1. 緒論
1.4 抗氧化劑 N-acetyl-L-cysteine
N-acetyl-L-cysteine （NAC）是一種具有雙硫鍵的抗氧化劑，它不但 可以清除氧的自由基，並可補充細胞內粒線體與胞液glutathione的儲 存[22]，NAC亦被證實具有清除活化的氧化物與氮化物（reactive oxygen species and reactive nitrogen species）的能力，此外，在體外試
驗時，NAC可以藉由壓抑巨噬細胞與嗜中性白血球，減低內皮細胞的 通透性及淋巴球的附著力，及抑制發炎物質釋放例如：interleukin-8 而產生抗發炎作用。
1.5 NADPH 氧化酶（Nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate-oxidase ）抑制劑 Diphenyleneiodonium（DPI）[33-38]
NADPH氧化酶是一種存在於細胞膜上具有多種調節功能的酶，
NADPH氧化酶被證實為引發嗜中性白血球與其它具吞噬作用白血球 免疫反應中主要的複合型酶，因為引發這些免疫反應必須藉由ROS的 產生，而在吞噬細胞中NADPH氧化酶正是ROS產生時最主要的調控
因素，其作用機制如下：
NADPH + 2O2 NADP + + 2O2
.- + 2H +
2O2
.- + 2H + H2O2 + O2
O2
.-
+ H2O2 + H + O2 + H2O2 + OH.
當NADPH氧化酶成活化狀態時，DPI可與NADPH氧化酶產生非競爭 性的共價性鍵結，抑制NADPH氧化酶的作用，進而抑制ROS的產生。
1.6 研究動機
在之前的文獻中已有 Tyloxapol 毒性與其抗氧化作用的相關報導，但 Tyloxapol 與細胞作用時，所產生的細胞內分子變化，例如：細胞內 ROS 含量變化與粒線體膜電位的變化，卻無相關報導，因而引發我們 探討 Tyloxapol 與巨噬細胞 U937 作用時所產生的細胞內變化，另外我 們也選用人類子宮頸癌細胞 Hela 與 Tyloxapol 作用，比較兩種細胞間 對 Tyloxapol 所產生的變化趨勢。
第二章、材料與方法 2.1 實驗藥品與材料
1. Tyloxapol（Sigma，USA）
2. Cell counting kit-8（Dojindo Laboratories， Japan）
3. Dichlorofluorescin diacetate（DCFH-DA；Sigma，USA）
4. Hydroethidine bromide（HE；Sigma，USA）
5. Rhodamine-123 （R123；Sigma，USA）
6. Propidium iodide（PI；Aldrich Chemicals）
7. Phosphoryl buffer solution（10×PBS，biosera，USA）
8. RPMI-Medium 1640（GIBCO，USA）
9. Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM；GIBCO，USA）
10. Antibiotics（100U/mL Penicillin/ 100μg/mL Streptomycin）（GIBCO，
USA）
11. Fetal bovine serum（FBS；GIBCO，USA）
12. U937（human U937 myeloid leukemia cell line）
13. Hela（cervical cancer）
14. Typsin/EDTA（ethylenediaminetetraacetates；GIBCO，USA）
15. Lipopolysaccharides（LPS；Sigma，USA）
16. N-acetyl-L-cysteine（NAC；Sigma，USA）
17. Diphenyleneiodonium（DPI；Sigma，USA）
2.2 實驗儀器
1. 無菌操作臺（Laminar Flow；VCM-420，Taiwan）
2. 細胞恆溫培養箱（CO2 Incubator ；SANYO，MCO-17AIC，Japan）
3. 倒立式顯微鏡（OLYMPUS，CK40，Japan）
4. 桌上型離心機 （KUBOTA， 2010，Taiwan）
