升疫苗的功效，但是部分接種者卻事後出現貝爾式麻痺（Bell’s palsy）的症狀 (Mutsch et al., 2004)，最後導致產品下架的命運，因此開發黏膜性佐劑時，除了 效能外，也須謹慎注意安全性的問題。
五、IgG 結合蛋白
許多微生物的成分具有佐劑的功效，例如 cholera toxin、heat-labile enterotoxin 及 CpG ODNs 等 (Cox et al., 2006)，而位於微生物表面的 IgG 結合蛋白，也被發 現具有黏膜性佐劑的功效(Schulze et al., 2008)。
IgG 結合蛋白能夠以非專一性的方式與免疫球蛋白結合，並干擾其發揮正常 功能，例如：阻礙嗜中性球表面的 Fc receptor 與抗體結合，使其無法吞噬病原體 (Foster, 2005)；造成補體或是 CTL 無法藉由抗體的 Fc domain 來行使後續的穿孔、
溶菌等作用(Atkins et al., 2008)。
微生物產生的 IgG 結合蛋白種類繁多，最著名的就是常被用來純化抗體的 Protein A 及 Protein G。Protein A 是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的 細胞壁表面蛋白，具有 5 個相似的 IgG-binding domains（分別為 E、D、A、B、
C）(Atkins et al., 2008)，每個 domain 都能與 IgG1、IgG2 及 IgG4 的 CH2−CH3 區 域結合(Harrison et al., 2008)。
Protein G 則是來自 Lancefield group C 及 group G 鏈球菌的表面蛋白質，包 含 3 個 IgG-binding domains，各 domain 的結構分別由 2 對方向相反（anti-parallel）
的β−sheet 及中間連接的 1 個 α−helix 組成（⇑ ⇓ ჰ ⇓ ⇑），並都能與 IgG 的 CH2−CH3 區域結合(Stone et al., 1989)。由於 Protein G 具有與 IgG3 結合的能力，故在純化 IgG 的應用上比 Protein A 更為普遍(Harrison et al., 2008)；Protein A 及 Protein G 對於不同物種的 IgG，其實有不同的作用力，像 Protein A 無法與馬、山羊及綿 羊的免疫球蛋白結合，而 Protein G 則無法與狗及貓的免疫球蛋白結合(Nielsen et al., 2004)。
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會感染牛隻乳腺細胞的減乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae，Lancefield group C），其細胞表面上的 Mig 蛋白（α2−macroglobulin/IgG receptor）與 Protein G 皆屬於 type-III IgG-binding receptor，能夠與α2−macroglobulin（α2−M）及 IgG Fc domain 結合（圖二、A）。α2−M 是一種分子量高達 725 kDa 的巨大球蛋白
(Deby-Dupont et al., 1994)，當鏈球菌藉由表面 Mig 吸附α2−M 時，能夠減少鏈球 菌被 neutrophils 吞噬的機會(Valentin-Weigang et al., 1990)；此外，因為α2−M 具 有抑制多種 proteases（serine−、cysteine−、aspartic−及 metalloprotease）的活性，
與α2−M 的結合可降低鏈球菌被 proteolytic 酵素分解的機會 (Moncino et al., 1991)。
另外一種屬於 Group C 的鏈球菌，其表面的 FAI 蛋白質具有與纖維蛋白原、
白蛋白及 IgG（fibrinogen/albumin/IgG receptor）相結合的能力（圖二、B），而三 個 binding domain 是相互重疊的。此鏈球菌能藉由 FAI 與白蛋白的作用，在血液 中被運送到各組織部位 (Stork et al., 2007)；而 FAI 與纖維蛋白原結合時，能幫助 鏈球菌減少被宿主免疫系統辨識的機會(Talay et al., 1996)。
