； CHI60: 60 μg/ml 菊苣酸標準品溶液；
CHL30+CHI30: 30 μg/ml 綠原酸與 30 μg/ml 菊苣酸混合標準品溶液)
Fig. 15. Monitoring absorbance at (A) 320 and (B) 410 nm recorded at 0、15、90、180、
300 seconds after standard solution incubated with polyphenol oxidase.
(CHL20: 20 μg/ml chlorogenic acid；CHI60: 60 μg/ml chicoric acid；CHL30+CHI30:
mixture of 30 μg/ml chlorogenic acid and 30 μg/ml chicoric acid)
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圖 16. 標準品溶液經萵苣葉片 PPO 氧化過程，於反應後 0、15、90、180、300、
600、900、1200、1800 秒紀錄波長 270-450 nm 間之吸收光譜。(A.為 20 μg/ml 芸香 苷；B.為 20 μg/ml 綠原酸與 20 μg/ml 芸香苷之混合溶液；C. 為 20 μg/ml 綠原酸與 40 μg/ml 芸香苷之混合溶液)
Fig. 14. Absorption spectra of standard solution incubated with polyphenol oxidase recorded at 0、15、90、180、300、600、900、1200、1800 seconds after oxidation between wavelength 370-450 nm. (A: 20 μg/ml rutin hydrate；B: mixture of 20 μg/ml chlorogenic acid and 20 μg/ml rutin hydrate；C: mixture of 20 μg/ml chlorogenic acid and 40 μg/ml rutin hydrate)
圖 17. 標準品溶液經萵苣葉片 PPO 氧化過程，於反應後 0、15、90、180、300、
秒於波長(A) 320 nm、(B) 410 nm、(C) 357 nm 下吸光值變化。
(RU20: 20 μg/ml 芸香 苷標準 品溶 液 ；CHL20: 20 μg/ml 綠原 酸標準 品溶液；
RU20+CHL20: 20 μg/ml 芸香苷與 20 μg/ml 綠原酸之混合標準溶液)
Fig. 17. Monitoring absorbance at (A) 320, (B) 410 nm, (C) 357nm recorded at 0、15、
90、180、300 seconds after standard solution incubated with polyphenol oxidase.
(RU20: 20 μg/ml rutin hydrate；CHL20: 20 μg/ml chlorogenic acid；RU20+CHL20:
mixture of 20 μg/ml rutin hydrate and 20 μg/ml chlorogenic acid)
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圖 18. 創傷後萵苣主莖圓片於 5°C 下貯藏 8 天期間 a*值與 b*值變化。
Fig. 18. The change in a* and b* value of control stem disk during 8 days storage at 5°C.
圖 19. 創傷後萵苣主莖圓片於 5°C 下貯藏 8 天期間總酚類含量變化。
Fig19. Change in total phenolics content of wounded lettuce stem disk during 8 days
Fig19. Change in total phenolics content of wounded lettuce stem disk during 8 days