第二章 文獻回顧
2.4 參與醣類代謝與脂質代謝之關鍵酵素
2.4.3 Lipolysis pathway
脂解作用代謝路徑關鍵酵素如下：
(一) 脂肪細胞三酸甘油酯脂解酶(adipose triglyceride lipase; ATGL)
存在於脂肪組織，能將 TG 分解成雙醯甘油酯(diglycerides; DG)並釋放出 free fatty acid，但不具有分解 DG 能力(Braseamle,2010;Lass et al., 2006)，不會受體內 中 cAMP-dependent protein kinase 的磷酸化調控改變其活性(Langin, 2006)。ATGL 能催化三酸甘油酯的脂解反應，研究指出 ATGL 對三酸甘油酯的第一個酯鍵，專 一性比起 HSL 更高。動物實驗中將 HSL 基因剔除老鼠體內，仍可發現受 ATGL 所分解的 DG 堆積。(Braseamle, 2010)
(二)荷爾蒙敏感性脂解酶(hormone sensitive triacylglycerol lipase; HSL)
存在於脂肪組織，將TG分解成DG並釋放出free fatty acid，脂解作用的限速 步驟，細胞中cAMP為關鍵的第二信息傳遞者(second messenger)能啟動細胞內數 種訊息傳遞路徑(Chen et al., 2010)，cAMP可使cAMP-dependent protein kinase活 化，而讓HSL磷酸化而活化。昇糖激素(glucagon)藉由促進腺苷環化酶(adenylate cyclase; AC)來活化cAMP促使HSL磷酸化而活化。而胰島素及甲基次黃嘌呤類物 質(methyl xanthines)如：caffeine，將藉由促進磷酸二酯酶(phosphodiesterase; PDE) 來抑制cAMP促使HSL去磷酸化而失活(Cluas et al., 2005)。
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圖2-9、人類具有功能性區塊的脂肪酸合成酶二元體構型
The structural and functional organization of animal and human FAS dimer. The linear arrangement of the component activities and their domains are indicated in the subunits of FAS. The dimer formation results in two active centers. The functional division indicates the participation of DI of one subunit and DII and DIII of the second subunit in generating the active center. The ID regions (ID) have no known catalytic activities but play an essential role in the structural organization of catalytically active FAS. AT, acetyl transacylase; MT, malonyl transacylase; ER, enoyl reductase; KR, b-ketoacyl reductase; DH, b-hydroxyacyl dehydratase.(Chirala et al., 2000)
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圖2-10、脂肪細胞中調控三酸甘油酯同化及異化作用之代謝路徑
Model of anabolic and catabolic pathways that regulate triglyceride (TG) levels in adipocytes.
The catabolic pathways involve ATGL, HSL, and monoacylglycerol lipases, which act on TG in a series of reactions to yield glycerol and fatty acids. CGI-58, which binds to perilipin and localizes to adiposomes, is an activator of ATGL. The nature of this activation is unknown. Intermediates of this catabolic pathway may also be recycled for phospholipids and TG synthesis. The anabolic pathways involve the esterification of fatty acids to glycerol. Fatty acids, derived from cellular uptake, de novo synthesis, or lipolytic breakdown of intracellular TG, are ‘‘activated’’ by the addition of a CoA moiety (via the action of acyl CoA synthetases, not shown for simplicity), and are subsequently esterified to glycerol through the actions of enzymes of the glycerolipid synthesis pathways. Significant amounts of hydrolysis products are normally reesterified (Leibel and Hirsch, 1985), a process that may be regulated. The model proposes that MGAT and DGAT enzymes are involved in this reesterification.
TG, triacylglycerol; DG, diacylglycerol; MG, monacylglycerol; FA, fatty acid; ATGL, adipose triglyceride lipase; HSL, hormone-sensitive lipase; MGL, monoacylglycerol lipase; DGAT, acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase; MGAT, acyl
CoA:monacylglycerol acyltransferase. (Yen and Farese, 2006)
34 圖2-11、肝臟組織調控葡萄糖代謝。
Important pathways regulating glucose metabolism in the liver.
