第二章 材料與方法
2.6 流式細胞儀
流式細胞儀（flow cytometer）是由液流系統、光學系統、分選系統以 及電子系統所構成，是現代生物醫學研究中不可或缺的利器，流式細 胞儀不但可以用來測定細胞各種標記，更可以用來分析細胞的生長週 期、細胞中DNA含量、細胞凋亡作用（apoptosis）及細胞內多種分子 之變化，此外，流式細胞儀也可用於篩選特定細胞，以提供進一步研 究所需。
流式細胞儀主要是為了快速偵測一顆接著一顆流動於液體水柱（fluid stream）中的顆粒或細胞，因此流式細胞儀所偵測到的訊號，是以每 一個細胞或顆粒進入流式細胞儀分吸管後，被雷射光照射激發後，產
生光學訊號，再將光學訊號轉換成電子訊號後，由偵測器收集電子訊 號後進入電腦分析，即可得到所測之細胞或顆粒的特性。當細胞或顆 粒被雷射光照射激發後，會產生前散射光（forward scatter， FSC）及 側散射光（side scatter 或 right-angle scatter 或SSC），兩者呈90度角，
而當顆粒本身帶有螢光物質（fluorochrome），或被帶有螢光物質的 抗體或被其它螢光物質染上時，則會產生各種不同波長的螢光，由光 的波長及強度變化，即可測出細胞的大小（與FSC 成正比），細胞複 雜度（與SSC 成正比）及細胞內特定物質的含量。
2.6.1 細胞內粒線體 ROS 含量測定（Intracellular Reactive oxygen species
contents）
A. 檢測H2O2的變化[44]
在待測樣品中加入具有細胞膜穿透性的dichlorofluorescin diacetate
（DCFH-DA），當DCFH-DA進入細胞後，會與細胞內的H2O2產生裂 解與氫化反應（cleaved and oxidized），而形成帶有綠色螢光的DCF產 物，其波長在 488~530nm下偵測。（附圖五）
實驗步驟：（附圖六）
1. 將細胞以 1×106/well分到 24well中（1ml/well），overnight待細胞 穩定後。
2. 分別加入 Tyloxapol 的濃度為 25，50，250，500μg/mL（1ml/well）。
3. 充分 vortex 後，將加入 Tyloxapol 後的細胞，放置於 37℃且含有 5% CO2的恆溫培養箱中，培養時間分別為1，2，4 小時，且每一 濃度皆為 3 重覆。
4. 培養完畢後，取出先以顯微鏡觀察其細胞形態後，分別將每一濃 度的細胞各取出 10μl，以 trypan blue 染色，在顯微鏡下計算細胞 存活率。
5. 將細胞從 24 well 移至 1.5 mL microtube，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。
6. 倒掉上清液，加入 1mL 1×PBS，充分地 vortex，使細胞分布均勻。
7. 避光加入 1μL DCFH-DA（10μM），充分 vortex，待 15 分鐘後，
以流式細胞儀測定細胞內H2O2的變化。
B. 檢測O2-的變化[44]
在待測樣品中加入具有細胞膜穿透性的hydroethidine bromide（HE），
當hydroethidine bromide（HE）進入細胞後，會與細胞內的O2- 產生氧 化反應，形成ethidium bromide（EB），其波長在 488~585nm下偵測。
（附圖七）
實驗步驟：（附圖八）
1. 將與 Tyloxapol （濃度各為 25，50，250，500μg/mL）作用後之待
測細胞（時間為 1，2，4 小時），從24 well 移至 trypan blue，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。
2. 倒掉上清液，加入 1mL 1×PBS，充分地 vortex，使細胞分布均勻。
3. 避光加入 1μL HE（5μM），充分地 vortex，待 15 分鐘後，以流式 細胞儀測定細胞內O2- 的變化。
2.6.2 粒線體膜電位的測定（Mitochondria membrane potential（ΔΨm）） 當R123可以穿透細胞膜，進入細胞後會與細胞內粒線體結合並抑制粒 線體的呼吸作用[45]，藉由R123結合後所產生的螢光強度可以偵測粒 線體膜電位的變化。R123的結構如（附圖九）。
實驗步驟：（附圖十）
1. 將與 Tyloxapol （濃度各為 25，50，250，500μg/mL）作用後之待 測細胞（時間為 1，2，4 小時），細胞從 24 well 移至 1.5 mL
