討論 - 抑制上皮-間葉轉化調控因子Slug促進doxorubicin在MCF-7/ADR抗藥性細胞株中誘導的細胞凋亡

癌症化療過程中，在各種抗癌藥物的作用下，癌細胞為了適應藥物毒性而發

展出可能的抗藥性功能，包括ABC 運輸蛋白的產生、細胞本身解毒系統的活化、

DNA 修復系統的活化，躲避細胞凋亡的能力等適應環境壓力的多重抗藥性機轉 (Gottesman et al., 2002)，同時也對藥物治療築起了一道高牆。除了上述機轉外，近年來，上皮-間葉轉化現象也被認為是與細胞抗藥性相關的現象。

文獻報告指出具有 tamoxifen 抗藥性的 MCF-7 乳癌細胞株，在型態上相較於親代細胞有較鬆散的細胞聯繫(Hiscox et al., 2006)，對於 paclitaxel、docetaxel、

doxorubicin 具抗藥性的 MCF-7 細胞同時也具有上皮-間葉轉化現象，透過基因晶片的分析，相較於 MCF-7/WT 細胞株，此三種抗藥性細胞株的間葉細胞標記蛋白 N-cadherin 、vimentin 分別增加 5-19、100-150 倍左右，上皮細胞標記蛋白 E-cadherin 也減少了300 倍左右，其它黏附蛋白(adhesion molecule)像是 claudin 3、claudin 4 及claudin 7 於抗藥性細胞株中也明顯減少，而能夠驅使上皮-間葉轉化進行的轉錄因子Slug 也增加了 9-36 倍(Işeri et al., 2011)。在本研究中，我們藉由 MCF-7/WT 與具doxorubicin 的抗藥性細胞株 MCF-7/ADR 觀察到除了明顯在細胞型態上有所差異外，藉由免疫螢光染色同時也確認 MCF-7/WT 表現出較多的上皮細胞的標記蛋白E-cadherin，而不表現間葉細胞特性的標記蛋白 vimentin； MCF-7/ADR 則呈現高度vimentin 的表現量，但只有微量的 E-cadherin。透過基因與蛋白的層級觀察 E-cadherin、N-cadherin 與 vimentin 的表現，在 MCF-7/WT 表現出相對高於 MCF-7/ADR 的 E-cadherin 基因表現；MCF-7/ADR 的間葉細胞標記蛋白 N-cadherin 與 vimentin 的基因表現相對高於 MCF-7/WT，同樣地，蛋白質表現也呈現出與基因相符的情形。這些結果可能顯示出上皮-間葉轉化與 MCF-7/ADR 對於 doxorubicin 的抗藥性相關。

上皮-間葉轉化關鍵調控因子 Snail、Slug 與 ZEB1 的表現，能透過轉錄調控驅使整個轉化過程進行。近來許多文獻也指出在抗藥性細胞株中，相較於親代細胞，

高度表現上皮-間葉轉化關鍵調控因子，Yang et al.指出具 oxaliplatin 抗藥性的 KM12L4 大腸癌細胞相較於親代細胞有更高的 Snail 蛋白表現，也具較強的侵襲能力(Yang, 2006)。將 Snail 與 Slug 過度表現於乳癌細胞中造成對 doxorubicin 的抗藥性(Kajita et al., 2004)。在 doxorubicin 作用下除了引起細胞凋亡外，也可能誘導上皮間葉轉化的現象發生，Li et al.觀察到多種上皮細胞中都存在此現象，包括肝癌細胞HuH-7、胰臟癌細胞 BxPC-3 及大腸癌細胞 DLD-1 (Li et al., 2009)。我們分析上皮-間葉轉化關鍵調控因子 Snail、Slug 與 ZEB1 的表現，發現 MCF-7/ADR 細胞株相較於親代細胞在Slug 的基因與蛋白過度表現最為明顯。雖然 ZEB1 的蛋白與基因表現量在MCF-7/ADR 中也相較高於親代細胞，但過去文獻中提到，ZEB1 可調控的分子包括integrin α4、CCNG2 與 RBL2 (Remacle et al., 1999; Chen et al., 2006)，主要功能參與細胞間的交互作用與細胞週期調控，似乎與多重抗藥性並非直接相關。在親代細胞與 MCF-7/ADR 中，Snail 的表現量不論在基因與蛋白都沒有明顯差異，可能也非造成MCF-7/ADR 抗藥性的形成原因。

Slug 屬於 Snail 家族中的一員，是能夠驅使上皮-間葉轉化的鋅指轉錄因子。

Snail 家族在生理功能上扮演原腸胚形成(gastrulation) (Ciruna and Rossant, 2001)及神經發育的功能(Mayor et al., 1995; Sechrist et al., 1995; Mayor et al., 1997)。然而，