Excessive hepatic glucose output occurs in diabetes through increases in glycogenolysis and/or gluconeogenesis. Inhibitors of glycogen phosphorylase inhibit glucose output by decreasing hepatic glycogen catabolism. Other relevant targets include fructose-1,6- bisphosphatase, which controls a rate-limiting step in gluconeogenesis, and glucose-6-phosphatase, which catalyses the final common step required for release of glucose from the liver. NEFA, non-essential fatty acids; PEP, phosphoenolpyruvate. (Moller, 2001)
35 2.5 樣品與抗糖尿病用藥
2.5.1 沒食子酸
沒食子酸(gallic acid; GA)為酚酸(phenolic acids)化合物，屬於苯甲酸(benzoic acis)類衍生物，化學名 3,4,5-三羥基苯甲酸(3,4,5-trihydroxybenzoic acid)，分子式 C6H2(OH)3COOH ， 分 子 量 170.12 g/nmol ， 外 觀 為 白 色 粉 末 ， 屬 厭 水 性 (hydrophobic)，常用於多酚含量試驗的定量標準品。(Jang et al., 2008)
2.5.2 愛妥糖
愛妥糖(ACTOS)為口服抗糖尿病藥物，主要作用為降低 insulin resistance，主 治第 2 型糖尿病，其功效成分為 pioglitazone hydrochloride 能改善肌肉及脂肪組 織的 insulin sensitivity，且抑制肝臟 gluconeogenesis，同時能降低血中的 insulin 濃度。
(一)Pioglitazone hydrochloride 的理化特性
Pioglitazone hydrochloride 為白色結晶狀粉末，分子式 C19H20N2O3SHC1、分 子量 392.9，可溶於 N,N-dimethyl-formamide，微溶於無水酒精，極易溶於 acetone 及 acetonitrile，不溶於水、乙醚。
(二)Pioglitazone hydrochloride 的藥理機轉
Pioglitazone hydrochloride 是 thiazolidinedione 類的糖尿病用藥，需要有胰島 素存在下才能發揮功效，其可降低周邊組織與肝臟的 insilin resistance 現象，增 加依賴胰島素的葡萄糖利用，且降低肝醣(glycogen)含量。但不同於磺基尿素藥 物，此藥不會促進 insulin 分泌，其為 PPARγ 的強力高選擇性作用劑，PPAR 的 受器存在於許多胰島素敏感性組織如:肝、肌肉、脂肪。故活化 PPARγ 細胞核受 器可調控數種受 Insulin 作用影響葡萄糖代謝及脂質代謝的基因轉錄作用。
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於動物實驗模式下，pioglitazone 能降低第 2 型糖尿病的 hyperglycemia、高 胰島素血症(hyperinsulinemia)及高三酸甘油脂血症 (hypertriglyceridemia)等胰島 素阻抗症狀(http://www.takeda.com.tw/products_actos.html)。
37 第三章 實驗架構
雄性 Wistar 大鼠
Normal 組
實驗組 (高果糖飼料誘導)
高 果糖誘導
高 果糖誘導
TZD 組 30mg/kg B.W.
