西方墨點法 (Western blot)

試藥：

2-Mercaptoethanol Sigma 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 ratio Bio-Rad

Ammonium persulfate (APS) Sigma

Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad Bovine serum albumin (BSA) Sigma

Bromophenol blue Sigma

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma GeneTeks PreBlue Orange Protein Ladder GeneTeks

Glycine J.T.Baker Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz

Goat anti-rabbit IgG-HRP Santa Cruz Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Millipore KODAK GBX Developer and Replenisher KODAK

KODAK GBX Fixer and Replenisher KODAK

Methanol Sigma N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad

Nitrocellulose membrane (NC membrane) Invitrogen

Potassium chloride (KCl) Sigma

Protease inhibitor cocktail tablets Roche

Restore Plus Western blot stripping buffer Thermo Scientific

Sodium chloride (NaCl) Sigma

Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma

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Tris (Base) J.T.Baker

Triton X-100 BDH

Tween-20 BDH

 Radio Immuno Precipitation Assay buffer (RIPA buffer)

NaCl 150 mM

Triton X-100 1.0% (v/v) Sodium deoxycholate 0.5% (w/v)

SDS 0.1% (w/v)

Tris (pH 8.0) 50 mM

 Laemmli 4× buffer

Tris-HCl buffer (pH 6.8) 250 mM

2-Mercaptoethanol 20% (v/v)

Glycerol 40% (v/v)

SDS 8% (w/v)

Bromophenol blue 0.016 % (w/v)

 SDS Running buffer

Tris 25 mM

Glycine 190 mM

SDS 0.1% SDS (w/v)

以HCl 調整 pH 值至 8.3。

 Transfer buffer

Tris 25 mM

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Glycine 190 mM

MeOH 20% methanol (v/v)

 Tris Buffered Saline (TBS buffer)

Tris (base) 25 mM

NaCl 137 mM

以HCl 調整 pH 值至 7.6。

 TBS-Tween-20 (TBST)

將0.1 % (v/v) Tween-20 溶於 TBS buffer。

(1) 細胞全蛋白質之抽取

細胞經藥物處理後，吸去原培養液，以 PBS 洗滌兩次，加入 trypsin 作用，輕 拍培養皿，使細胞自盤底脫離，加入新鮮培養液中和 trypsin，收集細胞，移至無 菌微量離心管以轉速2,000 rpm，2-8℃離心 3 分鐘。去除上清液，加入 42 μl RIPA buffer 和 7 μl protease inhibitor 7× stock solution，置放冰上 30 分鐘，作用時間內至 少vortex 震盪五次。將微量離心管以轉速 12,000 rpm，2-8℃離心 15 分鐘，抽取上 清液移至事先預冷的微量離心管，細胞全蛋白質放置-80℃保存。

(2) 蛋白質之定量

根 據 Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad) 所 提 供 之 Microtiter Plate Protocols。將牛血清白蛋白(BSA)與二次蒸餾水稀釋成 0、0.1、0.2、

0.3、0.4 和 0.5 mg/ml 六個濃度。蛋白質樣品以二次蒸餾水稀釋 10~50 倍後，全部 加入200 μl 1× Dye reagent 均勻混合，於室溫反應 5 分鐘，以 595 nm 波長偵測吸 光值並繪製出標準曲線，以內差法計算蛋白質濃度。

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(3) 蛋白質 SDS-PAGE 電泳法

膠體配方如下：

Stack Resolving Gel

4% X %

40% Acrylamide/Bis 0.3 ml 0.25 × X %=(A)* ml

Re-dH2O 1.91 ml (7.35─A) ml

1.0 M Tris-HCl, pH 6.8 0.756 ml

1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 2.5 ml

10% SDS (w/v) 30 μl 100 μl

TEMED 3 μl 5 μl

10% APS (w/v) 15 μl 50 μl

Total volume 3 ml 10 ml

*字母 A 表示應加入 40% Acrylamide/Bis solution 的體積。

依上表試劑鑄適當濃度resolving gel，加入乙醇壓平膠體表面。當 resolving gel 凝固後，配置4% stacking gel，插入塑膠齒模，等待凝固進行電泳。將蛋白質(30 μg) 與Laemmli 4× buffer (3:1)混合均勻，以 95℃水浴 5 分鐘，置放冰上 5 分鐘避免蛋 白質結構還原，以70 V 電泳 0.5 小時，當蛋白質進入 resolving gel 以 140 V 電泳 1 小時。

(4) 蛋白質轉漬 (Transfer)

將電泳後的膠體裁成適當大小，依電流負極到正極方向分別將海綿、濾紙、電 泳膠體、nitrocellulose membrane、濾紙、海綿依序夾於卡匣中，放置於濕式轉漬裝 置，補滿transfer buffer，以 250 mA 於 2-8℃轉漬兩小時。

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(5) 抗原-抗體交互作用

將轉漬完成後的nitrocellulose membrane 浸泡於 5% (w/v)脫脂奶粉中室溫震搖 1 小時。以TBST 清洗三次各 10 分鐘，加入一級抗體(E-cadherin、N-cadherin、vimentin、

Snail、Slug、ZEB1，1:1000，Cell Signaling。β-actin，1:3000，PARP，1:2000，Santa Cruz)於 2-8℃反應 12 小時。以 TBST 清洗三次各 10 分鐘，加入 HRP-conjugated 二級抗體室溫震搖1 小時。以 TBST 清洗三次各 10 分鐘，稍微吸乾膜上多餘的 TBST，

取適量的 Luminol Reagent and Peroxide Solution (1:1)混合均勻(1 mL/10 cm² membrane area)，等 HRP substrate 恢復到室溫，加到 nitrocellulose membrane 上，

反應 1 分鐘，覆蓋一層透光投影片，置放於壓片匣中攜至暗房。裁取適當尺寸底

片，蓋上壓片匣感光反應0.5 至 5 分鐘，取出底片浸泡於顯影劑中，待底片呈現訊 號，以水清洗數次，放入定影劑中作用，再以水清洗數次，完成壓片。將底片掃 描至電腦中，以Gel-pro Analyzer 4.0 軟體分析定量。