microtube，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。
2. 倒掉上清液，加入 1mL 1×PBS，充分地 vortex，使細胞分布均勻。
3. 避光加入 1 μL R123（10μM），充分地 vortex，待 15 分鐘後，以流 式細胞儀測定細胞內之粒線體膜電位變化。
2.6.3 細胞大小與細胞內胞器複雜度測定（cell size and complexity
analysis）（附圖十一）[46]
當細胞進入流式細胞儀之分析管，被雷射光照射激發後，會產生前散 射光（forward scatter， FSC）於平行方向，及側散射光（side scatter，
SSC）於垂直方向，藉由 FSC 值之測定可以得到細胞之大小與表面積，
另外也可透過 SSC 值之測定分析比較細胞之複雜度與其細胞型態之
變化。
2.6.4 細胞週期分析（cell cycle analysis）
當 Propidium iodide（PI）進入細胞後，能與細胞核內的 DNA 與 RNA
結合，藉由細胞在各生長時期 DNA 含量不同的因素，我們可以得知
細胞所處的生長階段，又因為 PI 也會和細胞核內的 RNA 結合，因此
我們在製備 PI solution 時會加入 RNase，分解細胞核中的 RNA，以避 免干擾 PI 對 DNA 的測定。正常人體細胞的細胞週期，在 G0/G1 時期 具有 2 套染色體（2N），G2/M 時期具有 4 套染色體（4N），而 S 時期 介於 G0/G1 與 G2/M 之間，因此其染色體含量也為兩者之間。當細胞
產生細胞凋亡時，細胞內的酵素被活化，因而使 DNA 片段化，而使
染色體含量少於2N，所以在 G0/G1 前有 Sub-G1 的波峰出現，藉由流 式細胞儀分析圖（附圖十二），不但可以判斷整個細胞生長階段，也
可以用來當作是否產生細胞凋亡的指標。
細胞經由 70%酒精保存液，overnight，增加細胞膜通透性，加入 PI，
利用波長 488nm 的雷射光激發後，可產生橘紅色螢光，收集分析螢光
強度後，即可知道細胞內 DNA 的含量，細胞生長週期，及是否產生
細胞凋亡現象
實驗步驟：（附圖十三）
1. 將與 Tyloxapol （濃度各為 25，50，250，500μg/mL）作用後之待 測細胞（時間為 1，2，4 小時），細胞從 24 well 移至 1.5 mL
microtube，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。
2. 倒掉上清液，加入 1mL 1×PBS，充分地 vortex，使細胞分布均勻 後，再以 1500 rpm 離心 5 分鐘。
3. 倒掉上清液，加入已製備的保存液(4℃)，充分 vortex 使細胞分布 均勻後，置之於 4℃，overnight。
4. 以 1500 rpm 離心 5 分鐘，倒掉上清液，vortex 使細胞分布均勻。
5. 避光加入 1mL PI，充分地 vortex，待 30 分鐘後以流式細胞儀測定 細胞週期的變化。
2.6.5 檢測 Tyloxapol 對受 LPS 刺激後的 U937 細胞產生的抗氧化作用 實驗步驟：（附圖十四）
1. 將細胞以 1×106/well分到 24well中（1ml/well），overnight待細胞 穩定。
2. 分別加入 Tyloxapol，濃度各為 25，50，250，500 μ g/mL
（1ml/well），將加入 Tyloxapol 後的細胞，放置於 37℃且含有 5%
CO2的恆溫培養箱中，培養時間分別為1，2 小時，且每一濃度皆 為 3 重覆。
3. 之後在每一 well 中加入 1 μL LPS，將細胞放置於 37℃且含有 5%
CO2 的恆溫培養箱中，培養時間為21 小時。
4. 培養完畢後，取出先以顯微鏡觀察其細胞形態後，分別將每一 濃度的細胞各取出 10 μL，以 trypan blue 染色，在顯微鏡下計算 細胞存活率。
6. 將細胞從 24 well 移至 1.5 mL microtube，以 1500 rpm 離心 5 分 鐘。
7. 倒掉上清液，加入 1 mL 1×PBS，充分地 vortex，使細胞分布均 勻。
8. 避光加入 1 μL HE（5μM），充分地 vortex，待 15 分鐘後，以流 式細胞儀測定細胞內 O2- 的變化。