GA 組
高劑量組:30mg/kg 低劑量組:10mg/kg
口服葡萄糖 耐受性試驗
西方墨點法 PI3K Pathway
Glycolysis De novo lipogenesis
Lipolysis HF 組
去離子水
38 第四章 材料與方法
4.1 實驗材料 4.1.1 實驗樣品來源
Gallic acid (Sigma, St. Louis, MO, USA)
Pioglitazone Hydrochloride(台灣武田藥品工業股份有限公司)
4.1.2 實驗動物
雄性 Wistar 大鼠，購自樂斯科生物科技中心，購入週齡為 6 週。
4.1.3 動物飼料
大鼠飼料 (Rodent Chow diet)，其組成份為 23% Crude protein、4.5% Crude fat、
6.0% Crude fiber、8.0% Ash、2.5% Minerals、56% Carbohydrate。
4.1.4 實驗藥品與試劑 4.1.4.1 化學藥品
Bio-Rad Laboratories (Richmond, VA, USA)：
Ammonium persulfate (APS)
N,N,N,N-Tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)
Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)：
RIPA buffer (10X)
J.T.Baker (Phillipsburg):
Sodium dodecylsulfate (SDS) Sodium chloride (NaCl)
39 Merck KgaA (Darmstadt , Germany)：
Tween-20
Millipore(Billerica, MA, USA) Anti-Acetyl-CoA Carboxylase-1
Anti-phospho-Acetyl-CoA Carboxylase-1(Ser79)
Sigma (St. Louis, MO, USA)：
Bovine serum albumin (BSA) bromophenol blue
glycerol molecular biology reagent 2-mercaptoethanol (2-ME)
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 Skim milk powder
PerkinElmer(Boston, MA, USA)：
Transfer Membrane Western Lightning Thermo
Albumin Standard
4.1.4.2 酵素套組
Bio-Rad Laboratories (Richmond, VA, USA)：
40 Bio-Rad protein assay dye reagent
Mercodia(Uppsala, Sweden) Rat Insulin ELISA Kits
RANDOX
glucose(GLUC-PAP)
4.1.4.3 抗體
Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)：
ATGL antibody
Insulin Receptor β (L55B10) Mouse mAb Gene Tex (Irvine, CA, USA)：
alpha Tubuin 4a antibody Actin antibody
Fatty Acid Synthase antibody [N1], N-term GLUT4 antibody [EP(2)AY], C-term PFKL antibody
PKC zeta antibody
Pyruvate Kinase (liver/RBC) antibody Mouse IgG antibody (HRP)
Rabbit IgG antibody (HRP) 4.1.4.4 儀器設備
迴轉式震盪器 ORBITAL SHAKER(TS-500, 祥泰，台北，台灣)
純水製造機(Milli-Q ultrapure water system) (Millipore, Bedford, MA, USA)
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高速離心機(Centrifugator)(Sorvall RC 5C, DuPONT, CT, USA) 桌上型離心機(Centrifugator)(KUBOTA5100,Tokyo,Japan) 免疫酵素分析儀(Precision microplate reader)
(Bio tek,Epoch,Thermo Fisher Scientific Inc.,Vermont, USA) 天秤 Balance(HR-200, A＆D,USA)
冷凍離心機(Universal 30RF, Hettich, German)
低溫冷凍櫃-20℃ refrigerator(CH-401，進信，台灣)
震盪混合器 Vortex mixer(G-560, Scientific industries, Inc.,Bohemia, NY, USA) 酸鹼測定機 Hanna instruments(HI9017, Italy)
4.2 實驗方法 4.2.1 動物飼養
自樂斯科生物科技中心購入 6 週齡的 Wistar 大鼠，飼養於國立台灣大學食 品科技研究所動物房，溫度維持 25℃，light-dark cycle 維持 12 小時光照，12 小 時黑暗，供給飲水及飼料，讓老鼠自由攝食，每週記錄體重變化，於第 17 週犧 牲。
4.2.2 動物分組與誘導
適應兩週後的雄性 Wistar 大鼠 40 隻，給予 66％的高果糖飼料誘導 8 週後，
進行口服葡萄糖耐受性試驗，再依血糖濃度及體重分為 5 組：
正常組：不誘導高血糖，管餵去離子水。
控制組：有誘導高血糖，管餵去離子水。
實驗組(共三組)：有誘導高血糖，管餵 Pioglitazone hydrochloride 及不同濃度 Gallic acid。
42 4.2.3 樣品餵食劑量
Pioglitazone hydrochloride 組(Pio30)：溶液濃度為 30 mg/mL，餵食量為 30 mg/kg B.W.
Gallic acid 高劑量組(GA30)：溶液濃度為 30 mg/mL，餵食量為 30 mg/kg B.W.
Gallic acid 低劑量組(GA10)：溶液濃度為 30 mg/mL，餵食量為 10 mg/kg B.W.
