共同表現IgG結合蛋白可增進VP1重組蛋白質作為腸病毒食用疫苗的潛力

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 共同表現 IgG 結合蛋白可增進 VP1 重組蛋白質作為腸病毒食用疫苗的潛力 Co-expression of IgG-binding protein enhances the potential of recombinant VP1 protein as edible vaccine for EV71-associated hand, foot, and mouth disease. 研究生：劉超凡 Chao-Fan Liu 指導教授：王玉麒博士 Dr. Yu-Chie Wang 中華民國一百年八月 I.

(2) II.

(3) 致謝. 這篇論文得以順利完成，首先要感謝於我的指導教授王玉麒老師，在實驗上提供我創新的想法及見解，並且在技術上也給予嚴謹的指導，而在論文的修改上，也非常有耐心的修正每一個細節，最重要的是王玉麒老師給予的鼓勵，讓我能夠有動力面對這四年的挑戰。同時也感謝口試委員呂國棟老師及何美鄉老師在論文上給予的指正及建議，得以讓這篇論文更加完整。感謝永順學長及書宏在實驗操作的帶領、政霖及國英互相的支援打氣、韻如在單株抗體實驗的協助，以及宗明、阿坤、泰霖、奕輝、國華、國緯、哲維、佑臣的幫助及鼓勵，因為你們，我的碩士生涯才能如此充實。此外，也要感謝 G 團的彥修、崧禾、光曦、紹頤及智鵬，你們所給予的修學經驗以及適時的陪伴，總是讓我保持正面及開朗的情緒，對於苦悶的碩士生活能夠適度的調劑心情，而輔大生科的昕緯、仲宏及鈺璇，謝謝你們在我面對面試、實驗以及求學上的各種幫助。而老爸、老媽、奶奶及弟妹在我生活上的各種扶持，不但能夠減輕我生活及經濟上的負擔，更是我調解情緒的完美港口，其中婉瑤陪伴的點點滴滴，更是我這幾年求學生涯上最重要的支柱。最終要感謝實驗操作中的小鼠及兔子動物老師，謝謝你們所做的一切。. III.

(4) 目. 錄. 中文摘要………………………………………………………………………………1 英文摘要………………………………………………………………………………2 壹、序論 ……………………………………………………………………………3 一、手足口病……………………………………………………………………3 二、腸病毒 71 型…………………………………………………………………4 三、腸病毒 71 型疫苗的發展現況………………………………………………6 四、佐劑的應用…………………………………………………………………7 五、 IgG 結合蛋白………………………………………………………………9 六、疫苗的接種方式……………………………………………………………11 七、研究目的……………………………………………………………………11 貳、研究材料與方法…………………………………………………………………12 一、表現載體的選殖、建構與轉形……………………………………………12 二、重組蛋白質的誘導表現與純化……………………………………………14 三、重組蛋白質的結合能力測試………………………………………………18 四、小鼠的口服餵食實驗………………………………………………………20 五、抗血清的製作與分析………………………………………………………21 六、單株抗體的生產……………………………………………………………24 七、統計分析……………………………………………………………………24 参、結果………………………………………………………………………………25 一、重組 VP1 蛋白質（rVP1）的誘導表現與純化……………………………25 二、VP1 抗血清的生產…………………………………………………………26 三、IgG 結合蛋白的表現載體建構……………………………………………27 四、重組蛋白質的誘導、確認及純化…………………………………………28 五、重組蛋白對免疫球蛋白的結合力測試……………………………………29 IV.

(5) 六、三種重組蛋白質的小鼠餵食試驗…………………………………………30 肆、討論………………………………………………………………………………35 一、 rVP1 具有 EV71 口服疫苗的應用潛力…………………………………37 二、 FAI3 與 Mig(IgG)兩種 IgG 結合蛋白具有增強免疫反應的佐劑效應…40 三、IgG 結合蛋白的「佐劑效應」應源自其與 IgG 分子結合的能力………41 四、FAI3 與 Mig(IgG)對 IgG 的作用力具有物種間的差異性…………………42 五、以大腸桿菌生產 VP1 口服疫苗的優勢及改進……………………………44 六、結論…………………………………………………………………………45 伍、參考文獻…………………………………………………………………………46 陸、圖表………………………………………………………………………………51 柒、附錄………………………………………………………………………………90 附錄一、腸病毒外鞘蛋白 VP1 基因序列……………………………………90 附錄二、 C 群鏈球菌 FAI 基因序列……………………………………………92 附錄三、減乳糖鏈球菌 Mig 基因序列…………………………………………94 附錄四、 PCR 反應所使用的引子及對應位置………………………………96 附錄五、縮寫對照表…………………………………………………………97. V.

(6) 摘要腸病毒 71 型（EV71）是造成手足口病（HFMD）的主要病原體之一，兒童感染後可能會引發嚴重的神經併發症而導致死亡，由於目前尚無專門對抗 EV71 的藥物或治療方式，因此發展疫苗被認為是控制腸病毒疫情的重要手段。本研究將 EV71 的 VP1 基因分別與 FAI3 及 Mig(IgG)兩種 IgG 結合蛋白的基因進行融合，並藉大腸桿菌表現生產 rVP1、rVP1-FAI3 及 rVP1-Mig(IgG)三種重組蛋白質，以對小鼠進行口服疫苗測試。結果顯示，這三種重組蛋白質的餵食處理皆能使小鼠糞便內及血液中的 VP1 抗體效價提升，並呈現典型的一級和二級免疫反應情形，證實這些重組蛋白質的餵食處理不僅能激活小鼠的黏膜性及系統性免疫反應，並能促使小鼠體內產生針對 VP1 抗原的記憶性 B 細胞。三種重組蛋白質的餵食處理中，融合蛋白[rVP1-Mig(IgG)及 rVP1-FAI3]餵食組的 VP1 抗體效價明顯高於 rVP1 餵食組：在血液中，前者為後者的 1.47~2.02 倍；在糞便內，前者則為後者的 2.04~2.62 倍。這些結果顯示 FAI3 及 Mig(IgG)具有黏膜性佐劑的性質，共同表現這兩種 IgG 結合蛋白將可增進 rVP1 作為腸病毒口服疫苗的功效。本研究經由 ELISA 及細胞染色的實驗，已證實 rVP1-FAI3 及 rVP1-Mig(IgG)能與小鼠的 IgG 及脾臟細胞表面結合，而小鼠與人類 IgG CH2－CH3 domain 的胺基酸序列有高達 70%的相同度，因此我們推論 FAI3 及 Mig(IgG)兩種 IgG 結合蛋白具有應用於開發人類口服疫苗的潛力。. 關鍵字：腸病毒 71 型、次單元體疫苗、黏膜性佐劑、IgG 結合蛋白. \. 1.

(7) Abstract Enterovirus 71 (EV71) is the main infective agent of hand, foot and mouth disease (HFMD) and may cause fatal neurological complications and death among young children. Due to the lack of an effective antiviral agent, developing useful vaccines is considered a top choice among all control measures. In this study, the genes encoding two IgG binding proteins, FAI3 and Mig(IgG), were fused to VP1 gene respectively, and three recombinant proteins, rVP1, rVP1-FAI3 and rVP1-Mig(IgG), was individually expressed in E. coli and used for oral immunization tests in mice. Our results revealed that feeding each of these three recombinant proteins to mice can elevate the titers of VP1 antibodies in both serum and feces, and the changing of antibody titer displays a typical pattern of primary and secondary immune responses, suggesting our feeding strategy is effective in activating both mucosal and systemic immune responses and in causing generation of specific memory B cells. Among the three recombinant proteins, fusion proteins [rVP1-Mig(IgG) and rVP1-FAI3] were found to stimulate significantly higher VP1 antibody titer, both in serum and feces, than that by rVP1. These data manifest the mucosal adjuvant property of FAI3 and Mig(IgG) and thus co-expression of these two IgG-binding proteins should be able to enhance the efficacy of rVP1 as oral vaccine for EV71. Moreover, since our results of ELISA and cell surface staining demonstrate the binding ability of rVP1-FAI3 and rVP1-Mig(IgG) to mouse IgGs and spleen cells, and since the amino acid sequence of mouse IgG CH2－CH3 domain is 70% identical to that of human’s counterpart, it is inferred that FAI3 and Mig(IgG) may also be used as mucosal adjuvant for human.. Key words: Enterovirus 71, subunit vaccine, mucosal adjuvant, IgG binding protein. 2.

(8) 壹、序論. 一、手足口病手足口病（hand, foot, and mouth disease；HFMD）是一種由腸道病毒所引起的急性傳染病，其主要感染源包含腸病毒 71 型（enterovirus 71；EV71）及克沙奇病毒 A16 型（coxsackievirus A16）等，而重癥病例則多由 EV71 感染所引起 (Chatproedprai et al., 2010)。由 EV71 引起的疫情曾在世界各國爆發（表一），在臺灣則以 1998 年的疫情最嚴重，共造成超過 12 萬人的報告病例，以及 78 人的死亡。至今每年仍持續出現 EV71 感染的案例（表二）。. 表一、世界各國的主要腸病毒 71 型感染疫情資料年份. 地點. 感染人數. 死亡人數. 1972. 紐約. 11. 0. 1973. 瑞典. 195. 0. 1973. 日本. 3296. 不明. 1975. 保加利亞. 705. 68. 1978. 匈牙利. 1550. 45. 1978. 日本. 36301. 不明. 1997. 馬來西亞. 5999. 31. 1998. 臺灣. 129106. 78. 2000. 新加坡. 3790. 5. 2006. 馬來西亞. 291. 6. 2008. 中國. 488955. 128. 資料來源：Wu, 2007；Ooi et al., 2010. 3.