5. 渦旋震盪器（Scientific Industries,Inc.，Vortex-Genie 2，USA）
6. 免疫分析分光光度計ELLISA （Enzyme Linked Immunosorbent Assay）reader（TECAN，A5082，Austria）
7. BD 流式細胞儀（FACScan，Becton Dickinson， USA）
2.3 實驗製備與方法 2.3.1 配製 Tyloxapol 溶液
秤取 1g Tyloxapol，置之於 15mL 離心管中，加入 10mL 1×PBS，充分 地 vortex 使 Tyloxapol 完全溶解，製備成 100μg/μL 的溶液，靜置直到 泡沫消失後，在無菌操作台上以 0.22μm 的 filter 過濾，常溫下保存備 用。
2.3.2 Propidium iodide（PI）的製備 1. PI standard solution：
秤取 PI 粉末 20mg，將其溶於 1000μL 1×PBS 中形成濃度為 20mg/mL standard solution
2. PI 染劑(含有 40μg/mL PI 及 100mg/mL RNase A)：
從 PI standard solution 中取 100μL 到 50mL 的離心管中，再秤取 5mg
的 RNase A 到同一離心管，加 1×PBS 到 50mL，保存於 4℃下，
備用。
2.3.3 細胞保存液配製
將純酒精(99.9%)與 1×PBS 以體積比為 7：3 的方式混合，並以 0.22μm 的 filter 過濾，保存於 4℃下備用。
2.3.4 細胞培養
A、人類骨髓性白血病細胞 (human U937 myeloid leukemia cell line，
ATCC：CRL-1593.2)
本實驗所使用的細胞株來自於中山醫學大學微生物暨免疫學科 詹明修老師提供。將人類骨髓性白血病細胞U937，培養於含有 10%去補體胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），及1% 100U/mL Penicillin/ 100μg/mL Streptomycin的RPMI培養液中，使用 10cm 培養皿（cell culture dish），並將細胞置於 37℃且含有 5% CO2的 細胞恆溫培養箱中。
細胞繼代培養（subculture）
1. 當細胞株在 10cm 培養皿中，長滿至 80%~90%時，直接將 懸浮狀的細胞與培養液吸至 15mL 的離心管。
2. 用 1500rpm 離心 5 分鐘後，去除上清液。
3. 加入 1mL 的培養液將 pellet 打散。
4. 吸取離心管內約3×106的細胞至10cm 培養皿中，並在每一 10cm 培養皿中放入 10mL 的培養液。
5. 最後將此培養皿放置於37℃且含有 5% CO2的細胞恆溫培 養箱中。
B. 人類子宮頸癌細胞株（Hela）
本實驗所使用的細胞株來自於中山醫學大學微生物暨免疫學科詹 明修老師提供。將人類子宮頸癌細胞株Hela，培養於含有 10%去補 體胎牛血清 （fetal bovine serum，FBS），及 1% 100U/mL Penicillin/
100μg/mL Streptomycin的DMEM培養液中，使用 10cm 培養皿（cell culture dish），並將細胞置於37℃且含有 5% CO2的細胞恆溫培養箱 中。
細胞繼代培養（subculture）
1. 當細胞在培養皿中長滿至 80%-90%時，移除培養液，用 3-5 mL phosphate-buffered saline (PBS) 清洗。
2. 加入 2 mL 0.1% Trypsin/EDTA，將培養皿放入 37℃且含有 5%
CO2的恆溫培養箱中5 分鐘，直到細胞自盤底飄起。
3.反覆沖吸以打散細胞，然後將細胞吸取至離心管，加入 6 mL free medium 中和 Trypsin 活性。
4. 以 1500 rpm 離心 5 分鐘後，倒掉上清液留下 pellet，然後加入 1 mL 培養液將 pellet 打散。
5. 先於每一 10cm 培養皿中各加入 10 mL培養液 ，再取 3×106的 細胞放入培養皿中，重新培養於 37℃且含有 5% CO2的恆溫培養
