第二章 文獻回顧
2.5 樣品與抗糖尿病藥物
2.5.2 愛妥糖
愛妥糖(ACTOS)為口服抗糖尿病藥物，主要作用為降低 insulin resistance，主 治第 2 型糖尿病，其功效成分為 pioglitazone hydrochloride 能改善肌肉及脂肪組 織的 insulin sensitivity，且抑制肝臟 gluconeogenesis，同時能降低血中的 insulin 濃度。
(一)Pioglitazone hydrochloride 的理化特性
Pioglitazone hydrochloride 為白色結晶狀粉末，分子式 C19H20N2O3SHC1、分 子量 392.9，可溶於 N,N-dimethyl-formamide，微溶於無水酒精，極易溶於 acetone 及 acetonitrile，不溶於水、乙醚。
(二)Pioglitazone hydrochloride 的藥理機轉
Pioglitazone hydrochloride 是 thiazolidinedione 類的糖尿病用藥，需要有胰島 素存在下才能發揮功效，其可降低周邊組織與肝臟的 insilin resistance 現象，增 加依賴胰島素的葡萄糖利用，且降低肝醣(glycogen)含量。但不同於磺基尿素藥 物，此藥不會促進 insulin 分泌，其為 PPARγ 的強力高選擇性作用劑，PPAR 的 受器存在於許多胰島素敏感性組織如:肝、肌肉、脂肪。故活化 PPARγ 細胞核受 器可調控數種受 Insulin 作用影響葡萄糖代謝及脂質代謝的基因轉錄作用。
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於動物實驗模式下，pioglitazone 能降低第 2 型糖尿病的 hyperglycemia、高 胰島素血症(hyperinsulinemia)及高三酸甘油脂血症 (hypertriglyceridemia)等胰島 素阻抗症狀(http://www.takeda.com.tw/products_actos.html)。
37 第三章 實驗架構
雄性 Wistar 大鼠
Normal 組
實驗組 (高果糖飼料誘導)
高 果糖誘導
高 果糖誘導
TZD 組 30mg/kg B.W.
GA 組
高劑量組:30mg/kg 低劑量組:10mg/kg
口服葡萄糖 耐受性試驗
西方墨點法 PI3K Pathway
Glycolysis De novo lipogenesis
Lipolysis HF 組
去離子水
38 第四章 材料與方法
4.1 實驗材料 4.1.1 實驗樣品來源
Gallic acid (Sigma, St. Louis, MO, USA)
Pioglitazone Hydrochloride(台灣武田藥品工業股份有限公司)
4.1.2 實驗動物
雄性 Wistar 大鼠，購自樂斯科生物科技中心，購入週齡為 6 週。
4.1.3 動物飼料
大鼠飼料 (Rodent Chow diet)，其組成份為 23% Crude protein、4.5% Crude fat、
6.0% Crude fiber、8.0% Ash、2.5% Minerals、56% Carbohydrate。
4.1.4 實驗藥品與試劑 4.1.4.1 化學藥品
Bio-Rad Laboratories (Richmond, VA, USA)：
Ammonium persulfate (APS)
N,N,N,N-Tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)
Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)：
RIPA buffer (10X)
J.T.Baker (Phillipsburg):
Sodium dodecylsulfate (SDS) Sodium chloride (NaCl)
39 Merck KgaA (Darmstadt , Germany)：
Tween-20
Millipore(Billerica, MA, USA) Anti-Acetyl-CoA Carboxylase-1
Anti-phospho-Acetyl-CoA Carboxylase-1(Ser79)
Sigma (St. Louis, MO, USA)：
Bovine serum albumin (BSA) bromophenol blue
glycerol molecular biology reagent 2-mercaptoethanol (2-ME)
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 Skim milk powder
PerkinElmer(Boston, MA, USA)：
Transfer Membrane Western Lightning Thermo
Albumin Standard
4.1.4.2 酵素套組
Bio-Rad Laboratories (Richmond, VA, USA)：