(9) 表二、臺灣近年的腸病毒 71 型感染資料年份. 感染人數. 死亡人數. 1999. 35. 4. 2000. 291. 21. 2001. 393. 12. 2002. 162. 2. 2003. 70. 5. 2004. 50. 0. 2005. 142. 16. 2006. 11. 0. 2007. 12. 0. 2008. 373. 4. 2009. 29. 0. 2010. 16. 0. 資料來源：臺灣疾病管制局（http://nidss.cdc.gov.tw）. 二、腸病毒 71 型在病毒學的分類上，腸病毒屬於小 RNA 病毒目（Picornavirales）、小 RNA 病毒科（Picornaviridae），以及腸病毒屬（Enterovirus）(Yeo and Chow, 2007)；外形上為直徑約 24~30 nm 的無外膜 20 面體（圖一），其內部包含正（＋）股的單股 RNA，依型別之不同，核苷酸長度介於 7209~8450 bp 之間，序列結構包含 5’untranslated region（5’UTR）、polyprotein 的 open reading frame（ORF）、及 3’UTR (Zhang and Lu, 2010)；其 ORF 轉譯出的 polyprotein 可分為 P1、P2 及 P3 三個區域，P1 為構造蛋白（structural protein）區，會受 3CD 蛋白水解酶（protease 3CD）的作用而釋出 VP1、VP3 和 VP0（VP2-VP4）三種蛋白質成分，再自動組裝 4.

(10) （spontaneous assembly）成病毒的外鞘構造；P2 及 P3 為非結構蛋白（non-structural protein）區，負責生成病毒複製和感染寄主細胞所需要的 2A、2B、2C、3A、3B、 3C 及 3D 等蛋白質成分（圖一）(Wu, 2007)。藉由 EV71 病毒株 genotyping 的結果，能將 EV71 再進一步區分為 A、B1~B5 及 C1~C5 等亞型(Chatproedprai et al., 2010)。 EV71 主要是經由腸胃道（糞口傳染）或是呼吸道（飛沫傳染）入侵人體，並透過黏膜組織底部的淋巴結進入血液循環 (Wu, 2007)，當入侵到皮膚、肌肉組織時，會引發手足口病、皰疹性咽喉炎（herpangina），心肌炎（myocarditis）等症狀；而入侵到中央神經系統時，會引起腦膜炎（meningoencephalitis）、出血性結膜炎（hemorrhagic conjunctivitis）等神經性併發症，在脊髓甚至會引起肺水腫（pulmonary edema）或是肺出血等心肺衰退疾病，導致病患死亡(Chang et al., 1998)。有研究(Yeo and Chow, 2007)指出，EV71 的 VP1 外鞘蛋白能夠與腦組織中的 ornithine decarboxylase（ODC1）及 ankyrin 結合，ODC1 主要參與 polyamines 的合成作用，當 polyamines 不足時，會造成巨噬細胞無法被 lipopolysaccharide、 IFN-γ、tumor necrosis factor 等因子活化；而 ankyrin 和 L1 vertebrate cell adhesion molecule 無法作用時會導致 CRASH syndrome (Needham et al., 2001)，因此外鞘蛋白質中的 VP1 可能在腸病毒入侵神經系統的過程中扮演重要的角色。而目前尚無特定針對 EV71 的抗病毒藥物 (Chiu et al., 2006)，醫院多僅能依據病患的徵狀，採取點滴注射、或投用退燒、血管擴張劑等藥物來進行症狀治療 (Wu, 2007)，但即使痊癒後，EV71 仍能夠在痊癒病患的喉嚨存活兩週，糞便中甚至能存活至 11 週以上(Ooi et al., 2010) 平常若是能養成良好的衛生習慣、勤洗手、定期消毒個人用品，或是均衡飲食及適度的運動，是能夠降低病毒感染的機會。但染病主要對象的 5 歲以下兒童，通常衛生觀念薄弱，其感染的風險也較高，因此若是能開發出 EV71 疫苗，不但可以預防幼童感染，也能避免腸病毒 71 型在人群中傳播，達到控制疫情的效果。 5.

(11) 三、腸病毒 71 型疫苗的發展現況為了降低 EV71 的疫情，目前已有多種疫苗研究持續進行當中。其中 Arita et al. (2005)藉由 side-directed mutagenesis 方式，修改 EV71 的 5’UTR、3D polymerase 及 3’UTR 等區域，進而獲得毒性減弱的 S1-3’病毒株，將此突變株與標準株分別感染食蟹猴（cynomolgus monkey）後，分析結果顯示突變株並不會入侵大腦、小腦及腦幹等組織，在猴子身上也不會造成運動失調的症狀，然而實驗動物仍會產生顫抖的現象，且能夠從脊椎中分離出病毒，顯示此減毒疫苗（attenuated vaccine）仍然具有入侵神經組織的能力。而 Wu et al. (2001)則將熱處理過的病毒以腹腔注射方式施打於母鼠體內，並發現其血清中可生成具中和病毒能力的抗體；當小鼠事先施打福馬林處理過的去活性疫苗（inactivated vaccine），隨後進行 EV71 感染處理時並不會出現四肢麻痹的現象，且在大腦、脊髓、血液及肌肉內所偵測的病毒數量也明顯低於對照組 (Ong et al., 2010)，但是此去活性疫苗乃需藉由動物細胞培養來生產病毒顆粒，產能上有一定的限制性。當施打可表現生成 VP1 的 DNA 疫苗後，小鼠細胞內不僅可生成 VP1 重組蛋白質，小鼠體內的 IFN-γ 及 IL-12 表現量也顯著增加，顯示此 DNA 疫苗能夠誘發 TH1 反應，而其抗血清在經 10 倍稀釋後，也仍能有中和病毒的效果 (Wu et al., 2001)。然而接種 DNA 疫苗往往無法精確掌控接種者體內的抗原生成量，也有「外來基因」嵌入接種者基因組（genome）的顧慮 (Smith and Klinman, 2001)。 Hu et al. (2003)則建構出兩種重組桿狀病毒（baculovirus：Bac-P1 及 Bac-3CD），當此兩種病毒共同感染夜盜蛾（Spodoptera frugiperda）的 Sf-9 細胞後，會在細胞內表現生成 P1 polyprotein 及 3CD protease，此 protease 會切割 P1 polyprotein 產生 VP1、VP3 及 VP0，並在細胞內組裝成類病毒顆粒（virus-like particle）。類病毒顆粒經注射後，能夠激發小鼠體內生成 EV71 抗體，及 IFN-γ、IL-2、IL-12 和去活性疫苗無法生成的 IL-4 等細胞激素，顯示此類病毒顆粒能夠引起 TH1 及 TH2 6.

(12) 反應 (Chung et al., 2008)。目前此類病毒顆粒的生產效能最高可達 43.4 mg/L (Chung et al., 2010)，然而期間仍須透過細胞培養來生產重組病毒及類病毒顆粒，製作方式仍屬複雜。除了上述的減毒疫苗、去活性疫苗及類病毒顆粒之外，許多學者也探討開發 EV71 次單元體疫苗（subunit vaccine）的可能性。例如 Wu et al. (2001)將大腸桿菌生成的 VP1 重組蛋白與弗氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant，CFA）混合後，施打於小鼠腹腔內，進而誘發得到為對照組 8 倍的 VP1 抗體效價。此外， Chen et al. (2006)則是以含 VP1 的基因轉殖番茄進行小鼠餵食試驗，結果發現其腸道及血液中均能增加 VP1 抗體效價的表現，處理組的抗血清在稀釋 16 倍後仍具中和病毒毒性的效能。Chiu et al. (2006)將含 VP1 基因的表現載體殖入沙門氏菌( Salmonella enterica )，再用以餵食懷孕母鼠，隨後將其新生小鼠進行病毒挑戰測試，結果實驗組小鼠的存活率（58%）明顯高過對照組的存活率（0%），而母鼠的抗血清在被稀釋 8 倍後，仍具中和病毒毒性的效能。Chen et al. (2008)則是將 VP1 基因轉殖表現於小鼠的乳腺細胞，攝取含有 VP1 乳汁的幼鼠在隨後 EV71 感染的過程中，並不會產生體重下降及四肢麻痺等症狀，且其抗血清在稀釋 10 倍後仍具中和病毒毒性的功效。. 四、佐劑的應用佐劑與抗原共同施用後，除了能夠提升接種者的免疫反應外，還能夠降低疫苗的劑量或減少追加次數(Wilson-Welder et al., 2009)，佐劑依作用模式（mode of action）大致可分為 depot、presentation、immunomodulation、以及 targeting 等類別(Cox and Coulter, 1997)。 Depot adjuvants 可以延緩抗原在接種處的釋放時間，進而延長抗原在動物體內誘發免疫反應的時間，或是與抗原形成 aggregate 以利被抗原呈現細胞吞噬，例如少數被准許使用在人類上的鋁鹽（alum salt）(Marciani, 2003)及油乳化劑（oil 7.

(13) emulsion）等(Spickler and Roth, 2003)。 Presentation adjuvants 常由可分解的聚合物所組成，如聚丙烯醯澱粉微粒（polyacryl starch microparticle）以及聚乳酸-甘醇酸［poly(lactic-co-glycolic acid)］ (Stertman et al., 2004)等。將抗原包埋在佐劑聚合形成的顆粒中，可減少抗原被體內酵素快速分解、清除的可能性；此外大小（size）適當且裝載有抗原的聚合顆粒能提高被抗原呈現細胞吞噬的機會(De Magistris, 2006)。 Immunomodulation adjuvants 能藉由增加或是抑制特定的細胞激素，來調控免疫反應進行的方向（TH1 反應、TH2 反應、或 TH3 反應）(Spickler and Roth, 2003)。 TH1 反應主要活化 T 細胞及巨噬細胞，參與的細胞激素包含 IFN-γ、IL-2 及 IL-12 等；而 TH2 反應主要透過 IL-4、IL-5 及 IL-6 來激活 B 細胞分泌抗體（主要是 IgG1）；至於 TH3 反應則朝向抑制 TH1 和 TH2 途徑的發生，或是促使 IgA 的生成 (Cox and Coulter 1997; Chen et al., 2006)，例如 ISCOM（immune-stimulating complex）已被證實會促進 TH1 反應以活化細胞毒殺型 T 細胞（Cytotoxic T cell，CTL） (De Magistris, 2006)；霍亂毒素則會抑制 TH1 反應，並誘發 IgA 及 IgG 等抗體生成 (Cox et al., 2006)。 Targeting adjuvants 則具有和特定細胞結合的能力，可以增進抗原被免疫細胞辨識的機會，因此得以減少抗原的使用量，如 lectin 能夠與腸道的 M 細胞結合，施用在黏膜時能夠幫助抗原被 M 細胞運輸至底部的免疫組織，並刺激 IL-2、 IL-5、IL-10 及 IFN-γ等細胞激素生成 (Roth-Walter et al., 2005)；而 CpG oligodeoxynucleotides（CpG ODNs）可以與抗原呈現細胞上的 toll-like receptor 結合，已被證實可以幫助豬隻抵抗寄生蟲感染 (Heegaard et al., 2011)。在上述各種佐劑中，部分種類也可以被用作為黏膜性佐劑，如聚丙烯醯澱粉微粒、ISCOM、細菌毒素等，皆可以誘發腸道產生抗體，但有時這些佐劑也會造成嚴重的副作用，例如在 2004 年，瑞士 Berna Biotech 所生產的 Nasalflu流感疫苗，是以大腸桿菌的 heat-labile enterotoxin 作為佐劑而製成，雖然能有效的提 8.