上述的 IgG 結合蛋白除了可使用於抗體的純化應用之外，也能夠作為強化抗 原免疫原性（immunogenicity）的佐劑，如 Zhao et al. (2005)將 Protein A 的 IgG-binding domain 與抗原形成融合蛋白質（fusion protein）並將該融合蛋白注射 於小鼠皮下部位，結果激活的抗體效價達到為對照組（未施用 IgG 結合蛋白組）
的 6 倍。Schulze et al. (2005)則將 ovalbumin（OVA）與 FAI 形成融合蛋白質後，
透過鼻腔途徑對小鼠施藥，結果發現其肺部及血液中 OVA 的抗體效價分別達到 對照組（僅施用 OVA 組）的 4 倍及 5 倍，顯示 FAI 蛋白質除了可協助強化體液 免疫（humoral immunity）之外，也能夠作用於黏膜免疫系統（mucosal immunity），
因此具有口服疫苗佐劑的應用潛力。
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六、疫苗的接種方式
以針頭注射至體內的疫苗（如皮下、肌肉或腹腔內注射）常可以誘發良好的 系統性免疫反應，但是對於以黏膜為攻擊路徑的病原體，血液內的抗體並無法在 感染位置對病原體發揮作用(Neutra and Kozlowski, 2006)。而黏膜疫苗除了能在 黏膜部份誘發 IgA 生成外，還能引發系統性的 IgG 生成，甚至可以刺激 CD8+ T 細胞分化成 CTL，進一步抵抗病原體的入侵(De Magistris, 2006)。EV71 已知能藉 由消化道入侵人體其他組織，其外鞘蛋白 VP1 能夠抵抗胃液的分解(Chen et al., 2008)，因此若是能以口服的方式刺激腸道中的黏膜性免疫反應，便能降低被 EV71 感染的機會。
此外，口服疫苗不需要使用針頭的方式能夠降低接種成本及技術要求，在兒 童間的接受度也高於注射型疫苗，而其容易服用的方式還能夠減少醫療人員的操 作，上述的優勢皆有利於 EV71 口服疫苗的推廣(Munro et al., 2007)。
七、研究目的
EV71 的感染會引發神經性的併發症，甚至導致死亡，目前尚無抗病毒的特 定藥物，開發出腸病毒疫苗具有急迫性。由於 EV71 主要是經由黏膜組織入侵人 體，因此若是能開發兼具活化黏膜免疫和體液免疫的口服疫苗，則不僅可增進人 體對 EV71 的抵抗能力，也可減少被感染的機會。
本研究的主要目的即是以大腸桿菌表現生產 VP1 重組蛋白質，並透過對小 鼠的餵食試驗來評估 rVP1 作為口服疫苗的可行性。此外，我們也將 VP1 分別與 FAI3 及 Mig(IgG)兩種 IgG 結合蛋白進行融合，以分析兩種 IgG-binding proteins 是否具備口服佐劑的效能。
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(B) pET20b/VP1-FAI3 的建構
本實驗所使用的 FAI3 基因序列原裝載於 pMG3 質體內，由 Dr. Susan R. Talay
（Helmholtz Centre for Infection Research, Germany）提供，由於該質體中 FAI3 基因的兩端並無限制酵素切位，故我們透過 5’-GGGGATCCGGTAGCAACACTA TTG-3’及 5’-GGGTCGACCAGAACTTTATTTCTTTCATCTAATG-3’兩種引子（底 線標示分別為 BamHI 及 SalI 限制酵素的切位），經 PCR（25 mM TAPS pH 9.3, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM β-mercaptoethanol, 200 nM primer, 200 μM dNTPs, 1 ng plasmid DNA, 1 U taq DNA polymerase；過程為 95°C/3 分鐘，1 循環；95°C/30 秒、60°C/30 秒、72°C/30 秒共 35 循環；72°C/10 分鐘，1 循環；4°C/10 分鐘，1 T4 ligation buffer（NEB B0202S），並調整最終體積至 20 μL，於 16°C 的恆溫槽