壹、 序論
一、手足口病
手足口病（hand, foot, and mouth disease；HFMD）是一種由腸道病毒所引起 的急性傳染病，其主要感染源包含腸病毒 71 型（enterovirus 71；EV71）及克沙 奇病毒 A16 型（coxsackievirus A16）等，而重癥病例則多由 EV71 感染所引起 (Chatproedprai et al., 2010)。由 EV71 引起的疫情曾在世界各國爆發（表一），在 臺灣則以 1998 年的疫情最嚴重，共造成超過 12 萬人的報告病例，以及 78 人的 死亡。至今每年仍持續出現 EV71 感染的案例（表二）。
表一、世界各國的主要腸病毒 71 型感染疫情資料
年份 地點 感染人數 死亡人數
1972 紐約 11 0
1973 瑞典 195 0
1973 日本 3296 不明
1975 保加利亞 705 68
1978 匈牙利 1550 45
1978 日本 36301 不明
1997 馬來西亞 5999 31
1998 臺灣 129106 78
2000 新加坡 3790 5
2006 馬來西亞 291 6
2008 中國 488955 128
資料來源：Wu, 2007；Ooi et al., 2010
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在病毒學的分類上，腸病毒屬於小 RNA 病毒目（Picornavirales）、小 RNA 病毒科（Picornaviridae），以及腸病毒屬（Enterovirus）(Yeo and Chow, 2007)；
外形上為直徑約 24~30 nm 的無外膜 20 面體（圖一），其內部包含正（＋）股的 單股 RNA，依型別之不同，核苷酸長度介於 7209~8450 bp 之間，序列結構包含 5’untranslated region（5’UTR）、polyprotein 的 open reading frame（ORF）、及 3’UTR (Zhang and Lu, 2010)；其 ORF 轉譯出的 polyprotein 可分為 P1、P2 及 P3 三個區 域，P1 為構造蛋白（structural protein）區，會受 3CD 蛋白水解酶（protease 3CD）
的作用而釋出 VP1、VP3 和 VP0（VP2-VP4）三種蛋白質成分，再自動組裝
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（spontaneous assembly）成病毒的外鞘構造；P2 及 P3 為非結構蛋白（non-structural protein）區，負責生成病毒複製和感染寄主細胞所需要的 2A、2B、2C、3A、3B、
3C 及 3D 等蛋白質成分（圖一）(Wu, 2007)。藉由 EV71 病毒株 genotyping 的結 果，能將 EV71 再進一步區分為 A、B1~B5 及 C1~C5 等亞型(Chatproedprai et al., 2010)。
（pulmonary edema）或是肺出血等心肺衰退疾病，導致病患死亡(Chang et al., 1998)。有研究(Yeo and Chow, 2007)指出，EV71 的 VP1 外鞘蛋白能夠與腦組織 中的 ornithine decarboxylase（ODC1）及 ankyrin 結合，ODC1 主要參與 polyamines 的合成作用，當 polyamines 不足時，會造成巨噬細胞無法被 lipopolysaccharide、
IFN-γ、tumor necrosis factor 等因子活化；而 ankyrin 和 L1 vertebrate cell adhesion molecule 無法作用時會導致 CRASH syndrome (Needham et al., 2001)，因此外鞘 蛋白質中的 VP1 可能在腸病毒入侵神經系統的過程中扮演重要的角色。而目前
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三、腸病毒 71 型疫苗的發展現況
為了降低 EV71 的疫情，目前已有多種疫苗研究持續進行當中。其中 Arita et al. (2005)藉由 side-directed mutagenesis 方式，修改 EV71 的 5’UTR、3D polymerase 及 3’UTR 等區域，進而獲得毒性減弱的 S1-3’病毒株，將此突變株與標準株分別 活性疫苗（inactivated vaccine），隨後進行 EV71 感染處理時並不會出現四肢麻痹 的現象，且在大腦、脊髓、血液及肌肉內所偵測的病毒數量也明顯低於對照組 有「外來基因」嵌入接種者基因組（genome）的顧慮 (Smith and Klinman, 2001)。
Hu et al. (2003)則建構出兩種重組桿狀病毒（baculovirus：Bac-P1 及 Bac-3CD），
當此兩種病毒共同感染夜盜蛾（Spodoptera frugiperda）的 Sf-9 細胞後，會在細 胞內表現生成 P1 polyprotein 及 3CD protease，此 protease 會切割 P1 polyprotein 產 生 VP1、VP3 及 VP0，並在細胞內組裝成類病毒顆粒（virus-like particle）。類病 毒顆粒經注射後，能夠激發小鼠體內生成 EV71 抗體，及 IFN-γ、IL-2、IL-12 和 去活性疫苗無法生成的 IL-4 等細胞激素，顯示此類病毒顆粒能夠引起 TH1 及 TH2
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反應 (Chung et al., 2008)。目前此類病毒顆粒的生產效能最高可達 43.4 mg/L (Chung et al., 2010)，然而期間仍須透過細胞培養來生產重組病毒及類病毒顆粒，
製作方式仍屬複雜。
除了上述的減毒疫苗、去活性疫苗及類病毒顆粒之外，許多學者也探討開發 EV71 次單元體疫苗（subunit vaccine）的可能性。例如 Wu et al. (2001)將大腸桿 菌生成的 VP1 重組蛋白與弗氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant，CFA）混 合後，施打於小鼠腹腔內，進而誘發得到為對照組 8 倍的 VP1 抗體效價。此外，
Chen et al. (2006)則是以含 VP1 的基因轉殖番茄進行小鼠餵食試驗，結果發現其 腸道及血液中均能增加 VP1 抗體效價的表現，處理組的抗血清在稀釋 16 倍後仍 具中和病毒毒性的效能。Chiu et al. (2006)將含 VP1 基因的表現載體殖入沙門氏 菌( Salmonella enterica )，再用以餵食懷孕母鼠，隨後將其新生小鼠進行病毒挑 戰測試，結果實驗組小鼠的存活率（58%）明顯高過對照組的存活率（0%），而 苗的劑量或減少追加次數(Wilson-Welder et al., 2009)，佐劑依作用模式（mode of action）大致可分為 depot、presentation、immunomodulation、以及 targeting 等類 別(Cox and Coulter, 1997)。
Depot adjuvants 可以延緩抗原在接種處的釋放時間，進而延長抗原在動物體 內誘發免疫反應的時間，或是與抗原形成 aggregate 以利被抗原呈現細胞吞噬，
例如少數被准許使用在人類上的鋁鹽（alum salt）(Marciani, 2003)及油乳化劑（oil