(14) 升疫苗的功效，但是部分接種者卻事後出現貝爾式麻痺（Bell’s palsy）的症狀 (Mutsch et al., 2004)，最後導致產品下架的命運，因此開發黏膜性佐劑時，除了效能外，也須謹慎注意安全性的問題。. 五、IgG 結合蛋白許多微生物的成分具有佐劑的功效，例如 cholera toxin、heat-labile enterotoxin 及 CpG ODNs 等 (Cox et al., 2006)，而位於微生物表面的 IgG 結合蛋白，也被發現具有黏膜性佐劑的功效(Schulze et al., 2008)。 IgG 結合蛋白能夠以非專一性的方式與免疫球蛋白結合，並干擾其發揮正常功能，例如：阻礙嗜中性球表面的 Fc receptor 與抗體結合，使其無法吞噬病原體 (Foster, 2005)；造成補體或是 CTL 無法藉由抗體的 Fc domain 來行使後續的穿孔、溶菌等作用(Atkins et al., 2008)。微生物產生的 IgG 結合蛋白種類繁多，最著名的就是常被用來純化抗體的 Protein A 及 Protein G。Protein A 是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的細胞壁表面蛋白，具有 5 個相似的 IgG-binding domains（分別為 E、D、A、B、 C）(Atkins et al., 2008)，每個 domain 都能與 IgG1、IgG2 及 IgG4 的 CH2−CH3 區域結合(Harrison et al., 2008)。 Protein G 則是來自 Lancefield group C 及 group G 鏈球菌的表面蛋白質，包含 3 個 IgG-binding domains，各 domain 的結構分別由 2 對方向相反（anti-parallel）的 β−sheet 及中間連接的 1 個 α−helix 組成（⇑ ⇓ ჰ ⇓ ⇑），並都能與 IgG 的 CH2−CH3 區域結合(Stone et al., 1989)。由於 Protein G 具有與 IgG3 結合的能力，故在純化 IgG 的應用上比 Protein A 更為普遍(Harrison et al., 2008)；Protein A 及 Protein G 對於不同物種的 IgG，其實有不同的作用力，像 Protein A 無法與馬、山羊及綿羊的免疫球蛋白結合，而 Protein G 則無法與狗及貓的免疫球蛋白結合(Nielsen et al., 2004)。 9.

(15) 會感染牛隻乳腺細胞的減乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae，Lancefield group C），其細胞表面上的 Mig 蛋白（α2−macroglobulin/IgG receptor）與 Protein G 皆屬於 type-III IgG-binding receptor，能夠與 α2−macroglobulin（α2−M）及 IgG Fc domain 結合（圖二、A）。α2−M 是一種分子量高達 725 kDa 的巨大球蛋白 (Deby-Dupont et al., 1994)，當鏈球菌藉由表面 Mig 吸附 α2−M 時，能夠減少鏈球菌被 neutrophils 吞噬的機會(Valentin-Weigang et al., 1990)；此外，因為 α2−M 具有抑制多種 proteases（serine−、cysteine−、aspartic−及 metalloprotease）的活性，與 α2−M 的結合可降低鏈球菌被 proteolytic 酵素分解的機會 (Moncino et al., 1991)。另外一種屬於 Group C 的鏈球菌，其表面的 FAI 蛋白質具有與纖維蛋白原、白蛋白及 IgG（fibrinogen/albumin/IgG receptor）相結合的能力（圖二、B），而三個 binding domain 是相互重疊的。此鏈球菌能藉由 FAI 與白蛋白的作用，在血液中被運送到各組織部位 (Stork et al., 2007)；而 FAI 與纖維蛋白原結合時，能幫助鏈球菌減少被宿主免疫系統辨識的機會(Talay et al., 1996)。上述的 IgG 結合蛋白除了可使用於抗體的純化應用之外，也能夠作為強化抗原免疫原性（immunogenicity）的佐劑，如 Zhao et al. (2005)將 Protein A 的 IgG-binding domain 與抗原形成融合蛋白質（fusion protein）並將該融合蛋白注射於小鼠皮下部位，結果激活的抗體效價達到為對照組（未施用 IgG 結合蛋白組）的 6 倍。Schulze et al. (2005)則將 ovalbumin（OVA）與 FAI 形成融合蛋白質後，透過鼻腔途徑對小鼠施藥，結果發現其肺部及血液中 OVA 的抗體效價分別達到對照組（僅施用 OVA 組）的 4 倍及 5 倍，顯示 FAI 蛋白質除了可協助強化體液免疫（humoral immunity）之外，也能夠作用於黏膜免疫系統（mucosal immunity），因此具有口服疫苗佐劑的應用潛力。. 10.

(16) 六、疫苗的接種方式以針頭注射至體內的疫苗（如皮下、肌肉或腹腔內注射）常可以誘發良好的系統性免疫反應，但是對於以黏膜為攻擊路徑的病原體，血液內的抗體並無法在感染位置對病原體發揮作用(Neutra and Kozlowski, 2006)。而黏膜疫苗除了能在黏膜部份誘發 IgA 生成外，還能引發系統性的 IgG 生成，甚至可以刺激 CD8+ T 細胞分化成 CTL，進一步抵抗病原體的入侵(De Magistris, 2006)。EV71 已知能藉由消化道入侵人體其他組織，其外鞘蛋白 VP1 能夠抵抗胃液的分解(Chen et al., 2008)，因此若是能以口服的方式刺激腸道中的黏膜性免疫反應，便能降低被 EV71 感染的機會。此外，口服疫苗不需要使用針頭的方式能夠降低接種成本及技術要求，在兒童間的接受度也高於注射型疫苗，而其容易服用的方式還能夠減少醫療人員的操作，上述的優勢皆有利於 EV71 口服疫苗的推廣(Munro et al., 2007)。. 七、研究目的 EV71 的感染會引發神經性的併發症，甚至導致死亡，目前尚無抗病毒的特定藥物，開發出腸病毒疫苗具有急迫性。由於 EV71 主要是經由黏膜組織入侵人體，因此若是能開發兼具活化黏膜免疫和體液免疫的口服疫苗，則不僅可增進人體對 EV71 的抵抗能力，也可減少被感染的機會。本研究的主要目的即是以大腸桿菌表現生產 VP1 重組蛋白質，並透過對小鼠的餵食試驗來評估 rVP1 作為口服疫苗的可行性。此外，我們也將 VP1 分別與 FAI3 及 Mig(IgG)兩種 IgG 結合蛋白進行融合，以分析兩種 IgG-binding proteins 是否具備口服佐劑的效能。. 11.

(17) 貳、研究材料與方法. 一、表現載體的選殖、建構與轉形 (A) pET14b/VP1 的取得本研究所使用的 pET14b/VP1 表現載體（圖三）是由施信如教授（長庚大學醫學生物技術暨檢驗學系）所提供，VP1 基因全長共 891 bp，透過 NdeI 及 BamHI 限制酵素切位裝載入 pET14b 質體，其中 VP1 的序列經定序結果與 GenBank AB204853 相同。. (B) pET20b/VP1-FAI3 的建構本實驗所使用的 FAI3 基因序列原裝載於 pMG3 質體內，由 Dr. Susan R. Talay （Helmholtz Centre for Infection Research, Germany）提供，由於該質體中 FAI3 基因的兩端並無限制酵素切位，故我們透過 5’-GGGGATCCGGTAGCAACACTA TTG-3’及 5’-GGGTCGACCAGAACTTTATTTCTTTCATCTAATG-3’兩種引子（底線標示分別為 BamHI 及 SalI 限制酵素的切位），經 PCR（25 mM TAPS pH 9.3, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM β-mercaptoethanol, 200 nM primer, 200 μM dNTPs, 1 ng plasmid DNA, 1 U taq DNA polymerase；過程為 95°C/3 分鐘，1 循環；95°C/30 秒、60°C/30 秒、72°C/30 秒共 35 循環；72°C/10 分鐘，1 循環；4°C/10 分鐘，1 循環）步驟複製 FAI3 基因序列，並將其兩端修飾為 BamHI 和 SalI 限制酵素切位。由於 pET14b/VP1 表現載體的限制酵素切點並不符合本實驗建構新表現載體的需求，因此我們藉由 NdeI 及 BamHI 限制酵素切位將 VP1 基因殖入 pUC19 質體內，方法如下：將 pUC19（50 ng）及 VP1 基因序列依莫耳數 1：5 的比例混合，並以無菌去離子水將最終體積調整為 10 μL，經 60°C 水浴槽作用 10 分鐘後，隨即置於冰上降溫。之後加入 400 U 的 T4 ligase（NEB M0202S）及 2 μL 的 10 x T4 ligation buffer（NEB B0202S），並調整最終體積至 20 μL，於 16°C 的恆溫槽 12.