4.2.4 口服葡萄糖耐受性試驗
5 組大鼠經 12 小時禁食後，先採取空腹血糖，再管餵 1.5 g/mL/kg B.W.的葡 萄糖水，之後分別於 30、60、90、120 分鐘(含 0 分鐘共 5 個時間點)，使用斷尾 方法各採血一次，採後將血液於 4℃下離心 3000 rpm、20 min，取上清液分析葡 萄糖濃度。
4.2.5 血液的收集與處理
將全血置於含 15 mL 離心管，將血液於 4℃下離心(3000 rpm、20 min)，取 上清液分析。
4.2.6 臟器的採集
大鼠犧牲時，採集腹週脂肪及副睪脂肪，秤重後冰-20℃。
4.2.7 血漿葡萄糖濃度測定
取血漿 10 uL 與葡萄糖 Enzymatic kits(Audit Diagnostics)試劑 1mL 混合均 勻，於 37℃水浴 10 分鐘，利用分光光度計測定 500 nm 波長下吸光值，換算葡 萄糖含量。測定原理為 glucose 經由 glucose oxidese 作用，氧化成 gluconic acid 及 H2O2再經由 peroxidase 轉換 phenol 及 4-aminoantipyrine 成為 red quinine，在 500 nm 波長下測定 red quinine 含量。
43 4.2.8 血漿胰島素濃度測定
取 25 uL 血漿及 50 uL Enzyme conjugate ，在室溫下以 70 rpm 搖擺震盪 2 小 時，以 wash buffer 清洗後，加入 TMB 試劑反應 15 分鐘，反應後加入 50 uL stop solution，利用分光光度計測定 450 nm 吸光值。
4.2.9 脂質代謝相關訊息傳遞蛋白測定 a.脂肪細胞蛋白質萃取方法
秤取 0.5-1 g 腎週脂肪(perirenal fat pad)，加入生理食鹽水清洗，加入 3 倍量 (1:3)的 RIPA buffer 於均質管中，於冰浴下以組織均質機固定轉速均質 10 分鐘，
移至 15 mL 離心管，於 4℃下離心 3000 rpm/5 min 後，取下層澄清液至 eppendorff，於 4℃下離心 15000 g/20 min，再取下層澄清液至新 eppendorff，冰 -80℃貯存。
b.蛋白質萃取液溶液配置
ddw 8.7 mL / 10x RIPA buffer 1 mL / 100mM PMSF 100 uL / Phosphatase Inhibitor Cocktail2 100 uL / Phosphatase Inhibitor Cocktail3 100 uL
c.西方墨點法分析 1.蛋白質定量
以胎牛血清(BSA)做為蛋白質標準液，配置由不同濃度所構成的檢量線 (0-500 ug/mL)，分別取 10 uL 的組織均質液及 BSA 至 96 well，加入 190 uL Bio-Rad protein assay dye，利用分光光度計測定 595nm 吸光值，再以蛋白標準品的濃度 與吸光值做出標準曲線，求得樣品蛋白質濃度。
2.蛋白質變性(denature)
將脂肪蛋白質溶液，加入 sample buffer 混合，以 95℃加熱 10 分鐘，經冰浴
44 冷卻後，冰-20℃貯存。
3.蛋白質電泳(electrophoresis)
選用適當的隔板厚度(1.0、1.5 mm)的長玻璃，製備 10％之焦集膠(stacking gel) 及分離膠(separation gel)，凝固後將膠片組合架至電泳槽心上，倒入電泳緩衝液。
利用針筒清理 stacking gel 內的殘膠，依序注入 protein marker 及蛋白溶液，以固 定電壓 50V 進行電泳 40 min，待樣品蛋白進入 separation gel 階段，改用 100-120V 繼續電泳，待追蹤染料(Dye)跑離膠體後，取出膠片，浸泡轉印緩衝溶液 10min。
4.蛋白質轉印(transfer)
將 PVDF 膜浸泡甲醇(Methanol)溶液 10 min 後，使用轉印緩衝溶液浸泡 10 min。若使用半乾式轉漬槽，其底部為陽極電極板，上部為陰極電極板，放置順 序由下而上為濾紙、PVDF 膜、膠片、濾紙，蓋上蓋後設定電壓 10-15V、30-60 分鐘。若採用濕式電泳槽，黑色槽心為陰極，紅色槽心為陽極，放置順序由黑色 夾片為底依序為濾紙、膠片、PVDF 膜、濾紙，黑色夾片面向黑色槽心放置，於 電泳槽中放入攪拌棒(Stir bar)並置於攪拌器上、蓋上蓋後設定電壓 100V、60 min，並於 4℃低溫條件下處理。