箱中。
2.4 細胞毒性測試（cytotoxicity assay）[39]
Cell Counting Kit-8 試劑可簡便且精準的用於檢測細胞增殖及毒性。其 應用原理為：Cell Counting Kit-8 試劑中含有
WST-8[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-di-sulfophe nyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt]，其結構與反應機轉如（附圖 三）。WST-8 在電子攜帶者(1-MEthoxy PMS)的作用下，被細胞粒線體 中的去氫化酶還原成具高水溶性黃褐色的Formazan dye，而 Formazan dye 產生的量與細胞存活量成正比，因此可應用於偵測細胞增殖量及 毒性。
實驗步驟：（附圖四）
1. 將細胞以 1×104/well分到 96 well中（100 μl/well），overnight待細胞 穩定後。
2. 分別加入 Tyloxapol，濃度各為 25，50，250，500，1000μg/mL
（1ml/well）。
3. 充分vortex後，將加入Tyloxapol後的細胞，放置於 37℃且含有 5%
CO2的恆溫培養箱中，培養時間分別為 1，2，4，8 小時，且每一濃 度皆為3 重覆。
4. 培養完畢後，取出先以顯微鏡觀察其細胞形態後，在每一個well中
加入 10 μl Cell Counting Kit-8 試劑，再放回 37℃且含有 5% CO2的 恆溫培養箱中，培養至其變色(約為 2~3 小時)。
5. 最後以 ELISA Reader 測其在 450~595nm 波長下之吸光值(OD 450 和630)。
2.5 細胞型態觀察
以倒立式顯微鏡（OLYMPUS，CK40，Japan）觀察細胞型態的變化，
比較細胞在未添加或添加濃度各為25，50，250，500μg/mL Tyloxapol，
且經過1，2，4，8 小時不同時間點後，細胞型態的變化。
2.6 流式細胞儀（Flow cytometer）[40-43]
流式細胞儀（flow cytometer）是由液流系統、光學系統、分選系統以 及電子系統所構成，是現代生物醫學研究中不可或缺的利器，流式細 胞儀不但可以用來測定細胞各種標記，更可以用來分析細胞的生長週 期、細胞中DNA含量、細胞凋亡作用（apoptosis）及細胞內多種分子 之變化，此外，流式細胞儀也可用於篩選特定細胞，以提供進一步研 究所需。
流式細胞儀主要是為了快速偵測一顆接著一顆流動於液體水柱（fluid stream）中的顆粒或細胞，因此流式細胞儀所偵測到的訊號，是以每 一個細胞或顆粒進入流式細胞儀分吸管後，被雷射光照射激發後，產
生光學訊號，再將光學訊號轉換成電子訊號後，由偵測器收集電子訊 號後進入電腦分析，即可得到所測之細胞或顆粒的特性。當細胞或顆 粒被雷射光照射激發後，會產生前散射光（forward scatter， FSC）及 側散射光（side scatter 或 right-angle scatter 或SSC），兩者呈90度角，
而當顆粒本身帶有螢光物質（fluorochrome），或被帶有螢光物質的 抗體或被其它螢光物質染上時，則會產生各種不同波長的螢光，由光 的波長及強度變化，即可測出細胞的大小（與FSC 成正比），細胞複 雜度（與SSC 成正比）及細胞內特定物質的含量。
2.6.1 細胞內粒線體 ROS 含量測定（Intracellular Reactive oxygen species
contents）
A. 檢測H2O2的變化[44]
在待測樣品中加入具有細胞膜穿透性的dichlorofluorescin diacetate
（DCFH-DA），當DCFH-DA進入細胞後，會與細胞內的H2O2產生裂 解與氫化反應（cleaved and oxidized），而形成帶有綠色螢光的DCF產 物，其波長在 488~530nm下偵測。（附圖五）
實驗步驟：（附圖六）
1. 將細胞以 1×106/well分到 24well中（1ml/well），overnight待細胞 穩定後。
2. 分別加入 Tyloxapol 的濃度為 25，50，250，500μg/mL（1ml/well）。