(18) （Boekel 260014）內反應過夜，成功接合的載體即成為 pUC19/VP1。將上述複製的 FAI3 基因片段以 BamHI 及 SalI 限制酵素切割並組裝於 pUC19/VP1 載體內，經限制酵素切割及瓊脂膠體電泳分析後，挑選接合成功的 pUC19/VP1-FAI3。再藉由 NdeI 及 SalI 限制酵素切位將 VP1-FAI3 基因片段切出組裝於 pET20b 載體中，建構出 pET20b/VP1-FAI3 表現載體，經限制酵素切割、瓊脂膠體電泳分析及 DNA 定序確認後，置於-20°C 凍箱保存。. (C) pET20b/VP1-Mig(IgG)的建構為了選殖 Mig(IgG)基因序列，我們從生物資源保存及研究中心（新竹，臺灣）購買減乳糖鏈球菌（BCRC 12577），抽取其 genomic DNA，並以 5’-GG GGATCCACTTACAAACTTATTGTTAAAGGTAAC-3’和 5’-GGGTCGACGAA CCATTTCAGTTACCG-3’兩種引子，透過 PCR 複製 Mig(IgG)的基因序列，再透過 BamHI 及 SalI 限制酵素切位將其殖入 pET20b/VP1 內，並挑選建構成功的 pET20b/VP1-Mig(IgG)表現載體。. (D) pET20b/FAI3 的建構將上述建構好的 pET20b/VP1-FAI3 作為模板，以 5’- GGCATATGGGTAGCA ACACTATTG-3’及 5’-GGCTCGAGCAGAACTTTATTTCTTTCATCT-3’兩種引子，經過 PCR 複製 FAI3 基因序列，再透過 NdeI 及 XhoI 限制酵素切位殖入 pET20b 質體內，隨後挑選建構成功的 pET20b/FAI3。. (E) pET20b/Mig(IgG)的建構取 pET20b/VP1-Mig(IgG)為模板，以 5’-GGCATATGACTTACAAACTTATTG TTAAAGGTAAC-3’及 5’-GGCTCGAGAACCATTTCAGTTACCG-3’兩種引子進行 PCR 反應，隨後將 PCR 產物透過 NdeI 及 XhoI 限制酵素切位組裝於 pET20b 13.

(19) 質體中，最終形成 pET20b/Mig(IgG)表現載體。. (F) 將表現載體轉型至表現菌株以 DNA/RNA extraction kit（Viogene GF1002）抽取表現載體 DNA，經光電比色計（J&H Nanodrop-1000）定量後，取 1 ng 載體 DNA 及勝任細胞，加入已預冷且寬度為 1 mm 的電穿孔反應管（BIO-RAD 165-2089），在電壓為 1.25 kV、電阻為 200 Ω 及電容為 25 μF 的條件下進行電穿孔反應（BIO-RAD gene pulser II）。完成後，加入 1 mL LB 培養液於電穿孔反應管內，混合均勻後，吸出於新的培養液管中，置入於 37°C 生長箱內振盪培養一小時。隨後在無菌操作台內吸取 50 μL 菌液，均勻塗抹於含適當抗生素的固態培養基表面，待菌液風乾後即倒置在 37°C 生長箱培養過夜，隔天觀察菌落生長的情形。. 二、重組蛋白質的的誘導表現與純化 (A) 重組蛋白質的誘導表現將含有表現載體的表現菌株，取單一菌落接種至含抗生素的液態 LB 內，經 37°C 過夜培養後的菌液，稱之為 preculture cells。隔天取 100 μL preculture cells 加入 10 mL LB 內，培養至 OD600 達 0.6~0.8 時，添加 IPTG 至最終濃度分別為 0、 3、10、30、100、300、1,000 μM，進行 4 小時的重組蛋白質誘導反應。將完成誘導表現重組蛋白質的各菌液，分別取 1 mL 加入微量離心管內，在室溫下以 16,000 xg 離心 1 分鐘，去除上清液，之後加入 1 mL 的 1 X SDS-sample buffer ( 62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol ) 至微量離心管內，在冰浴的環境下以超音波均質機（Misonix Ultrasonic cell disruptor XL）進行破菌 30 秒及休息 30 秒的 2 次循環操作（功率輸出設定為 4W）。隨後將微量離心管置於 95°C 水浴槽內加熱 5 分鐘，再於室溫下以 16,000 xg 離心 10 分鐘，上清液即為細菌蛋白質萃取液，並額外添加 bromophenol blue（BPB） 14.

(20) 至最終濃度為 0.025%，以利後續的電泳分析。. (B) SDS 膠體電泳分析將厚度為 0.75 mm 的 SDS-PAGE 組膠套件（Amersham Biosciences multiple gel caster）架設完畢，配製並依序注入 12% separating gel 及 4% stacking gel，待凝膠後，將膠片組裝於 SDS 電泳槽（Hofer SE 260）內並以固定夾確保緊密，隨後將 SDS running buffer 注入至電泳槽內，拔除樣品梳並添加蛋白質樣品，調整電源供應器（EC 250-90）為 120 V 固定電壓、電流最大值為 500 mV 的條件下啟動蛋白質電泳，當電泳指示劑 BPB 接近膠片最底端時關閉電源，取出膠片並在右下角切去些許膠塊以做標記。將上述電泳完畢的膠片置於含有 CBB 染劑（0.2% CBB-R250, 50% methanol, 10% acetic acid）的玻璃盒內，於室溫、50 rpm 條件下染色 1 小時，之後回收 CBB 染劑並以一級退染液（50% methanol, 10% acetic acid）搖洗膠片 20 分鐘，再置換成二級退染液（5% methanol, 7% acetic acid）搖洗，並加入適量的擦手紙用以加速染劑移除速率，直到膠體背景呈現透明，而蛋白質條帶明顯時就可以停止退染，並以照相機記錄檔案（Canon PowerShot S5）。. (C) 重組蛋白質的免疫染色分析（Immunoblotting；Western blotting）將蛋白質樣品以 SDS-PAGE 分離後，從下往上的順序將海綿、濾紙（Whatman #1）、硝化纖維膜（Nitrocellulose，PALL 66485）、電泳膠片、濾紙及海綿進行組疊，再置入含有 electroblotting buffer（192 mM glycine, 25 mM Tris base, 20% methanol）的轉漬電泳槽（Hofer TE 22）內，以 40 V 的電壓進行 30 分鐘轉漬。將轉漬完成的硝化纖維膜浸泡在 ELISA blocking buffer （10 mM Na-phosphate pH 7.4, 140 mM NaCl, 1% BSA, 0.02% NaN3）中 1 小時，隨後以 ELISA wash buffer （10 mM Tris-HCl pH 8, 0.05% Tween-20, 0.01% NaN3）進行 10 分鐘搖洗，總共 15.

(21) 二次。將硝化纖維膜置於水平石臘膜上，於室溫下加入適量 1 級抗體反應 1 小時，再以 ELISA wash buffer 進行 10 分鐘搖洗兩次，隨後依序進行 2 級抗體反應、搖洗（10 分鐘兩次）及 3 級抗體反應、搖洗等步驟。最後將硝化纖維膜浸泡在 Western substrate buffer（100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2）內平衡 15 分鐘，隨後取出置於水平的石臘膜上，並加入 AP 受質（BCIP 166 μg/mL, NBT 333 μg/mL in Western substrate buffer）與進行避光呈色反應。當呈色清楚時便將硝化纖維膜移置於清水中沖洗，隨後將硝化纖維膜夾在擦手紙內，並以玻璃板壓平風乾，最終置於護貝膜中保存。進行免疫染色時，若使用的 1 級抗體是兔的抗血清時，則 2 級抗體與 3 級抗體分別是 1 μg/mL goat anti-rabbit Ig（GAR；Jackson 111-005-003）與 3 x 104 倍稀釋的 rabbit anti-goat Ig-AP（RAG-AP；Sigma A4187）；當使用的 1 級抗體是小鼠抗體時，則 2 級抗體與 3 級抗體分別是 3 μg/mL 的 rabbit anti-mouse Ig（RAM）與 3 x 104 倍稀釋的 goat anti-rabbit Ig-AP（GAR-AP；Sigma A3687）。而 ELISA diluent buffer（10 mM Na-phosphate pH 7.4, 140 mM NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween-20, 0.02% NaN3）則是用以稀釋、配製抗體樣品的緩衝溶液。. (D) 重組蛋白質的誘導表現及萃取取 1 mL 的 preculture cells 加入至 100 mL 的 LB 內進行培養，當 OD600 達 0.6~0.8 時添加適量的 IPTG 進行表現誘導反應 4 小時，隨後將菌液於 4°C 下以 5,000 xg 離心 15 分鐘，移除上清液，並加入 10 mL Ni-NTA native binding buffer （20 mM Tris-HCl pH 7.8, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole）懸浮菌體，再於冰浴環境下以超音波均質機進行破菌 20 秒及休息 40 秒的 10 次循環操作（功率輸出設定為 6W）。隨後於 4°C 下以 16,000 xg 離心 20 分鐘，上清液即為細菌的水溶性蛋白質，並保存沉澱物。 16.

(22) 將上述的沉澱物先以 10 mL 的 Ni-NTA native binding buffer 懸浮清洗，於 4°C 下離心（16,000 xg）20 分鐘，倒去上清液，再以 5 mL 的 Ni-NTA denature binding buffer（6 M urea, 20 mM Tris-HCl pH 7.8, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole）懸浮沉澱物，並於 4°C 下過夜振盪溶解。隔天於 4°C 下離心（16,000 xg）20 分鐘，得到的上清液即為細菌的非水溶性蛋白質樣品。. (E) 重組蛋白質的吸附管柱純化在純化重組蛋白質前，先依序以 6~10 mL 的 strip buffer（20 mM Tris-HCl pH 7.9, 100 mM Na2EDTA, 500 mM NaCl）與 10 mL 的去離子水清洗 Ni-NTA（Sigma P6611）管柱，再加入 10~15 mL 的 charge buffer（50 mM NiSO4）使鎳離子和膠體作鍵結，爾後以 6~10 mL 的 Ni-NTA native binding buffer 平衡管柱。將蛋白質樣品以 0.22 μM 孔徑的濾膜（Millipore SLGS025NB）過濾後，添加至 Ni-NTA 管柱內，並將流出的蛋白質濾出液再次流過管柱，隨後加入 6~10 mL 的 Ni-NTA denature binding buffer 平衡管柱，再以 20 mL 的 Ni-NTA denature wash buffer（6 M urea, 20 mM Tris-HCl pH 7.8, 0.5 M NaCl, 60 mM imidazole）清洗管柱，最終以 6~10 mL 的 Ni-NTA denature elute buffer （6 M urea, 20 mM Tris-HCl pH 7.8, 0.5 M NaCl, 1 M imidazole）沖洗出吸附的重組蛋白質。當純化結束後，以 10 mL 的 strip buffer 清洗管柱，並額外在管柱內添加 5 mL 含 0.02% NaN3 的 strip buffer，將管柱存放於 4°C 中。若被純化的重組蛋白質是以水溶性形式存在，則上述的純化過程中依序改用下列各溶液：Ni-NTA native binding buffer、Ni-NTA native wash buffer（20 mM Tris-HCl pH 7.8, 0.5 M NaCl, 60 mM imidazole）及 Ni-NTA native elute buffer（20 mM Tris-HCl pH 7.8, 0.5 M NaCl, 1 M imidazole）。. 17.

