A. U937 細胞毒性測試
U937 細胞分別以 25，50，250，500，1000 μg/mL 五種劑量，
與細胞作用 1，2，4，8 小時後，利用去氫化酶活性的評估可以
得知細胞的存活率。圖一中顯示，隨著Tyloxapol 劑量的增加及 暴露在 Tyloxapol 時間的增加，我們發現細胞存活率越來越低。
當 Tyloxapol 劑量分別為 25，50，250，500 μg/mL 培養 4 小時 後，細胞存活率仍大於 80%，而 Tyloxapol 劑量 1000 μg/mL 培
養 8 小時後，存活率則小於 50%。一個理想的生物醫學材料，
必須是對細胞無毒性的，因此，我們選用 25，50，250，500 μg/mL 四種對細胞傷害較小的劑量，做後續研究。
B. Hela 細胞毒性測試
Hela 細胞分別以 25，50，250，500μg/mL 四種劑量，與細胞作
用 1，2，4，8，24 小時後，利用去氫化酶活性的評估可以得知
細胞的存活率。圖二中顯示，隨著Tyloxapol 劑量的增加及暴露 在 Tyloxapol 時間的增加，我們發現細胞存活率越來越低。當 Tyloxapol 劑量分別為 25，50，250，500 μg/mL 培養 4 小時後，
細胞存活率仍大於 80%，而培養 8 小時與 12 小時後的存活率 低，因此，我們選用培養 4 小時; 25，50，250，500 μg/mL 四 種對細胞傷害較小的劑量，做後續研究。
3.2 細胞內粒線體 ROS 含量測定（Intracellular Reactive oxygen species contents）
細胞內H2O2的量會隨著Tyloxapol劑量的增加及暴露在Tyloxapol時
間的增加而提高，細胞內的H2O2會與穿透細胞膜進入細胞內的
DCFH-DA反應，產生DCF發出綠色螢光，當細胞內H2O2量增加時，
DCF所產生的螢光強度也會提高。
A. U937 細胞內H2O2的變化
由圖三顯示，在Tyloxapol 劑量為 250 μg/mL，與 U937 細胞作
用 1 小時後，所測得之 DCF 螢光強度，突然下降至接近於沒
有加入 Tyloxapol 的 U937 細胞 (control) 時，U937 細胞所產 生的DCF 螢光強度，而 Tyloxapol 劑量為 500 μg/mL，同樣與 U937 細胞作用 1 小時後，其產生的 DFC 螢光強度又突然上 升。另外Tyloxapol 與 U937 細胞作用 2 小時後，當 Tyloxapol 劑量為25 μg/mL 時的 DFC 螢光強度和沒有加入 Tyloxapol 的 U937 細胞 (control) 產生的螢光強度差不多，而 Tyloxapol 劑
量為50 及 250 μg/mL 時 DCF 螢光強度皆為增加的趨勢，但在 Tyloxapol 劑量為 500 μg/mL 又呈下降。最後當 Tyloxapol 與 U937 細胞作用 4 小時後，無論 Tyloxapol 劑量為何，其 DCF 的相對螢光強度皆為下降趨勢。
B. U937 細胞內O2-的變化
由圖四顯示，細胞內O2-的量會隨著Tyloxapol劑量的增加及暴露 在Tyloxapol時間的增加而提高，細胞內的O2-會與穿透細胞膜進 入細胞內的HE反應，生成EB發出螢光，當細胞內O2-含量增加 時，HE所產生的螢光強度也會提高。隨著Tyloxapol劑量與培養 時間的增加，U937 細胞所產生的HE螢光強度呈現相對增加的 趨勢。
C. Hela細胞內H2O2的變化
由圖五顯示，Tyloxapol 劑量為 25μg/mL 與細胞作用 1 小時後，
DCF 螢光強度比沒有加入 Tyloxapol 的 Hela 細胞 (control) 的 DCF 螢光強度明顯上升，但之後隨劑量增加而呈下降趨勢。當 細胞與 Tyloxapol 作用 2 小時或 4 小時後，無論 Tyloxapol 為任 何劑量，其 DCF 螢光強度與沒有加入 Tyloxapol 的 Hela 細胞 (control) 的 DCF 螢光強度比較，發現皆呈下降的趨勢。
D. Hela細胞內O2-的變化
由圖六顯示，無論Tyloxapol 劑量為何，細胞所產生的 HE 螢光 強度呈現相對增加的趨勢，尤其是 Tyloxapol 劑量為 250μg/mL 與細胞作用 4 小時後，所產生的 HE 螢光強度非常明顯地增加。
3.3 粒線體膜電位的測定（Mitochondria membrane potential（ΔΨm））
經由ROS刺激引起ROS釋放的系統，所造成不穩定的粒線體膜電位 與氧化還原反應，會對細胞生存產生負面影響。細胞產生凋亡作用 的初期，其粒線體膜電位會呈現下降趨勢，因為粒線體會釋放 cytochrome c。
A. U937 細胞粒線體膜電位的測定
由圖七顯示，和沒有與Tyloxapol作用的U937細胞比較，會發現 隨著Tyloxapol劑量與培養時間增加，U937細胞的粒線體膜電位 呈現不穩定狀態。Tyloxapol與U937細胞分別作用1小時和2小時 後，其粒線體膜電位與沒有和Tyloxapol作用的U937細胞比較，
發現在初期粒線體膜電位呈下降趨勢，而後隨著Tyloxapol劑量 增加而增加，但在Tyloxapol劑量為25 μg/mL，培養時間為4小時 時，其粒線體膜電位變化為增加的現象，隨著Tyloxapol劑量的 增加，會使粒線體膜電位變化朝下降的趨勢發展。