3. 充分 vortex 後，將加入 Tyloxapol 後的細胞，放置於 37℃且含有 5% CO2的恆溫培養箱中，培養時間分別為1，2，4 小時，且每一 濃度皆為 3 重覆。
4. 培養完畢後，取出先以顯微鏡觀察其細胞形態後，分別將每一濃 度的細胞各取出 10μl，以 trypan blue 染色，在顯微鏡下計算細胞 存活率。
5. 將細胞從 24 well 移至 1.5 mL microtube，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。
6. 倒掉上清液，加入 1mL 1×PBS，充分地 vortex，使細胞分布均勻。
7. 避光加入 1μL DCFH-DA（10μM），充分 vortex，待 15 分鐘後，
以流式細胞儀測定細胞內H2O2的變化。
B. 檢測O2-的變化[44]
在待測樣品中加入具有細胞膜穿透性的hydroethidine bromide（HE），
當hydroethidine bromide（HE）進入細胞後，會與細胞內的O2- 產生氧 化反應，形成ethidium bromide（EB），其波長在 488~585nm下偵測。
（附圖七）
實驗步驟：（附圖八）
1. 將與 Tyloxapol （濃度各為 25，50，250，500μg/mL）作用後之待
測細胞（時間為 1，2，4 小時），從24 well 移至 trypan blue，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。
2. 倒掉上清液，加入 1mL 1×PBS，充分地 vortex，使細胞分布均勻。
3. 避光加入 1μL HE（5μM），充分地 vortex，待 15 分鐘後，以流式 細胞儀測定細胞內O2- 的變化。
2.6.2 粒線體膜電位的測定（Mitochondria membrane potential（ΔΨm）） 當R123可以穿透細胞膜，進入細胞後會與細胞內粒線體結合並抑制粒 線體的呼吸作用[45]，藉由R123結合後所產生的螢光強度可以偵測粒 線體膜電位的變化。R123的結構如（附圖九）。
實驗步驟：（附圖十）
1. 將與 Tyloxapol （濃度各為 25，50，250，500μg/mL）作用後之待 測細胞（時間為 1，2，4 小時），細胞從 24 well 移至 1.5 mL
microtube，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。
2. 倒掉上清液，加入 1mL 1×PBS，充分地 vortex，使細胞分布均勻。
3. 避光加入 1 μL R123（10μM），充分地 vortex，待 15 分鐘後，以流 式細胞儀測定細胞內之粒線體膜電位變化。
2.6.3 細胞大小與細胞內胞器複雜度測定（cell size and complexity
analysis）（附圖十一）[46]
當細胞進入流式細胞儀之分析管，被雷射光照射激發後，會產生前散 射光（forward scatter， FSC）於平行方向，及側散射光（side scatter，
SSC）於垂直方向，藉由 FSC 值之測定可以得到細胞之大小與表面積，
另外也可透過 SSC 值之測定分析比較細胞之複雜度與其細胞型態之
變化。
2.6.4 細胞週期分析（cell cycle analysis）
當 Propidium iodide（PI）進入細胞後，能與細胞核內的 DNA 與 RNA
結合，藉由細胞在各生長時期 DNA 含量不同的因素，我們可以得知
細胞所處的生長階段，又因為 PI 也會和細胞核內的 RNA 結合，因此
我們在製備 PI solution 時會加入 RNase，分解細胞核中的 RNA，以避 免干擾 PI 對 DNA 的測定。正常人體細胞的細胞週期，在 G0/G1 時期 具有 2 套染色體（2N），G2/M 時期具有 4 套染色體（4N），而 S 時期 介於 G0/G1 與 G2/M 之間，因此其染色體含量也為兩者之間。當細胞
產生細胞凋亡時，細胞內的酵素被活化，因而使 DNA 片段化，而使
染色體含量少於2N，所以在 G0/G1 前有 Sub-G1 的波峰出現，藉由流
染色體含量少於2N，所以在 G0/G1 前有 Sub-G1 的波峰出現，藉由流