(23) (F) 重組蛋白質的回收率統計將不同純化階段的細菌蛋白質樣品，先以 Lowry method (Lowry et al., 1951; Markwell et al., 1978)的方式來推算蛋白質含量，其作法是將 1 mL 冰冷的丙酮添加至 250 μL 各純化階段之蛋白質樣品內，均勻混勻後於-20°C 下靜置 10 分鐘，隨後於 4°C 下離心（16,000 xg）10 分鐘，去除上清液及等待蛋白質沉澱物風乾，再以 reagent A（2% Na2CO3, 0.16% Na,K-tartrate, 0.4% NaOH, 1% SDS）回溶至 250 μL，同時也將 BSA 標準品（2 mg/mL in PBS）稀釋至 0、20、40、60、80、 100 μg/mL 的濃度，並以 reagent A 調整最終體積為 250 μL，隨後添加 750 μL 以 reagent A 及 reagent B（0.4% CuSO4）比例為 100：1 的混合溶液至待測樣品及 BSA 標準品內，均勻混勻後於室溫下靜置 10 分鐘，再於各管加入 75 μL Folin & ciocalteu’s phenol reagent（ICN Biomedical 61179），於室溫下靜置 45 分鐘後，藉由分光光度計（Amershan-Pharmacia Novaspec II）測定各管 OD710 之吸光值。最後以 BSA 標準品所建立的蛋白質濃度吸光值標準曲線，回推各細菌蛋白質樣品的蛋白質含量。此外，我們也藉 SDS-PAGE 及影像分析來推算 rVP1 的含量：將 0.5、1.0、 1.5、2.0、2.5 μg 的 BSA 標準品及各純化階段之蛋白質樣品，經 SDS-PAGE 及 CBB 染色後，以影像分析系統將 SDS-gel 上 BSA 及 rVP1 的染色密度進行量化分析，隨後將 BSA 標準品所測得之染色密度對應其實際含量，建立標準曲線，並依此標準曲線回推 rVP1 的含量。若將上述 Lowry method 所測得的蛋白質含量設定為 A，藉由 SDS-PAGE 及影像分析所測得的 rVP1 含量為 B，則 B/A 代表同一樣品中 rVP1 的含量比例。. 三、重組蛋白質的的結合能力測試 (A) 對免疫球蛋白的結合能力測試我們以 ELISA 的方式來檢測本研究生產的重組蛋白質是否具備與免疫球蛋 18.

(24) 白相結合的能力。首先將 Ni-NTA 管柱純化、冷凍乾燥的重組蛋白質樣品以 borate saline（200 mM boric acid, 50 mM sodium borate, pH 8.5）回溶，並調整其最終濃度為 0.25 nM。取 50 μL 重組蛋白質樣品分別加入 96 孔盤（Costar EW-01959-20）中，並將其置於 4°C 中過夜培養，隔天先進行三次 ELISA wash buffer 清洗，再於各孔內加入 180 μL ELISA blocking solution，室溫下作用兩小時後，進行 ELISA wash 步驟，再於各孔中加入 50 μL 三萬倍稀釋的 1 級抗體，室溫下作用 1 小時後，再進行 ELISA wash 步驟，之後即可於各孔中加入 50 μL pNPP 溶液（Sigma S0942, 0.6 mg/mL in ELISA substrate buffer），待於室溫下呈色 1 小時後，即以分光光度計（Bio-Tek MQX220）測量各孔的 OD405-490 讀值。每次實驗的分析樣品都有 4 個重複次數。當使用 MAR-AP（Santa Cruz Biotech sc-2358）為 1 級抗體時，同次實驗選用 NIR（Simga I5006；10 μg/mL）作為正對照組；當使用 RAM-AP（Sigma A4312）或 GAM-AP（SouthernBiotech 1010-01）作為 1 級抗體，則使用 NIM（Sigma I5381； 10 μg/mL）作為正對照組。. (B) 對小鼠脾臟細胞的結合能力測試使用 Lightning-LinkTM Fluorescein Conjugation Kit（Innova Bioscineces 707-0010）將螢光素（FITC）分別與三種純化後的重組蛋白質［rVP1, rVP1-FAI3, rVP1-Mig(IgG)］進行共價鍵結，標定後的重組蛋白質樣品與等體積的 99%甘油混和均勻，置於 4°C 中避光保存。各重組蛋白質樣品的最終濃度為 1 mg/mL。以頸椎脫臼犧牲 BALB/c 小鼠，取出脾臟置於培養皿中，加入 5 mL 含 2% FBS 的 PBS（PBS-FBS），再以針筒內柱輕擠脾臟使其細胞釋出，隨後加入 15 mL PBS-FBS 使樣品體積為 20 mL，於室溫下離心（400 xg）5 分鐘，之後以 20 mL PBS-FBS 重複上述細胞清洗步驟一次，再將細胞懸浮於 5 mL PBS-FBS 中，以血球計數器計算細胞濃度後，使用 PBS-FBS 將細胞濃度稀釋成 1 x 107 cell/mL。 19.

(25) 取 4 個 0.5 mL 微量離心管，各加入 250 μL 前述的脾臟細胞樣品，並分別加入 2.5 μL 各完成 FITC 標記的重組蛋白質樣品或是 PBS（負對照組），再置於 37°C 培養箱內旋轉反應 1 小時。之後將細胞樣品離心（400 xg）5 分鐘、吸去上清液、並以 250 μL PBS 重新懸浮細胞，最後分別吸取 50 μL 各組細胞樣品至 96 孔盤內，並使用螢光倒立顯微鏡（Leica M205 FA）及影像軟體（MetaMorph）進行觀察及記錄。. 四、小鼠的口服餵食實驗 (A ) 餵食流程從國家實驗研究院動物中心購買 4 週齡 BALB/c 雌鼠 20 隻，隨機分成 4 組，於台師大動物房中飼養至 6 週齡時，每組小鼠分別以餵食針餵食 rVP1、rVP1-FAI3、 rVP1-Mig(IgG)及 PBS，首次餵食當天設定為「第 0 天」，本實驗分別於第 0、7、 14、21、51 及 81 天時進行餵食，每次重組蛋白質的餵食量皆為 1.5 nmole/100 μL ［rVP1 為 60 μg、rVP1-FAI3 為 75 μg、rVP1-Mig(IgG)為 90 μg］。. (B) 分離血液的抗體在餵食過程的第 10、24、40、56、72、80、84 及 86 天時，將小鼠置於自製的固定盒內，以採血針穿刺小鼠尾巴基部，吸取血液 1~2 μL 並添加於 50 x 體積的 ELISA diluent buffer 中，在 4°C 下以 16,000 g 離心 20 分鐘後，保留上清液並加入 2%(w/v)NaN3，使其最終濃度為 0.02%，此溶液即為血液的抗體樣品，保存於-20°C 凍箱中。. (C) 分離糞便的抗體在飼養小鼠的過程中每天收取小鼠的新鮮糞便，並保存在-70°C 凍箱中。在餵食程序完成後，將第 0、3、7、10、14、17、21、24、28、35、42、51、54、 20.

(26) 56、58、61、66、73、81、84 及 86 天的糞便經真空乾燥後，以 0.4 g/mL 的比例加入 extraction buffer（0.01% NaN3 and 1 mM EDTA in PBS），於 4°C 下過夜振盪溶解後，離心（16,000 xg，4°C）15 分鐘，收集上清液並添加等體積 PBS 進行 2 倍稀釋，再加入 NaN3 使其最終濃度為 0.02%，此溶液即為糞便的抗體樣品。. (D) 分析血液及糞便中的 VP1 抗體將經 Ni-NTA 管柱純化的 rVP1 以 borate saline 稀釋成 10 μg/mL，各取 50 μL 分別加入 96 孔盤內，再將 96 孔盤置於 4°C 中過夜培養。隔天先進行 BSA blocking 及 wash 的步驟後，再分別加入實驗小鼠的「血液抗體」樣品或「糞便抗體」樣品，經於室溫下作用 1 小時、清洗過程後，再加入 RAM-AP（1:30,000 in ELISA diluent buffer）及室溫下反應 1 小時，再次清洗後，即加入 pNPP 受質呈色 1 小時，並以分光光度計記錄 OD405-490 讀值。. 五、抗血清的製作與分析 (A) rVP1 抗原的製備為了獲得高純度的 rVP1 蛋白質，我們將經 Ni-NTA 管柱純化的 rVP1 加入樣品槽為 6.8 cm 寬的 12% SDS 膠片中，於電泳分離及 CBB 染色後，以解剖刀切下 40 kDa 位置的蛋白質膠條，並放置於去離子水內搖洗，每次 30 分鐘，共 4~6 次。隨後以解剖刀將膠條切成體積約 1 mm3 的細膠塊。以鑽孔器將透析膜(CelluSep 1230-25)切取成圓片，組裝於 elution cell 內，並用藥杓將含蛋白質的膠塊置入 elution cell 的 loading well (粗孔端)內，再加入 soaking buffer（2% SDS, 400 mM NH4HCO3）至剛好覆蓋小膠塊之高度，隨後從 soaking buffer 上緣輕緩添入 elution buffer（0.1% SDS, 50 mM NH4HCO3）至比「水平連接道」之最上端稍高的位置。將 elution cell 移入 elution tank（C.B.S. Scientific ECU-040）內，並添加 elution 21.

