抑制 Slug 促進 doxorubicin 引發 MCF-7/ADR 的細胞凋亡 34

在文獻報導中，Slug 能夠抑制細胞凋亡的相關分子，因此透過 siRNA 抑制 Slug mRMA 探討是否能夠促進細胞凋亡活性而增強 MCF-7/ADR 抗藥性細胞株對於 doxorubicin 的敏感性。如圖 3-5 所示，藉由西方墨點法分析 PARP 蛋白在 Slug

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siRNA 及分別加入 1、3、10 及 30 μM doxorubicin 作用下的表現，發現對照組的 siRNA 與 Slug siRNA 單獨作用之下都沒有 cleaved PARP 的產生。在濃度 1、3、

10 μM doxorubicin 作用下不論是對照組或者是 Slug siRNA 共同作用下亦沒有產 生明顯的cleaved PARP。然而，當藥物濃度提高 30 μM，可以清楚看到 Slug siRNA 增強doxorubicin 所引起的 cleaved PARP 的產生，並經過定量分析，Slug siRNA 作用下cleaved PARP 的產生，相較於對照組增加 2 倍。

在Slug siRNA 作用下除了誘導 cleaved PARP 的增加，同時也利用流式細胞儀 分析細胞週期，進一步佐證細胞凋亡的情況。圖3-6 (A)顯示，在 doxorubicin 作用 前，對照組MCF-7/ADR 以及受到 Slug siRNA 作用後，細胞週期並無產生任何改 變。加入30 μM doxorubicin 作用 48 小時後，對照組 MCF-7/ADR 產生明顯的 G2/M 期停滯以及少量sub-G1 的產生。受 doxorubicin 藥物作用下，在 MCF-7/ADR 中抑 制Slug 表現相較於對照組產生更明顯的 sub-G1 細胞族群。將 sub-G1 的百分比統 計後(圖 3-6 B)，對照組 MCF-7/ADR 與 Slug siRNA 單獨作用下的 sub-G1 分別為 0.47±0.11%與 0.56±0.14%，實驗顯示在 Slug siRNA 單獨作用下，並不會引起細胞 凋亡的產生。受doxorubicin 作用下的對照組 MCF-7/ADR 產生 2.66±0.72% sub-G1，

相較於藥物作用前，sub-G1 的細胞族群有顯著增加。抑制 Slug 基因表現並受到 doxorubicin 作用產生 9.53±0.56% sub-G1，相較於藥物作用下的對照組 MCF-7/ADR，

sub-G1 細胞族群亦有顯著增加。此結果顯示了 Slug siRNA 能夠增加由 doxorubicin 引起的sub-G1 細胞族群，促進細胞的死亡。

透過分析細胞凋亡下游分子caspase-3/7 的活性，可進一步確認抑制 Slug 與細 胞凋亡可能關聯性。未受到 doxorubicin 藥物作用下，Slug siRNA 作用前後的 caspase-3/7 活性並無差異。單獨以 doxorubicin 作用後，相較於未受藥物作用前的 對照組MCF-7/ADR 的 caspase-3/7 活性提升了 4.6 倍。Slug siRNA 與 doxorubicin 作用下caspase-3/7 活性相較於對照組 MCF-7/ADR 也上升了 7.8 倍(圖 3-7)，並且

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相較doxorubicin 單獨作用下的 caspase-3/7 活性顯著增加。

細胞凋亡可以透過外生性路徑(extrinsic pathway)或是經由內源性路徑(intrinsic pathway)所引起。因此，藉由 caspase-8 colorimetric assay 檢驗抑制 Slug 基因表現 並在 doxorubicin 作用下誘導的細胞凋亡是否經由外生性路徑。分別測定對照組 MCF-7/ADR 與抑制 Slug 表現的情況下經由 doxorubicin 作用 0、3、6、12、24 小 時的capsase-8 活性。實驗結果顯示 caspase-8 的活性在 doxorubicin 作用於不同時 間點以及是否受到Slug siRNA 的作用之下都沒有受到活化(圖 3-8)，藉由此結果可 以排除抑制Slug 表現造成細胞凋亡活性的增加是透過外生性路徑所引起。

3.6 抑制 Slug 增加 Bad 與 p53 的基因表現量並降低 Bcl-2 基因表現量

文獻指出，過度表現Slug 的情況下，能夠降低 caspase-6 及 DFF40 在黑色素 瘤細胞內的表現，可能減少細胞凋亡的情況(Kajita et al., 2004)。因此，透過抑制 Slug 基因表現探討在 MCF-7/ADR 細胞中是否能夠藉由促進細胞凋亡相關分子 caspase-6 及 DFF40 表現而增進對 doxorubicin 的敏感性。以逆轉錄-聚合酶連鎖反 應法觀察基因變化情形，在doxorubicin 作用前後，Slug siRNA 作用於 MCF-7/ADR 都能夠產生對Slug 基因明顯的抑制效果(圖 3-9)。caspase-6 的基因表現不論在 Slug siRNA 及 doxorubicin 作用之下，都沒有明顯變化。DFF40 在 Slug siRNA 作用的情 形下提升了1.5 倍的基因表現量，受 doxorubicin 作用後，也提高了 1.4 倍的基因表 現量，然而，在Slug siRNA 與 doxorubicin 共同作用下，與對照組 MCF-7/ADR 亦 無明顯差異。