40 Bio-Rad protein assay dye reagent
Mercodia(Uppsala, Sweden) Rat Insulin ELISA Kits
RANDOX
glucose(GLUC-PAP)
4.1.4.3 抗體
Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)：
ATGL antibody
Insulin Receptor β (L55B10) Mouse mAb Gene Tex (Irvine, CA, USA)：
alpha Tubuin 4a antibody Actin antibody
Fatty Acid Synthase antibody [N1], N-term GLUT4 antibody [EP(2)AY], C-term PFKL antibody
PKC zeta antibody
Pyruvate Kinase (liver/RBC) antibody Mouse IgG antibody (HRP)
Rabbit IgG antibody (HRP) 4.1.4.4 儀器設備
迴轉式震盪器 ORBITAL SHAKER(TS-500, 祥泰，台北，台灣)
純水製造機(Milli-Q ultrapure water system) (Millipore, Bedford, MA, USA)
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高速離心機(Centrifugator)(Sorvall RC 5C, DuPONT, CT, USA) 桌上型離心機(Centrifugator)(KUBOTA5100,Tokyo,Japan) 免疫酵素分析儀(Precision microplate reader)
(Bio tek,Epoch,Thermo Fisher Scientific Inc.,Vermont, USA) 天秤 Balance(HR-200, A＆D,USA)
冷凍離心機(Universal 30RF, Hettich, German)
低溫冷凍櫃-20℃ refrigerator(CH-401，進信，台灣)
震盪混合器 Vortex mixer(G-560, Scientific industries, Inc.,Bohemia, NY, USA) 酸鹼測定機 Hanna instruments(HI9017, Italy)
4.2 實驗方法 4.2.1 動物飼養
自樂斯科生物科技中心購入 6 週齡的 Wistar 大鼠，飼養於國立台灣大學食 品科技研究所動物房，溫度維持 25℃，light-dark cycle 維持 12 小時光照，12 小 時黑暗，供給飲水及飼料，讓老鼠自由攝食，每週記錄體重變化，於第 17 週犧 牲。
4.2.2 動物分組與誘導
適應兩週後的雄性 Wistar 大鼠 40 隻，給予 66％的高果糖飼料誘導 8 週後，
進行口服葡萄糖耐受性試驗，再依血糖濃度及體重分為 5 組：
正常組：不誘導高血糖，管餵去離子水。
控制組：有誘導高血糖，管餵去離子水。
實驗組(共三組)：有誘導高血糖，管餵 Pioglitazone hydrochloride 及不同濃度 Gallic acid。
42 4.2.3 樣品餵食劑量
Pioglitazone hydrochloride 組(Pio30)：溶液濃度為 30 mg/mL，餵食量為 30 mg/kg B.W.
Gallic acid 高劑量組(GA30)：溶液濃度為 30 mg/mL，餵食量為 30 mg/kg B.W.
Gallic acid 低劑量組(GA10)：溶液濃度為 30 mg/mL，餵食量為 10 mg/kg B.W.
4.2.4 口服葡萄糖耐受性試驗
5 組大鼠經 12 小時禁食後，先採取空腹血糖，再管餵 1.5 g/mL/kg B.W.的葡 萄糖水，之後分別於 30、60、90、120 分鐘(含 0 分鐘共 5 個時間點)，使用斷尾 方法各採血一次，採後將血液於 4℃下離心 3000 rpm、20 min，取上清液分析葡 萄糖濃度。
4.2.5 血液的收集與處理
將全血置於含 15 mL 離心管，將血液於 4℃下離心(3000 rpm、20 min)，取 上清液分析。
4.2.6 臟器的採集
大鼠犧牲時，採集腹週脂肪及副睪脂肪，秤重後冰-20℃。
4.2.7 血漿葡萄糖濃度測定
取血漿 10 uL 與葡萄糖 Enzymatic kits(Audit Diagnostics)試劑 1mL 混合均 勻，於 37℃水浴 10 分鐘，利用分光光度計測定 500 nm 波長下吸光值，換算葡 萄糖含量。測定原理為 glucose 經由 glucose oxidese 作用，氧化成 gluconic acid 及 H2O2再經由 peroxidase 轉換 phenol 及 4-aminoantipyrine 成為 red quinine，在 500 nm 波長下測定 red quinine 含量。
43 4.2.8 血漿胰島素濃度測定