(27) buffer 至較 drain troughs 最低處稍高的水位，再以 elution buffer 填滿 mixing tank。隨後將 peristaltic pump 的兩端分別與 elution tank 與 mixing tank 連接，並控制流向與流速使 elution buffer 於 mixing tank 端以「滴流」方式回流至 elution tank 端。當蛋白質小膠塊浸泡於 soaking buffer 中達 3~5 小時後，將 elution tank 上之電極與電源供應器連接，以 50 V 的電壓通電 12~16 小時，並記錄通電開始與結束的時間及電流。通電結束後，取出 elution cell 置於乾淨的 petri dish 上。利用玻璃滴管小心吸取藍色的蛋白質溶液，加入於 0.5 mL 微量離心管中。之後將蛋白質溶液置於 MCWO 為 12-14 kDa 的透析袋（CelluSep 1230-25）內，以去離子水於 4°C 進行透析，每 2 小時換水一次，連續透析 4 次以上。透析完成後則將蛋白質樣品分裝至微量離心管中，藉 SpeedVac sc110 進行濃縮乾燥，最終取少部分樣品與 BSA 標準品進行 SDS-PAGE 分離與 CBB 染色，並透過影像處理系統進行蛋白質定量分析。. (B) 紐西蘭白兔之免疫注射取 100 μg 上述藉 electroelution 方式純化的 rVP1 回溶至 1 mL 去離子水中，並與等體積的 Freund’s complete adjuvant（CFA；Sigma F5881）乳化均勻，再將抗原各以 500 μL 注射至大白兔兩側的大腿肌肉內，其餘則各以 100 μL 注射在背部兩側的皮下組織中。一個月後進行第二次免疫注射，除了佐劑更改為 Freund’s incomplete adjuvant （IFA；Sigma F5506）外，注射劑量及方式皆與第一次注射相同。再兩週後進行第三次注射，抗原劑量、注射方式都與前兩次相同，但不添加任何佐劑，抗原是直接溶在 2 mL 去離子水中，注射後三天即可進行採血。間隔前次採血一個月時，兔子再次進行兩劑抗原的追加注射，第 1 劑為含有 IFA 的抗原，兩週後再注射不含佐劑的第 2 劑抗原，注射的方式與抗原劑量每次 22.

(28) 皆與前述資料相同，第二劑追加注射後的第 3 天便進行採血，依循相同的模式，本實驗的兩隻兔子（V 和 P）都經過三次追加抗原注射及採血，故每隻兔子都被採血 4 次。. (C) 抗血清的分離及保存將採集自耳部的血液收集於 50 mL 離心管中，於室溫下靜置 1~2 小時後，以細長的金屬藥勺將血塊與離心管內壁分離，並於 4°C 靜置過夜。隔天將離心管取出，於室溫下離心（2,000 xg）20 分鐘，之後收集上清液即為抗血清樣品，再次離心（16,000 xg）澄清後加入 NaN3 至 0.02%，並分裝小管保存於-20°C 凍箱中。. (D) 抗血清效價檢測本研究是藉 immunoblotting 實驗來檢測抗血清的效價，首先將經 Ni-NTA 純化的 rVP1 注入樣品槽為 6.8 cm 寬的 SDS 膠片中，經 SDS-gel 電泳分離後，將蛋白質轉漬到硝化纖維膜上。再以解剖刀將硝化纖維膜切成 4 mm 寬的膜條，估計每片膜條各含有 10 ng rVP1，隨後將兔 V 第 1 次採血得到的抗血清進行一系列稀釋（分別為 3 x 103、1 x 104、3 x 104、1 x 105、3 x 105、1 x 106 和 3 x 106 倍），做為免疫染色的 1 級抗體，另外也選用 mouse anti His-tag（MA-His）單株抗體（GE Healthcare 27-4710-01）作為正對照組，non-immune rabbit serum（NIR）作為負對照組，經過 2、3 級抗體作用及呈色後，將硝化纖維膜風乾並保存。. (E) 抗血清專一性檢測本研究也是藉 immunoblotting 實驗來檢測抗血清的專一性，將經 Ni-NTA 管柱純化的 rVP1 及 ovalbumin（OVA；Sigma A5503）分別注入至 SDS-gel 中，經電泳分離及轉漬於硝化纖維膜後，以本研究生產的兔抗血清與 NIR 進行染色比 23.

(29) 較。. 六、單株抗體的生產餵食實驗結束後，隨機挑選三隻餵食不同重組蛋白質的小鼠，經頸椎脫臼後，將小鼠以 70%酒精浸潤，再於無菌操作台內取出脾臟，並以生理食鹽水沖洗出脾臟細胞。使用 50%的 PEG 1500（Boehringer Mannheim 783641 )將脾臟的 B 細胞及小鼠骨髓瘤細胞（myeloma cells）進行融合處理，之後將細胞懸浮於含 20% FBS （Hyclone SH30071.03）及 HAT（Sigma H0262）的 IMDM 培養液中，再將懸浮液滴入 96 孔盤中進行篩選培養，10 天後吸取有長出細胞群落孔穴的培養液進行 ELISA 分析，經三次分析均呈陽性反應的孔穴細胞則以 limiting dilution 的方式進行 cloning 的步驟。. 七、統計分析各實驗組的數據先以 SPSS 進行 ANOVA 檢驗，再以 Excel 進行 Fisher’s LSD 計算，經比對後若 P 值<0.05 則定義具顯著差異。. 24.

(30) 参、結果. 一、重組 VP1 蛋白質（rVP1）的誘導表現與純化本研究承蒙長庚大學施信如教授提供含有 VP1 基因（附錄一）的 pET14b 表現載體（圖三），根據表現載體的基因序列，rVP1 的分子量約為 40 kDa，一共含有 323 個胺基酸，分別由屬於 VP1 序列的 297 個胺基酸、6 個 His 胺基酸（His tag）以及屬於質體序列的 20 個胺基酸共同組成（圖四）。我們將此表現載體分別轉形至 BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、及 Rosetta(DE3)三種表現菌株中，經過 IPTG 的誘導表現，結果（圖五）顯示，BL21(DE3)pLysS 及 Rosetta(DE3)兩種菌株均能有效表現 rVP1，而 BL21(DE3)則否，因此我們的後續實驗即選用 BL21(DE3)pLysS 來生產 rVP1。除了分子量的吻合之外，我們也以 anti His-tag 的單株抗體（MA-His）為 1 級抗體進行免疫染色實驗，以進一步確認 rVP1 的正確性。圖六結果顯示 MA-His 可辨識「含有」pET14b/VP1 載體的菌液中，一分子量約為 40 kDa 的蛋白質，但無法與「不含有」pET14b/VP1 載體的菌液成分產生作用；而當作負對照組的 non-immune mouse Igs 則對兩種菌液均不會反應。為能得知誘導 rVP1 表現的適當 IPTG 濃度，我們在含 pET14b/VP1 的 BL21(DE3) pLysS 菌液中，分別添加 IPTG 至最終濃度為 0、3、10、30、100、 300 以及 1,000 μM，隨後經過 4 小時的誘導培養，以 SDS sample buffer 萃取細菌蛋白質，並進行 SDS-PAGE 分離與 CBB 染色，再使用影像處理系統對 rVP1 蛋白質的染色密度進行量化分析。結果（圖七）顯示添加 IPTG 至 10 μM 濃度即能有效誘導 rVP1 的表現；IPTG 濃度增加至 30 μM 時，rVP1 的產量到達最高峯，再增高 IPTG 濃度並不會更增加 rVP1 的表現量。本研究後續的 rVP1 誘導表現實驗即都添加 IPTG 至 30 μM 濃度。在純化 rVP1 的過程中，我們先將細菌蛋白質萃取分成「水溶性」與「非水 25.

(31) 溶性」兩部分，並進行膠體電泳分析，以檢視 rVP1 的分布位置。圖八（lane I）的結果顯示，rVP1 主要分布於「非水溶性」的萃取樣品，將該樣品通過 Ni-NTA 管柱進行吸附後，可分離得到高純度的 rVP1（圖八、lane N）。我們彙整 5 次純化過程的結果，並估測純化各階段的 rVP1 含量變化情形，結果如表三；在我們的實驗條件下，每 100 mL 菌液約可表現生成 22 mg rVP1（估算自 SDS sample buffer extract；100%），經非水溶性蛋白萃取及 Ni-NTA 管柱的吸附後，總量則分別剩下 11 mg（49%）及 6.5 mg（30%），但 rVP1 在各樣品中的相對含量（純度）則可從 SDS sample buffer extract 的 31%，提升至最後 Ni-NTA 吸附樣品的 94%。. 表三、rVP1 總量與相對含量在純化過程的變化情形 rVP1 總量. rVP1. (mg/100 mL 菌液). 相對含量(%). 全萃取＊. 21.6 ± 6.8. 31. 非水溶性蛋白萃取. 10.6 ± 2.8. 44. Ni-NTA 吸附純化. 6.5 ± 2.6. 94. 純化階段. ＊「全萃取」是指將細菌離心沉澱後，回溶於 SDS sample buffer 中，再經超音波振盪與加熱處理後所萃得的樣品. 二、VP1 抗血清的生產由於 Ni-NTA 管柱吸附純化的 rVP1 樣品中，仍存有些許其他種類的蛋白質（圖八、lane N）。為能取得更純質的免疫注射樣品，我們遂將 Ni-NTA 管柱吸附純化的 rVP1 樣品，注入具有寬 6.8 cm 樣品槽的 SDS polyacrylamide 膠片中，經電泳分離及 CBB 染色後，以刀片將含 40 kDa rVP1 的膠條切下，再進行 electroelution 的操作，獲得幾近純質的 rVP1 樣品（圖九）。 26.