先前的報導中也指出 Slug 能保護細胞免於受到 Bcl-2 家族中抗細胞凋亡家族 與促細胞凋亡家族的調控所引起的細胞凋亡。因此，利用即時定量-聚合酶連鎖反 應法分析了抗細胞凋亡家族Bcl-2 及 Bcl-xL、促細胞凋亡因子 Bax 與 Bak、促細胞 凋亡BH3-only 蛋白(pro-apoptotic BH3-only proteins) Bad、Bik、Bid、Bim 及 Puma，

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以及抑癌蛋白(tumor suppressor protein) p53 在抑制 Slug 基因及 doxorubicin 作用下 的基因表現。如圖3-10 所示，抗細胞凋亡家族的 Bcl-2 基因變化在 Slug siRNA 及 doxorubicin 單獨作用後有下降的趨勢，但並沒有顯著差異。然而當 Slug siRNA 與 doxorubicin 共同作用時，Bcl-2 基因表現量比對照組 MCF-7/ADR 降低 70%，且相 較於Slug siRNA 及 doxorubicin 單獨作用的 Bcl-2 表現量亦有顯著差異；另外檢測 Bcl-xL 的基因表現量，發現在 MCF-7/ADR 中受 Slug siRNA 與 doxorubicin 作用下 皆沒有產生明顯變化。促細胞凋亡蛋白Bax 與 Bak 在抑制 Slug 表現與 doxorubicin 作用下，基因表現量亦沒有產生顯著改變(圖 3-11)。促細胞凋亡 BH3-only 蛋白 Bad 的基因表現量在Slug siRNA 單獨作用後，相較於對照組 MCF-7/ADR，提升了 2.4 倍(圖 3-12)。Slug siRNA 與 doxorubicin 共同作用後，Bad 基因表現上升 3.9 倍，且 相較於doxorubicin 單獨作用的情況，Bad 基因表現量也有顯著增加。Bik 的基因表 現量在 Slug siRNA 作用的情形下，相較於對照組 MCF-7/ADR 上升 2.2 倍，受 doxorubicin 單獨作用也升高了 1.8 倍。在 Slug siRNA 與 doxorubicin 共同作用下則 提高了2.3 倍。其它促細胞凋亡 BH3-only 蛋白包括 Bid、Bim 及 Puma 在 Slug siRNA 及doxorubicin 單獨或共同作用下，基因表現量皆沒有產生顯著改變。

本實驗室先前的研究指出存在於MCF-7/ADR 中的抑癌蛋白 p53，是含有一段 21-bp 缺失(deletion)的突變型 p53 (Yu et al., 2007)。因此，我們觀察整體 p53 (total p53)與突變型 p53 (mutant p53)是否受到 Slug 作用下影響基因表現。在 doxorubicin 單獨作用下，相較於對照組 MCF-7/ADR，整體 p53 基因表現量增加為原本的 5.1 倍(圖 3-13)。在 Slug siRNA 與 doxorubicin 共同作用的情況下，整體 p53 基因表現 量增加上升34.9 倍，且相較於 doxorubicin 單獨作用於 MCF-7/ADR 的情況，也顯 著增加了6.8 倍。在抑制 Slug 下的突變型 p53 基因表現趨勢也如同整體 p53，抑制 Slug 基因表現或單獨使用 doxorubicin 都使突變型 p53 分別增加 4.5 倍及 7.3 倍。在 Slug siRNA 與 doxorubicin 共同作用下突變型 p53 基因表現，相較於對照組升高 72.6

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倍。不論是否為突變型p53，Slug 能透過轉錄調控 p53 基因表現來加強 doxorubicin 的作用。

(A)

(B)

(C)

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圖 3-1. MCF-7/WT 與 MCF-7/ADR 型態及上皮-間葉轉化標記蛋白在細胞中的表 現。

(A) MCF-7/WT 與 MCF-7/ADR 細胞型態上的變化。Nikon Diaphot 300 擷取影像，

比例尺=100 μm。(B)與(C)免疫螢光染色比較上皮標記蛋白 E-cadherin 間葉細胞標 記蛋白vimentin 在 MCF-7/WT 與 MCF-7/ADR 中的分布情形。Merge 影像包含 DAPI staining 與一級抗體。Carl Zeiss 螢光顯微鏡擷取影像，比例尺=10 μm。

(A)

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圖 Analyzer 4 ox，D: si-Sl

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