在癌症中，Slug 不但與癌細胞的侵襲與轉移相關(Come et al., 2006; Elloul et al., 2006)，同時在大腸直腸癌中也被認為是不良預後的預測因子(Shioiri et al., 2006)。

Slug 的角色於文獻中也被指出，表現出 Slug 的癌細胞，針對表皮生長因子接受器酪胺酸激酶抑制劑(EGFR TKI)、放射線及 doxorubicin 的作用，都能夠抑制這些療法所引起的細胞凋亡(Kajita et al., 2004; Wu et al., 2005b; Chang et al., 2011)。基於上述理論，我們藉由Slug siRNA 來研究 Slug 在 MCF-7/ADR 細胞中調控抗藥性的可

能原因。實驗結果發現透過 Slug siRNA 作用於 MCF-7/ADR 細胞中，相較於 doxorubicin 單獨作用之下促進更多 cleaved PARP 蛋白的產生，藉由流式細胞儀的分析，亦觀察到 Slug siRNA 與 doxorubicin 共同作用之下，引起相較 doxorubicin 單獨作用更高量的sub-G1 細胞族群。藉由這些證據可以推斷，在 MCF-7/ADR 中，

抑制Slug 的表現確實促進細胞對於 doxorubicin 引起的細胞凋亡。

細胞凋亡，又稱為程序性細胞死亡，可分為由死亡受器所引起的外生性路徑，

或是Bcl-2 家族所調控的內源性路徑，最終都匯流於活化一連串的 caspase 瀑流反應(caspase cascade)。Caspase 瀑流反應中，由 initiator caspase，像是 caspase-8、

caspase-9，活化下游的 effector caspase，包括 caspase-3、caspase-6 及 caspase-7，

引起細胞中複雜的生化反應及細胞型態上的改變，導致細胞凋亡。因此，為了進一步分析抑制Slug 引起細胞凋亡的可能原因，透過 doxorubicin 與 Slug siRNA 的作用測定下游分子caspase-3 與 caspase-7 的活性。發現 Slug siRNA 本身並不影響 caspase-3/7 的活性，然而，在 doxorubicin 作用與抑制 Slug 表現的情況下，可以誘導出相較於doxorubicin 單獨作用下更高的 caspase-3/7 活性。透過 caspase-8 的活性分析，可以釐清Slug siRNA 本身是否促進由外生性路徑引起的細胞凋亡。實驗結果顯示出doxorubicin 及 Slug siRNA 單獨或共同作用下皆不是經由外生性路徑引起細胞凋亡的發生。Kajita et al.指出，在過度表現 Slug 的乳癌細胞中，能夠抑制 caspase-6 與 DFF40 的基因表現量(Kajita et al., 2004)。因此，透過逆轉錄-聚合酶連鎖反應法測定Slug siRNA 作用後，確認是否藉由增高 caspase-6 與 DFF40 的表現量進而加強細胞凋亡的效果。DFF40 的基因表現量在 Slug siRNA 作用後，相較於對照組的確增加了50%，然而在 doxorubicin 單獨作用或與 Slug siRNA 共同作用下並沒有產生顯著差異。

Bcl-2 家族可以分為三類型，一類是抗細胞凋亡家族，像是 Bcl-2 及 Bcl-xL，

透過抑制Bax 與 Bak，避免細胞凋亡；另一類屬於促細胞凋亡家族，包括 Bax 與

Bak，藉由形成粒線體上的孔洞，釋放 cytochrom c，與下游 caspase-9，Apaf-1 組成apoptosome，引起凋亡。最後一類是促細胞凋亡 BH3-only 蛋白家族，包含 Bad、

Bik、Bid、Bim 及 Puma 等蛋白，主要藉由調控或與抗細胞凋亡家族結合，促進細胞凋亡的進行。據文獻指出，Slug 能夠調控 Bcl-2 家族中 Bcl-2 與 Bax 的表現而抑制細胞凋亡(Tribulo et al., 2004; Vitali et al., 2008)，也能夠藉由調控 Puma 而躲過此路徑引起的程序性死亡(Wu et al., 2005b; Haupt et al., 2006)。我們藉由分析 Bcl-2 家族成員的基因改變，找出抑制Slug 基因在 doxorubicin 作用下引起細胞凋亡的可能原因。Bcl-2 在 Slug siRNA 與 doxorubicin 作用下相對降低了基因表現，然而 Bax 與Puma 的基因表現量並沒有因為 Slug 的調控而產生改變，因此 Bax 與 Puma 受 Slug 調控也可能因細胞種類的不同而有所差異。促細胞凋亡 BH3-only 蛋白 Bad 與 Bik 的基因表現在抑制 Slug 情況下則較對照組增加，且 Bad 在 Slug siRNA 與 doxorubicin 共同作用之下產生相較於 doxorubicin 單獨作用下顯著的增加基因表現；