2.6.6 檢測Tyloxapol對U937細胞內H2O2的影響是否為可逆性 實驗步驟：
1. 將細胞以 1×106/well分到 24well中（1ml/well），overnight待細 胞穩定後。
2. 分別加入 Tyloxapol 的濃度為 25，50，250，500 μg/mL（1ml/well）。 3. 將加入Tyloxapol後的細胞，放置於 37℃且含有 5% CO2的恆 溫培養箱中，培養時間分別為 1，2 小時，且每一濃度皆為 3 重 覆。
4. 培養完畢後，將細胞從 24 well 移至 1.5 mL microtube，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。
5. 倒掉上清液，加入 1 mL 1×PBS，vortex 使細胞被充分清洗過，
重覆清洗 2 次。
6. 再以 1500 rpm 離心 5 分鐘，倒掉上清液，加入 1 mL 細胞培養液，
vortex 使細胞分布均勻後，重新放入新的 24well 中，置於恆溫培 養箱中培養 4 小時。
7. 培養完畢後，取出先以顯微鏡觀察其細胞形態後，分別將每一濃 度的細胞各取出 10 μL，以 trypan blue 染色，在顯微鏡下計算細 胞存活率。
8. 將細胞從 24 well 移至 1.5 mL microtube，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。
9. 倒掉上清液，加入 1 mL 1×PBS，充分地 vortex，使細胞分布均勻。
10. 避光加入 1 μL DCF（10μM），充分 vortex，待 15 分鐘後，以流 式細胞儀測定細胞內H2O2的變化。
2.6.7 檢測Tyloxapol對U937細胞內O2-的影響是否為可逆性 實驗步驟：
1. 將細胞以 1×106/well分到 24well中（1ml/well），overnight待細 胞穩定後。
2. 分別加入 Tyloxapol 的濃度為 25，50，250，500 μg/mL（1ml/well）。 3. 將加入Tyloxapol後的細胞，放置於 37℃且含有 5% CO2的恆 溫培養箱中，培養時間分別為 1，2 小時，且每一濃度皆為 3 重 覆。
4. 培養完畢後，將細胞從 24 well 移至 1.5 mL microtube，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。
5. 倒掉上清液，加入 1 mL 1×PBS，vortex 使細胞被充分清洗過，
重覆清洗 2 次。
6. 再以 1500 rpm 離心 5 分鐘，倒掉上清液，加入 1 mL 細胞培養 液，vortex 使細胞分布均勻後，重新放入新的 24well 中，置於 恆溫培養箱中培養 4 小時。
7. 培養完畢後，取出先以顯微鏡觀察其細胞形態後，分別將每一 濃度的細胞各取出 10 μL，以 trypan blue 染色，在顯微鏡下 計算細胞存活率。
8. 將細胞從 24 well 移至 1.5 mL microtube，以 1500 rpm 離心 5 分 鐘。
9. 倒掉上清液，加入 1 mL 1×PBS，充分地 vortex，使細胞分布均 勻。
10. 避光加入 1 μL HE（5μM），充分地 vortex，待 15 分鐘後，以流 式細胞儀測定細胞內O2-的變化。
2.6.8 檢測NAC 或 DPI 是否可以引起 Hela 細胞的抗氧化作用 實驗步驟：
1. 將細胞以 1×106/well分到 24well中（1ml/well），overnight待細 胞穩定後。
2. 加入 10mM NAC 或 10μM DPI（1ml/well）培養 15 分鐘後，再 加入 Tyloxapol 濃度為 500 μg/mL 培養 1 小時後。
3. 加入 100 μL 0.1% Trypsin/EDTA，將 24well 放入 37℃且含有 5%
CO2的恆溫養箱中5 分鐘，直到細胞自盤底飄起，再加入 500 μL free medium 中和 Trypsin 活性。
4. 反覆沖吸以打散細胞，然後將細胞吸取至 1.5 mL microtube，以 1500rpm 離心 5 分鐘。
5. 倒掉上清液，加入 1 mL 1×PBS，充分地 vortex，使細胞分布均 勻。
6. 避光加入 1 μL HE（5μM），充分地 vortex，待 15 分鐘後，以 流式細胞儀測定細胞內 O2- 的變化。
第三章 結果