5.蛋白質阻斷(blocking)
將轉漬完成的 PVDF 膜，置入含有 5%脫脂奶粉的 Blocking Buffer，浸漬 2-8 小時。
一級抗體(primary antibody)
將 Blocking 完成的 PVDF 膜，利用 TBST buffer 先漂洗 1 次，再浸漬含有 3%
胎牛血清的一級抗體，一抗濃度為 1:1000-1:2000，於 4℃條件下，緩速搖盪 2-8 小時。
二級抗體(secondary antibody)
45
將浸漬一級抗體後的 PVDF 膜，利用 TBST buffer 先漂洗 2 次，每次 10 分 鐘，再浸漬含有 5%脫脂奶粉的二級抗體，二抗濃度為 1:5000-1:10000，於室溫 條件下，緩速搖盪 2 小時。
6.數位影像擷取與分析
將浸漬二級抗體後的 PVDF 膜，利用 TBST buffer 先漂洗 3 次，每次 10 分 鐘，最終再用 TBS buffer 先漂洗 1 次後加入 ECL buffer，於照膠系統中設定壓片 時間並拍攝電泳圖。拍攝後將已編輯過的圖片，點選工具列 Image Tool 選項，
跳出另一視窗並點選 Crop，此時將出現一個紅色框，拉選四個角落的矛點即可 將所要的畫面擷取出來，選擇 Crop，選擇上方工具列 File → Export → Export for Publication，此時將出現一個視窗，選擇 Current View 600 dpi，點選下方 Export，
選擇需要的副檔名(tif,jpg,bmp,png)。
7.西方墨點法之溶液配置 2X Sample buffer
ddw 3.55 mL / 0.5 M Tris-Base (pH6.8) 1.25 mL / glycerol 2.5 mL / 10% SDS 2 mL / 0.5% Bromophenol blue 0.2 mL/ β-mercaptoethanol 500 uL
1.5 M Tris-Base / pH 8.8
藥品 MW 終濃度 100 mL
Tris-base 121.14 1.5 M 18 g Add ddH2O dilute to 100 mL / 0.22 或 0.45 filter 過濾/ 4℃
0.5 M Tris-Base / pH 6.8
藥品 MW 終濃度 100mL
Tris-base 121.14 0.5 M 6 g Add ddH2O dilute to 100 mL / 0.22 或 0.45 filter 過濾/ 4℃
10%SDS buffer
46
47 TBST buffer
藥品 MW 終濃度 1 L
Tris-base 121.14 4 mM 2.4 g NaCl 58.44 100 mM 29 g
Tween-20 0.01% 1 mL
Add ddH2O dilute to 1 L / pH=7.6
Blocking Buffer 3% (for primary antibody) BSA 3 g / 100 mL TBST buffer
Blocking Buffer 5% (for blocking＆secondary antibody) Skim milk powder 5 g / 100 mL TBST buffer
Stripping buffer
藥品 MW 終濃度 1 L
Glycine 75.07 192 mM 14 g
SDS 288.38 0.1% 1 g
Tween-20 0.1% 10 mL
Add ddH2O dilute to 1 L / pH=2.2
4.3 統計方法
實驗結果是以平均值 ±標準偏差（Mean±SD）表示，數據統計採用 SAS ( Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., USA )軟體執行 One way ANOVA 分 析，並依鄧氏多變域測驗（Duncan’s multiple range test）檢定各實驗組間之差異，
在統計上 P＜0.05 視為具顯著差異。
48 第五章 結果
5.1 灌食沒食子酸 4 週後大鼠進行口服葡萄糖耐受性試驗血漿葡萄糖濃度之變化
5.1 灌食沒食子酸 4 週後大鼠進行口服葡萄糖耐受性試驗血漿葡萄糖濃度之變化