(32) 將上述經 electroelution 再純化的 rVP1 樣品，對兩隻紐西蘭白兔（兔 V 及兔 P）進行一系列的免疫注射，經過四次採血後，兩隻兔子總共分離得到約 100 ml 抗血清。為要測試這些抗血清的效價（titer），我們進行免疫轉漬分析。首先將 rVP1 進行電泳分離並轉漬於硝化纖維膜上，再用解剖刀將膜片切成 4 mm 寬的膜條（估計每一膜條上含有約 10 ng rVP1），之後將兔 V 第一次採血的抗血清進行系列稀釋，作為免疫染色各膜條的 1 級抗體。實驗結果（圖十、A）顯示，兔 V 的抗血清雖然經一百萬倍的稀釋，但仍能有效偵測 rVP1 的存在；而作為負對照組的 non-immune rabbit serum（NIR）抗血清雖僅稀釋三千倍，但仍不會與 rVP1 作用。我們也檢視兩隻兔子不同次採血的效價差異，將兩隻兔子共八次採集的抗血清分別稀釋三十萬倍後，與含有 10 ng rVP1 蛋白的硝化纖維膜進行免疫染色，結果（圖十、B）顯示兩隻兔子各次採集的抗血清，其對 rVP1 作用的效價無顯著的差異。為要瞭解 VP1 抗血清的專一性，我們以免疫轉漬實驗來比較抗血清對 rVP1 及 ovalbumin 兩種蛋白質的作用性質差異，圖十一的結果顯示 VP1 抗血清在經三十萬倍稀釋後可對 100 ng rVP1 作用良好，但無法與 300 ng ovalbumin 產生任何反應，證明 VP1 抗血清的作用具有良好的專一性。. 三、IgG 結合蛋白的表現載體建構 (A) pET20b/VP1-FAI3 表現載體的構築本研究蒙德國 Dr. Susan R. Talay（Helmholtz Centre for Infection Research， Germany）提供含有 FAI3 基因的 pMG3 質體，我們先藉 PCR 技術複製 FAI3 基因，再透過 BamHI 及 SalI 限制酵素切位，將其轉殖入 pUC19/VP1 質體中，形成 pUC19/VP1-FAI3，再經 NdeI 及 SalI 限制酵素的切割後，將 VP1-FAI3 的基因片段殖入 pET20b 質體內，形成 pET20b/VP1-FAI3 表現載體（圖十二）。我們也將 27.

(33) 該質體進行瓊脂膠體電泳及基因定序分析，確認其中 FAI3 的基因序列與 GenBank 中 X84989 的序列（附錄二）吻合。此載體（圖十三、A）經於 E. coli 中表現生成的 rVP1-FAI3 重組融合蛋白質應含有 411 個胺基酸，分子量約為 50 kDa（圖十三、B）。. (B) pET20b/VP1-Mig(IgG)表現載體的構築我們從生物資源及保存研究中心（新竹，臺灣）購得減乳糖鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae；BCRC:12577）菌株，先萃取其 genomic DNA，再進行 PCR 反應複製其 Mig(IgG)的基因片段，最後透過 NdeI 及 SalI 限制酵素切位組裝於 pET20b/VP1 質體中，形成 pET20b/VP1-Mig(IgG)表現載體（圖十四、A）。該載體經基因定序分析，確認其中 Mig(IgG)的序列與 GenBank AF354651（附錄三）的序列吻合。此載體在 E. coli 內表現生成的 rVP1-Mig(IgG)重組融合蛋白質應含有 512 個胺基酸，分子量約為 60 kDa（圖十四、B）. 四、重組蛋白質的誘導、確認及純化我們將上述建構的 pET20b/VP1-FAI3 及 pET20b/VP1-Mig(IgG)二種表現載體分別轉形至 BL21(DE3)菌株內，各轉形後的菌株在 30 μM IPTG 的誘導條件下皆有特定蛋白質的表現生成（結果未顯示）。為驗證這兩種重組融合蛋白質的正確性，我們進行免疫轉漬分析，圖十五的結果顯示 His-tag 的單株抗體及 VP1 抗血清都能辨識含 pET20b/VP1-FAI3 質體的細菌萃取液中一 50 kDa 的分子；也都可以辨識含 pET20b/VP1-Mig(IgG)質體的細菌萃取液中一 60 kDa 分子；而作為負對照組的 NIM 及 NIR 則對上述兩種細菌萃取液都不會產生作用。根據免疫染色的結果，再者誘導生成的蛋白質都有符合預期的分子量，我們判斷 rVP1-FAI3 及 rVP1-Mig(IgG)二種重組融合蛋白質已被正確表現生成。隨後我們將含有不同重組融合蛋白的細菌萃取液分別加入 Ni-NTA 管柱中進 28.

(34) 行吸附純化，並連同先前純化的 rVP1 樣品一起進行 12% SDS gel 電泳分離及 CBB 染色，圖十六的結果顯示，三種重組蛋白樣品中，最主要蛋白質的分子量依序為 40 kDa（rVP1）、50 kDa（rVP1-FAI3）、及 60 kDa［rVP1-Mig(IgG)］。. 五、重組蛋白對免疫球蛋白的結和力測試前人研究曾報導 FAI3 (Talay et al., 1996)及 Mig protein (Song et al., 2004)具有與 IgG 結合的能力，為瞭解本研究製備的 rVP1-FAI3 及 rVP1-Mig(IgG)是否仍保有與 IgG 結合的能力，我們於是進行 ELISA 分析：實驗設計的邏輯是先在 96 孔盤中分別塗佈（coating）rVP1-FAI3 或 rVP1-Mig(IgG)重組融合蛋白質，經 BSA blocking 處理後，再加入 mouse anti rabbit Ig-AP conjugate（MAR-AP），若 coating 的重組蛋白質能與 MAR-AP 結合，則隨後加入 pNPP（AP 的受質）時將可產生呈色反應，反之則否。實驗結果（圖十七）顯示 coating rVP1-FAI3、rVP1-Mig(IgG) 及 NIR（正對照組）的各組皆能與 MAR-AP 作用，並產生呈色反應，而 coating rVP1 則不會產生呈色反應，因此可推知 rVP1-FAI3 及 rVP1-Mig(IgG)均仍保有與小鼠免疫球蛋白結合的能力。按照上述的原理，我們也測試 rVP1-FAI3 和 rVP1-Mig(IgG)是否能與其他動物的免疫球蛋白結合；圖十八的結果顯示 rVP1-FAI3 和 rVP1-Mig(IgG)亦都能與兔的免疫球蛋白作用，但卻都無法與山羊的免疫球蛋白進行反應（圖十九）。此外，我們也單獨表現生成 rFAI3 及 rMig(IgG)兩種重組蛋白質。經 SDS 膠體電泳分析的結果（圖二十）顯示，兩種重組蛋白質的分子量分別為 12 kDa（rFAI3）及 23 kDa［rMig(IgG)］。利用前述 ELISA 分析的原理，我們也進行 rFAI3 及 rMig(IgG)對各種動物 IgG 的結合力測試，結果指出兩種重組蛋白皆能與小鼠及兔的免疫球蛋白反應（圖二十一、圖二十二），但均無法與山羊的免疫球蛋白作用（圖二十三），與前述重組融合蛋白質的結果（圖十七～十九）相似。此外，單獨或是與 VP1 融合的 rFAI3 重組蛋白質，對於小鼠及兔免疫球蛋白的結和力 29.

(35) 皆高於 rMig(IgG)（圖十七、圖十八、圖二十一、圖二十二），其強度甚至與正對照組相似（圖二十一、圖二十二）。為進一步確認 rVP1-FAI3 及 rVP1-Mig(IgG)能與小鼠的免疫球蛋白結合，我們以 FITC 標記上述兩種重組融合蛋白質，再將其分別與小鼠的脾臟細胞進行共同培養反應。由於小鼠脾臟細胞表面會含有 membrane-bound Ig（mIg），若重組融合蛋白質能與這些 mIg 結合，則在藍光激發下，細胞表面將呈現綠色螢光，反之則否。我們的螢光顯微鏡觀察結果顯示，FITC 標記的 rVP1-FAI3 及 rVP1-Mig(IgG)二種重組融合蛋白質分別可與小鼠脾臟細胞作用而產生表面螢光（圖二十四、右下二圖），與 rVP1FITC 共培養或單獨培養（PBS 組）的小鼠脾臟細胞則不會有表面螢光現象（圖二十四、左下二圖）。. 六、三種重組蛋白質的小鼠餵食試驗我們將 20 隻 6 週齡的 BALB/c 母鼠分為 4 組，每組分別於第 0、7、14、21、 51 及 81 天餵食 1.5 nmole 的 rVP1（60 μg）或 rVP1-FAI3（75 μg）或 rVP1-Mig(IgG) （90 μg），對照組則僅餵食 PBS，並於特定時間採集小鼠的血液及糞便用以後續的抗體效價分析。. (A) 血液中的 VP1 抗體效價變化情形本研究是藉由 ELISA 實驗來分析血液中的抗體效價變化情形：我們先在 96 孔盤中 coating rVP1，經 BSA blocking 處理後，加入稀釋的實驗小鼠血液樣品作為 1 級抗體，隨後再加入 RAM-AP 作為 2 級抗體，最終加入 pNPP 受質進行呈色反應，並以呈色數值的高低代表小鼠血液中抗體效價的強弱情形。實驗結果（圖二十五、A）顯示，小鼠經以重組蛋白質餵食兩次後的第 10 天，血液中就可明顯偵測到 VP1 抗體的增加生成：其中餵食 rVP1 組的效價為對照組的 3.3 倍，餵食二種重組融合蛋白質的小鼠，其血液中 VP1 抗體的效價則約 30.

(36) 為對照組的 5 倍（圖二十五、A，第 10 天）。再繼續餵食 2 次（第 14 及 21 天），小鼠血液內的 VP1 抗體效價更進一步提升（圖二十五、A，第 24 天），此時餵食 rVP1、rVP1-FAI3 及 rVP1-Mig(IgG)三組小鼠的血液內，其 VP1 抗體效價分別達到對照組的 4.6、7.1 及 6.1 倍（圖二十五、A，第 24 天）。當第一個月的四次餵食結束後，血液內 VP1 抗體的有效濃度仍能持續至少 19 天，在第 40 天時，三重組蛋白質餵食組的 VP1 抗體效價都尚能維持為對照組的 4~6 倍（圖二十五、A，第 40 天）。我們在餵食試驗的第 51 天，再次進行三種重組蛋白質的餵食處理，隨後的第 5 天，小鼠血液的 VP1 抗體效價較先前上升更高（圖二十五、B，第 56 天），分別達到對照組的 10.8 倍（rVP1 組）、16 倍（rVP1-FAI3 組）及 13.3 倍［ rVP1-Mig(IgG)組］（圖二十五、B，第 56 天）。再次停止餵食重組蛋白質後，小鼠血液內的抗體效價呈漸減變化（圖二十五、B），但在第 80 天時（餵食停止後的第 29 天）仍保持有對照組的 2~4 倍效價（圖二十五、B，第 80 天）。在第 81 天時，我們進行第三個月的追加餵食試驗，3~5 天後小鼠血液的效價變化情形（圖二十五、C）與第 51 天追加餵食後的血液效價變化情形相似（圖二十五、B），rVP1、rVP1-FAI3 及 rVP1-Mig(IgG)三組的效價分別為對照組的 10.4 倍（rVP1）、17.2 倍（rVP1-FAI3）及 12 倍［rVP1-Mig(IgG)］（圖二十五、C，第 86 天）。上述結果皆顯示，融合蛋白餵食組[rVP1-FAI3 及 rVP1-Mig(IgG)]的 VP1 抗體效價明顯高於 rVP1 餵食組（圖二十五），其中的 rVP1-FAI3 餵食組的 VP1 抗體效價最高可以達到 rVP1 餵食組的 2.02 倍（圖二十五、C，第 84 天），而 rVP1-Mig(IgG)餵食組最高則為 rVP1 餵食組的 1.47 倍（圖二十五、C，第 84 天）。圖二十五中的 A、B、C 為三階段不同次 ELISA 實驗的結果，為能標準化（Normalization）各次實驗的數據，以便瞭解實驗全程的變化趨勢，我們將各天數的處理組數據除以同天的對照組數據，得到各測量值的相對變化倍率，統整後 31.