取 25 uL 血漿及 50 uL Enzyme conjugate ，在室溫下以 70 rpm 搖擺震盪 2 小 時，以 wash buffer 清洗後，加入 TMB 試劑反應 15 分鐘，反應後加入 50 uL stop solution，利用分光光度計測定 450 nm 吸光值。
4.2.9 脂質代謝相關訊息傳遞蛋白測定 a.脂肪細胞蛋白質萃取方法
秤取 0.5-1 g 腎週脂肪(perirenal fat pad)，加入生理食鹽水清洗，加入 3 倍量 (1:3)的 RIPA buffer 於均質管中，於冰浴下以組織均質機固定轉速均質 10 分鐘，
移至 15 mL 離心管，於 4℃下離心 3000 rpm/5 min 後，取下層澄清液至 eppendorff，於 4℃下離心 15000 g/20 min，再取下層澄清液至新 eppendorff，冰 -80℃貯存。
b.蛋白質萃取液溶液配置
ddw 8.7 mL / 10x RIPA buffer 1 mL / 100mM PMSF 100 uL / Phosphatase Inhibitor Cocktail2 100 uL / Phosphatase Inhibitor Cocktail3 100 uL
c.西方墨點法分析 1.蛋白質定量
以胎牛血清(BSA)做為蛋白質標準液，配置由不同濃度所構成的檢量線 (0-500 ug/mL)，分別取 10 uL 的組織均質液及 BSA 至 96 well，加入 190 uL Bio-Rad protein assay dye，利用分光光度計測定 595nm 吸光值，再以蛋白標準品的濃度 與吸光值做出標準曲線，求得樣品蛋白質濃度。
2.蛋白質變性(denature)
將脂肪蛋白質溶液，加入 sample buffer 混合，以 95℃加熱 10 分鐘，經冰浴
44 冷卻後，冰-20℃貯存。
3.蛋白質電泳(electrophoresis)
選用適當的隔板厚度(1.0、1.5 mm)的長玻璃，製備 10％之焦集膠(stacking gel) 及分離膠(separation gel)，凝固後將膠片組合架至電泳槽心上，倒入電泳緩衝液。
利用針筒清理 stacking gel 內的殘膠，依序注入 protein marker 及蛋白溶液，以固 定電壓 50V 進行電泳 40 min，待樣品蛋白進入 separation gel 階段，改用 100-120V 繼續電泳，待追蹤染料(Dye)跑離膠體後，取出膠片，浸泡轉印緩衝溶液 10min。
4.蛋白質轉印(transfer)
將 PVDF 膜浸泡甲醇(Methanol)溶液 10 min 後，使用轉印緩衝溶液浸泡 10 min。若使用半乾式轉漬槽，其底部為陽極電極板，上部為陰極電極板，放置順 序由下而上為濾紙、PVDF 膜、膠片、濾紙，蓋上蓋後設定電壓 10-15V、30-60 分鐘。若採用濕式電泳槽，黑色槽心為陰極，紅色槽心為陽極，放置順序由黑色 夾片為底依序為濾紙、膠片、PVDF 膜、濾紙，黑色夾片面向黑色槽心放置，於 電泳槽中放入攪拌棒(Stir bar)並置於攪拌器上、蓋上蓋後設定電壓 100V、60 min，並於 4℃低溫條件下處理。
5.蛋白質阻斷(blocking)
將轉漬完成的 PVDF 膜，置入含有 5%脫脂奶粉的 Blocking Buffer，浸漬 2-8 小時。
一級抗體(primary antibody)
將 Blocking 完成的 PVDF 膜，利用 TBST buffer 先漂洗 1 次，再浸漬含有 3%
胎牛血清的一級抗體，一抗濃度為 1:1000-1:2000，於 4℃條件下，緩速搖盪 2-8 小時。
二級抗體(secondary antibody)
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將浸漬一級抗體後的 PVDF 膜，利用 TBST buffer 先漂洗 2 次，每次 10 分 鐘，再浸漬含有 5%脫脂奶粉的二級抗體，二抗濃度為 1:5000-1:10000，於室溫 條件下，緩速搖盪 2 小時。
6.數位影像擷取與分析
將浸漬二級抗體後的 PVDF 膜，利用 TBST buffer 先漂洗 3 次，每次 10 分 鐘，最終再用 TBS buffer 先漂洗 1 次後加入 ECL buffer，於照膠系統中設定壓片 時間並拍攝電泳圖。拍攝後將已編輯過的圖片，點選工具列 Image Tool 選項，
跳出另一視窗並點選 Crop，此時將出現一個紅色框，拉選四個角落的矛點即可 將所要的畫面擷取出來，選擇 Crop，選擇上方工具列 File → Export → Export for Publication，此時將出現一個視窗，選擇 Current View 600 dpi，點選下方 Export，
選擇需要的副檔名(tif,jpg,bmp,png)。
7.西方墨點法之溶液配置 2X Sample buffer
ddw 3.55 mL / 0.5 M Tris-Base (pH6.8) 1.25 mL / glycerol 2.5 mL / 10% SDS 2 mL / 0.5% Bromophenol blue 0.2 mL/ β-mercaptoethanol 500 uL