然而，抑制Slug 雖然令 Bik 基因表現上升，但在加入 doxorubicin 情況下並不因為 Slug siRNA 的作用而更加顯著。

抑癌蛋白p53 已知能夠調控細胞分化、細胞週期、DNA 修復、老化及細胞凋亡等多種生理功能，能夠在細胞受到壓力時被誘導產生，並具有抑制腫瘤生長的功能(Vousden and Lu, 2002)。p53 於癌症中被發現大多具有基因上的突變，包含乳癌在內的多種癌症中都觀察到突變的情況(Hainaut et al., 1997; Sigal and Rotter, 2000)，並且有報導指出突變型 p53 也被認為與 DNA 損害(DNA damaging)藥物的抗藥性相關(El-Deiry, 2003)。在過度表現 Slug 的乳癌細胞中，染色體免疫沉澱試驗(chromatin immunoprecipitation)證明 Slug 能夠直接作用於 p53 基因的啟動子 (promoter)，進而可能調控 p53 基因與蛋白的表現量(Kajita et al., 2004)。由本實驗室先前的研究中已經證實在MCF-7/ADR 細胞中有突變型 p53，在 p53 基因 exon 5 具有一段21-bp 的缺失，橫跨密碼子(codon)126-132 (Yu et al., 2007)，相關文獻也

指出同樣位置21-bp 缺失能延長突變型 p53 的半衰期，且突變型 p53 相較於野生型 p53 多聚集於核內(Ogretmen and Safa, 1997)，但此突變的確切功能尚未有研究報告。

藉由測定整體 p53 與突變型 p53 受 Slug 調控的基因表現量，實驗結果顯示 doxorubicin 作用可以增加整體 p53 與突變型 p53 基因表現，並且在 Slug siRNA 作用之下能夠更加提升整體p53 與突變型 p53 的表現量，推斷 Slug 能夠透過轉錄調控p53 的表現量，不受是否為突變型 p53 的影響。這些結果代表 Slug siRNA 的作用，可能透過增加Bcl-2 家族中 Bad 基因表現，增加整體 p53 與突變型 p53 基因表現，並降低Bcl-2 的基因表現促進細胞凋亡的產生。

第五章結論

本研究中觀察乳癌細胞 MCF-7/WT 呈現出上皮細胞鵝卵石狀的外觀，而

MCF-7/ADR 則呈現似纖維母細胞(fibroblast-like)的細長型外觀。免疫螢光染色結果也顯示出 MCF-7/WT 相較 MCF-7/ADR 表現出更高量的上皮細胞標記蛋白 E-cadherin，而 MCF-7/ADR 則呈現出大量的間葉細胞標記蛋白 vimentin。同樣地，

在 E-cadherin、N-cadherin 與 vimentin 的基因與蛋白質分析，也確認 MCF-7/ADR 細胞的確經歷了上皮-間葉轉化的過程。

本研究中顯示抑制上皮-間葉轉化調控因子 Slug 能夠加強由 doxorubicin 引起的細胞凋亡現象，包括cleaved PARP 蛋白的增加，流式細胞儀分析中 sub-G1 細胞族群的增加，以及caspase-3/7 活性的上升，並透過 caspase-8 活性試驗排除由外生性路徑所引起的細胞凋亡的可能性。進一步探討Slug siRNA 與 doxorubicin 共同作用下引起的細胞凋亡機轉，結果顯示Bad 與 p53 的基因表現量相對上升，以及 Bcl-2 表現量相對降低是抑制 Slug 引起細胞凋亡的可能原因。其他分子如 caspase-6 與 DFF40，以及 Bcl-2 家族成員包括 Bcl-xL、Bax、Bak、Bid、Bim 與 Puma 並不會因為抑制Slug 而產生顯著的基因表現量改變。在 MCF-7/ADR 抗藥性細胞中，透過Slug RNA 干擾技術的應用，確實增加了抗藥性細胞對於 doxorubicin 的敏感性，

或許未來能夠當作基因治療與化療共同應用的實驗基礎。

第六章參考文獻

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Mouse breast cancer resistance protein (Bcrp1/Abcg2) mediates etoposide resistance and transport, but etoposide oral availability is limited primarily by P-glycoprotein. Cancer Research 63, 1339-1344.

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在文檔中抑制上皮-間葉轉化調控因子Slug促進doxorubicin在MCF-7/ADR抗藥性細胞株中誘導的細胞凋亡 (頁 68-88)