(37) 可作圖得到圖二十六，呈現血液 VP1 抗體效價在餵食第一個月期間的較緩、較弱，而在後續追加餵食期間的較快、較高變化趨勢。. (B) 糞便中的 VP1 抗體效價變化情形糞便中的 VP1 抗體效價變化情形也是藉由 ELISA 實驗進行分析，除了將 1 級抗體從血液樣品更換為糞便萃取樣品之外，其餘步驟皆與分析血液樣品的過程相同。圖二十七的結果顯示，三組餵食重組蛋白質的小鼠雖然只經過一次餵食處理（第 0 天），但其糞便中的 VP1 抗體效價於第 7 天已顯著提高，其中 rVP1 組的效價約為對照組的 2.5 倍，而餵食重組融合蛋白質 rVP1-FAI3 及 rVP1-Mig(IgG) 的二組則達到對照組的近 5 倍（圖二十七，第 7 天），第 7 天的餵食可持續提升糞便中 VP1 抗體的效價（圖二十七，第 11、14 天），第 14 天時三重組蛋白餵食組的效價分別為對照組的 3.2 倍（rVP1 組）、6.9 倍（rVP1-FAI3 組）、及 5.3 倍［ rVP1-Mig(IgG)組］。但隨後糞便中的 VP1 抗體效價開始逐漸下降，儘管第 14 天及第 21 天仍有進行二次餵食處理。到第 28 天時，糞便中的 VP1 抗體效價已下降至與對照組相似（圖二十七，第 28 天）。經過第 1 個月的四次餵食之後，第 51 天的追加餵食處理能迅速增加糞便中 VP1 抗體的效價（圖二十七，第 54、56 天），第 56 天時，三組的效價依序為對照組的 7.6 倍（rVP1 組）、14.1 倍（rVP1-FAI3 組）及 10.9 倍［rVP1-Mig(IgG) 組］（圖二十七，第 56 天），之後抗體效價再度下降，第 66 天時無法偵測到有意義的抗體活性。第 81 天的再度追加餵食反應情形與第 51 天追加餵食的結果相似，餵食三種重組蛋白質的第 3~5 天，其糞便中的 VP1 抗體效價快速增加，特別是 rVP1-FAI3 組，可高達對照組的 14 倍（圖二十七，第 84、86 天）。三種重組蛋白質於糞便中的餵食結果顯示，與 IgG 結合蛋白共同服用的餵食組[rVP1-FAI3 與 rVP1-Mig(IgG)]，其 VP1 抗體效價皆顯著高於單獨服用 rVP1 的 32.

(38) 餵食組（圖二十七），其中的 rVP1-FAI3 餵食組的 VP1 抗體效價最高可以達到 rVP1 餵食組的 2.62 倍（圖二十七，第 10 天），而 rVP1-Mig(IgG)餵食組最高則可以達到 rVP1 餵食組的 2.04 倍（圖二十七，第 10 天）。. (C) 糞便中的 rVP1 變化情形糞便中的 rVP1 同樣是經由 ELISA 實驗來進行分析：我們先在 96 孔盤內分別 coating 第 0、1、2、7、8、9、14、15、16、21、22、23、51、52、53、81、 82 及 83 天的糞便萃取樣品，經 BSA blocking 處理後，加入先前生產的 VP1 抗血清作為 1 級抗體（三千倍稀釋），隨後再添入 GAR-AP（一萬倍稀釋）作為 2 級抗體，最終加入 pNPP 受質進行呈色反應，並以呈色數值的高低代表小鼠糞便中的 VP1 含量多寡。圖二十八 A 的實驗結果顯示，小鼠在初期二次餵食（圖二十八 A，第 0 天、第 7 天）的過程中，其糞便（圖二十八 A，第 1 天、第 2 天、第 8 天、第 9 天）中皆無法偵測到 rVP1。而在第三次與第四次餵食（圖二十八 A，第 14 天、第 21 天）的結果發現，重組蛋白質餵食組［rVP1、rVP1-FAI3、rVP1-Mig(IgG)］在「餵食後第一天」（圖二十八 A，第 15 天、第 22 天）的糞便中能明顯偵測到 rVP1，餵食 PBS 的對照組則否，但是在「餵食後第二天」（圖二十八 A，第 16 天、第 23 天），其糞便中的 rVP1 含量與對照組相比已不具顯著差異。而小鼠在經過第 1 個月的四次餵食之後，第 51 天及第 81 天追加餵食的結果顯示，重組蛋白質餵食組於第 52 天及第 82 天的糞便中含有顯著的 rVP1（圖二十八 A，第 52 天、第 82 天），第 53 天及第 83 天的糞便則否（圖二十八 A，第 53 天、第 83 天），此結果與第三次及第四次餵食的過程類似（圖二十八 A，第 15 天，第 16 天、第 22 天，第 23 天），說明小鼠經過第三次餵食（圖二十八 A，第 14 天）之後，後續的餵食處理在「餵食後第一天」的糞便內能偵測到顯著的 rVP1，而「餵食後第二天」的糞便則否。 33.

(39) (D) VP1 單株抗體篩選重組蛋白質的餵食試驗進行至第 86 天時，我們犧牲部分實驗小鼠，並取其脾臟細胞與 myeloma cells 進行細胞融合，10 天後以 ELISA 方式進行 VP1 單株抗體的篩選。篩選的結果彙整於表四。rVP1-FAI3 餵食組的融合細胞共有 74 孔進入 1°篩選，其中 17 孔呈陽性反應；於 2°篩選時，陽性反應的孔數降至 5 孔，由於 precloning screening 時此 5 孔細胞皆能保有 VP1 抗體分泌能力，我們遂將其全數進行 cloning 的步驟，最終獲得 1 株單株抗體細胞株，isotyping 分析顯示其分泌抗體為 IgM，而免疫轉漬分析（圖二十九）則證實該單株抗體（MA-VP1）能辨識 rVP1。 rVP1-Mig(IgG)餵食組的融合細胞有 52 孔進入 1°篩選，其中 3 孔呈陽性反應，但在 2°篩選時僅剩 1 孔細胞仍具 VP1 抗體分泌能力，在 precloning 篩選時，該孔細胞的培養液呈陰性反應，故未能進入 cloning 步驟。rVP1 餵食組的融合細胞因在細胞培養初期即遭受汙染，故未實質進入抗體篩選步驟。. 表四、 VP1 單株抗體的篩選結果 Antigen fed Screening stage rVP1-FAI3. rVP1-Mig(IgG). 1° screening (+). 74 (17). 52 (3). 2° screening (+). 17 (5). 3 (1). Precloning screening (+). 5 (5). 1 (0). Cloning screening (+). 5 (1). 34.

(40) 肆、討論腸病毒適合在濕、熱的環境中生存與傳播，臺灣由於地處亞熱帶，因此全年都有可能發生感染的案例。EV71 的感染常造成併發重症或死亡，目前除支持療法外，尚無特效的治療藥物。為能預防 EV71 所引發的腸病毒疫情，疫苗開發是件刻不容緩的工作。前人的研究顯示 VP1 除了是 EV71 的主要表面構造成分(圖一、A；Harley, 1995)之外，也可能直接參與病毒感染寄主細胞的病理過程(Yeo and Chow, 2007)，這些特性讓 VP1 成為開發 EV71 疫苗的重要標的。許多實驗室曾嘗試以 VP1 為對象，研究 EV71 的 DNA(Wu et al., 2001)或次單元體(Chen et al., 2006; Chiu et al., 2006; Chen et al., 2008)疫苗，並獲得初步的成果，也因此支持選擇以 VP1 為開發疫苗標的之構想。然而目前 DNA 疫苗仍有疫苗劑量的不確定性和基因安全的顧慮，而 VP1 乳汁和 VP1 蕃茄則有蓄養或種植基因改造生物(GMO)的爭議，本研究考量這些現階段尚無法解決的潛在問題，於是擬以微生物生產 VP1 重組蛋白質，並藉動物餵食實驗及抗體效價分析，來評估以 VP1 重組蛋白質做為 EV71 口服疫苗的可能性。本研究特別著重「口服疫苗」的概念，主要原因是透過文獻得知，一般以針頭注入體內的疫苗或許可以有效活化動物的系統性免疫作用(systemic immunity)，但多無法讓黏膜免疫(mucosal immunity)產生作用(Neutra and Kozlowski, 2006; McGhee, 2011)；反之，透過鼻腔或消化道進入動物體內的黏膜疫苗，不但可以在疫苗進入位置引發黏膜免疫反應，亦可能激活動物體的系統性免疫反應(De Magistris 2006；Ye et al., 2011)。由於 EV71 主要是透過黏膜組織入侵人體(Wu, 2007)，發展可兼具活化「黏膜免疫」及「系統性免疫」的口服疫苗，不但可以增強人體對 EV71 的抵抗力(透過被活化的系統性免疫反應)，亦可降低人體遭受 EV71 感染的機會(透過被活化的黏膜免疫反應)。然而，口服疫苗其實未必具有預期的效果，因為腸道中含有各式水解酵素， 35.