1.5 M Tris-Base / pH 8.8
藥品 MW 終濃度 100 mL
Tris-base 121.14 1.5 M 18 g Add ddH2O dilute to 100 mL / 0.22 或 0.45 filter 過濾/ 4℃
0.5 M Tris-Base / pH 6.8
藥品 MW 終濃度 100mL
Tris-base 121.14 0.5 M 6 g Add ddH2O dilute to 100 mL / 0.22 或 0.45 filter 過濾/ 4℃
10%SDS buffer
46
47 TBST buffer
藥品 MW 終濃度 1 L
Tris-base 121.14 4 mM 2.4 g NaCl 58.44 100 mM 29 g
Tween-20 0.01% 1 mL
Add ddH2O dilute to 1 L / pH=7.6
Blocking Buffer 3% (for primary antibody) BSA 3 g / 100 mL TBST buffer
Blocking Buffer 5% (for blocking＆secondary antibody) Skim milk powder 5 g / 100 mL TBST buffer
Stripping buffer
藥品 MW 終濃度 1 L
Glycine 75.07 192 mM 14 g
SDS 288.38 0.1% 1 g
Tween-20 0.1% 10 mL
Add ddH2O dilute to 1 L / pH=2.2
4.3 統計方法
實驗結果是以平均值 ±標準偏差（Mean±SD）表示，數據統計採用 SAS ( Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., USA )軟體執行 One way ANOVA 分 析，並依鄧氏多變域測驗（Duncan’s multiple range test）檢定各實驗組間之差異，
在統計上 P＜0.05 視為具顯著差異。
48 第五章 結果
5.1 灌食沒食子酸 4 週後大鼠進行口服葡萄糖耐受性試驗血漿葡萄糖濃度之變化 大鼠灌食沒食子酸 4 週後行口服葡萄糖耐受性試驗，結果如圖 5-1 所示。HF 組的血漿葡萄糖濃度，於 0、30、60、90、120 分鐘均明顯高於另外 4 組。GA30 組的血漿葡萄糖濃度，於 0、30 分鐘均明顯低於 GA10 組，但於 60、90、120 分 鐘則無顯著差異。
5.2 灌食沒食子酸 4 週後大鼠於禁食情況下血漿中葡萄糖濃度之變化
大鼠飼養 17 週後，禁食犧牲分析血漿中葡萄糖濃度，結果如圖 5-2 所示。
HF 組的血漿葡萄糖濃度顯著高於另外 4 組(p＜0.05)。Normal 組與 Pio 組、GA30 組、GA10 組之間沒有顯著差異。
5.3 灌食沒食子酸 4 週後大鼠於禁食情況下血漿中果糖胺濃度之變化
大鼠飼養 17 週後，禁食犧牲分析血漿中果糖胺濃度，結果如圖 5-3 所示。
HF 組的血漿中果糖胺濃度顯著高於另外 4 組(p＜0.05)。Normal 組與 Pio 組、GA30 組、GA10 組之間沒有顯著差異。
5.4 灌食沒食子酸 4 週後大鼠於禁食情況下血漿中胰島素濃度之變化
大鼠飼養 17 週後，禁食犧牲分析血漿中胰島素濃度，結果如圖 5-4 所示。
HF 組的血漿胰島素濃度顯著高於另外 4 組(p＜0.05)。Normal 組與 Pio 組、GA30 組、GA10 組之間沒有顯著差異。
5.5 灌食沒食子酸 4 週後大鼠於禁食情況下血漿中
C 胜鏈濃度之變化
大鼠飼養 17 週後，禁食犧牲分析血漿中葡萄糖濃度，結果如圖 5-5 所示。
HF 組的血漿葡萄糖濃度顯著低於另外 4 組(p＜0.05)。Normal 組與 Pio 組、GA30
49 組、GA10 組之間沒有顯著差異。
5.6 灌食沒食子酸 4 週後大鼠體內脂肪組織堆積之變化
大鼠飼養 17 週後，犧牲採集腎周脂肪及副睪脂肪進行秤重，結果如圖 5-6 所示。HF 組的脂肪組織克數顯著高於另外 4 組(p＜0.05)。Normal 組與 Pio 組、
GA30 組、GA10 組之間沒有顯著差異。
5.7 灌食沒食子 4 酸週後大鼠於禁食情況下血漿中三酸甘油酯濃度之變化
大鼠飼養 17 週後，禁食犧牲分析血漿中三酸甘油酯濃度，結果如圖 5-7 所 示。HF 組的血漿中三酸甘油酯濃度顯著高於另外 4 組(p＜0.05)。Normal 組與 Pio 組、GA30 組、GA10 組之間沒有顯著差異。Pio 組濃度顯著低於 GA30 組(p＜
0.05)，但與 GA10 組沒有顯著差異。
5.8 灌食沒食子酸 4 週後大鼠於禁食情況下血漿中游離脂肪酸濃度之變化
大鼠飼養 17 週後，禁食犧牲分析血漿中游離脂肪酸濃度，結果如圖 5-8 所 示。HF 組的血漿中游離脂肪酸濃度顯著高於 Normal 組及 Pio 組，但與 GA30 組、
GA10 組沒有顯著差異。Normal 組濃度顯著高於 Pio 組，但與 GA30 組、GA10
GA10 組沒有顯著差異。Normal 組濃度顯著高於 Pio 組，但與 GA30 組、GA10