B. Hela細胞粒線體膜電位的測定
由圖八顯示，和沒有加入Tyloxapol的Hela細胞 (control) 比較，
會發現隨著Tyloxapol劑量與培養時間增加，Hela細胞的粒線體 膜電位呈現不穩定狀態。當細胞與Tyloxapol作用1小時後，無論 Tyloxapol劑量為何，其產生的R123螢光強度皆比沒有加入 Tyloxapol的Hela細胞 (control) 的R123螢光強度低。Tyloxapol 劑量為25μg/mL與細胞作用2小時後，產生的R123螢光強度與沒 有加入Tyloxapol的Hela細胞 (control) 的R123螢光強度比變化 不大，但在Tyloxapol劑量為50μg/mL及250μg/mL時，R123螢光 強度呈上升趨勢，隨後在Tyloxapol劑量為500μg/mL時又呈減少 狀 態 。 當Tyloxapol 與 細 胞 作 用 4 小 時 後 ， Tyloxapol 劑 量 為 25μg/mL 時 的 R123 螢 光 強 度 明 顯 下 降 ， 而 Tyloxapol 劑 量 為 50μg/mL及250μg/mL時，R123螢光強度呈上升趨勢，隨後在 Tyloxapol劑量為500μg/mL時又呈減少狀態。
3.4 細胞大小與細胞內胞器複雜度測定（cell size and complexity analysis）
藉由測量FSC與SSC值，評估Tyloxapol對於細胞的大小與複雜度所造 成的影響。由圖九與圖十顯示，Tyloxapol與U937細胞作用1，2，4
小時後，加入HE螢光染劑，發現當Tyloxapol劑量與培養時間增加 時，其對細胞大小與複雜度並無明顯影響，且Tyloxapol對Hela細胞 亦無明顯的變化。
3.5 細胞週期分析（cell cycle analysis）
在細胞的生長週期中，會因細胞所處的生長階段不同，而有不同的 DNA套數，藉由這個特性，我們可以測定細胞與Tyloxapol作用在不 同濃度與培養後，細胞週期的改變，也可從此判斷出是否有細胞凋 亡作用產生。
A. U937 細胞週期分析
由 圖 十 一 顯 示 ， 當 細 胞 與Tyloxapol作用1小時及2小時後，
Tyloxapol無論在任何劑量下，皆沒有細胞凋亡的作用產生 (細 胞的subG1值與控制組相當)。而當細胞與Tyloxapol作用4小時 後，Tyloxapol劑量為250 μg/mL與500 μg/mL時，可以明顯的看 到subG1值比沒有加入Tyloxapol的U937細胞 (control) 的subG1 值高，這就表示細胞內部有凋亡作用的產生。
B. Hela細胞週期分析
由圖十二及圖十三顯示，細胞與Tyloxapol作用1小時及2小時 後，Tyloxapol無論在任何劑量下，皆沒有細胞凋亡的作用產生，
細胞的subG1值與控制組相當。當Tyloxapol劑量為500μg/mL與 細胞作用4小時後，發現細胞的subG1值開始上升，表示細胞開 始產生凋亡作用。而當Tyloxapol劑量為250μg/mL及500μg/mL與 細胞作用8小時後，細胞的subG1值明顯地上升，細胞產生凋亡 作用。
3.6 Tyloxapol對受LPS刺激後的U937細胞產生的抗氧化作用
在之前的文獻中提到無論是體內 （in vivo）或體外（in vitro），
Tyloxapol皆能對Hydroxyl radical與Hypochlorous acid產生抗氧化作 用。當U937細胞與LPS作用21小時後，U937細胞會因受到刺激活化，
而使細胞內部的O2-含量增加。由圖十四顯示，Tyloxapol與受LPS刺 激活化後的U937細胞作用1小時後，發現Tyloxapol可以將受LPS刺激 活化後的U937細胞所產生的螢光強度，恢復到沒有受刺激活化時的 狀態，但由圖十五顯示Tyloxapol與受LPS刺激活化後的U937細胞作 用2小時後，卻只有低劑量（25 μg/mL與50 μg/mL）的Tyloxapol可以 將受LPS刺激活化後的U937細胞所產生的螢光強度，恢復到沒有受
刺激活化時的狀態。
3.7 Tyloxapol對U937細胞內H2O2與O2-的影響是否為可逆性
當Tyloxapol與細胞作用1小時後，將Tyloxapol從細胞培養液中移除再 繼續培養21小時，由圖十六發現細胞內H2O2與O2-的含量並沒有很明 顯的變化，而由圖十七顯示，在與Tyloxapol作用2小時後的細胞中發 現H2O2含量些微下降，但其下降的量在統計上無顯著差異性，相對 於O2-而 言 ，U937 細 胞 在 與 低 劑 量 （ 25 μg/mL與50 μg/mL）的 Tyloxapol作用2小時後，細胞內部的O2-含量也沒有明顯變化，但在 高劑量（250 μg/mL與500 μg/mL）的Tyloxapol下，細胞內的O2-含量 會明顯的增加。
3.8 NAC或DPI是否可以引起Hela細胞的抗氧化作用
由圖十八與圖十九顯示，預先加入10mM NAC或10μM DPI與Hela細 胞作用15分鐘後，皆會使後續再加入Tyloxapol培養1小時之Hela細胞 內的O2-含量增加，由此可知NAC與DPI兩者皆無法使Hela細胞產生 抗氧化作用，所以Tyloxapol對Hela細胞之作用機轉與NAC之雙硫鍵 及DPI抑制細胞膜上NADPH無關。