抗菌劑感受性試驗

對於 30 株 S. Schwarzengrund 進行 12 種抗菌劑感受性試驗之個 別結果如 Table 6。可以見到這些菌株皆具有多重抗藥性，最嚴重的 甚至對於其中 10 種藥物都產生抗藥性。種雞場 B 場、K 場、Q 場之 菌株有不同的抗藥性型態，寵物食品、鴨場、野鳥來源、火雞、豬隻 等菌株之抗藥性型態也有所不同，但若是於同一來源所分離之菌株就 會呈現出相同的抗藥表現，藉由抗藥性表現差異，排除具流行病學相 關性之菌株，選擇出 15 株流行病學不相關的菌株，用來計算脈衝式 電泳鑑別效果。

其 中 所 有 的 S. Schwarzengrund 都 對 nalidixic acid 以 及 chloramphenicol 產生抗藥性，菌株對 streptomycin 之抗藥性也相當嚴 重，有 29 株菌皆對 streptomycin 產生抗藥性，而對 cephalothin 和 kanamycin 產生抗藥性之菌株較少，只有 23% (7 株菌)。其餘抗生素 之抗藥性比例如下：ampicillin 為 60%、ciprofloxacin 及 enrofloxacin 為 30%、gentamicin 為 77%、tetracycline 以及 oxytetracycline 皆為 70%、

sulfamethoxazole/ trimethoprim 為 83%，整理抗藥性比例如 Table 7。

第二節 脈衝式電泳

以 Salmonella ser. Braenderup H9812 作為 marker，此為國際之標 準對照，使用 XbaI 限制酶切割，使用 1% Pulsed Field Certified Agarose 並使用 0.5X TBE buffer，電泳時間為 18 到 19 小時，維持在 14 °C，

Included Angle 為 120°，6V/cm，所得結果如 Fig1。

以 XbaI 限制酶所切割之 S. Schwarzengrund 電泳圖譜如 Fig 2a 及 2b，利用肉眼判斷可以見到即使是不具流行病學相關之菌株，仍然會 有相同的圖譜。若以 Tenover 所述之脈衝式電泳結果標準分析來看，

這些菌株之基因型皆為關係密切甚至是相同，S. Schwarzengrund 菌株 條帶差異最多在 2-3 個條帶。經由軟體分析之親緣關係樹狀圖如 Fig 3。

可以看到有許多菌株其分型相同，包含來自寵物食品、白肉雞、豬場、

流浪狗、火雞共 12 株菌全部為同一分型。放入作為 marker 之標準菌 株 H9812 一起比較，作為對照，確認其分型相同實驗無誤。在 Fig 3 中所顯示的為所有菌株之脈衝式電泳結果，包含 S. Schwarzengrund、

S. Albany、S. Enteritidis、S. Typhimurium 以及 S. Pullorum，可以見到 同一血清型之間的基因型較相似，因此所呈現之圖譜也會有相近之親 緣關係。在計算 discrimination index (D)時須使用不具流行病學相關之 菌株，因此根據抗藥性結果以及菌株來源背景，將具有流行病學相關 性之菌株刪除，留下 15 株 S. Schwarzengrund 菌進行 D 值計算。15

株菌之親緣樹狀圖如 Fig 4。從這張圖可以更清楚的看到，15 株菌共 分出六型，包含寵物食品、鴨(2000 年分離)、B 場、Q 場、K 場白肉 種雞場、火雞、流浪狗、B 場豬隻、白肉雞等來源之 9 株菌株，分型 皆為 X1 型。鳳頭蒼鷹及紅冠水雞來源之菌株所得圖譜為 X2 型，X1 與 X2 型差異只有一個條帶。根據 Hunter 等人研究中的計算方法，計 算 D 值為 0.65。

以 AvrII 限制酶切割之 S. Schwarzengrund 電泳圖譜如 Fig 5a 及 5b，

可以看到利用 AvrII 所切割之條帶變化較明顯。但其中有一菌株無法 成功使用 AvrII 進行切割，只會有一個條帶出現，無法進行比對辨識。

因 AvrII 限制酶切割後之條帶較少，皆在 10 個條帶以內，因此不適用 Tenover 之準則分析條帶數差異所代表之意義。利用軟體分析所有菌 株之親緣性結果如 Fig 6。S. Albany、S. Enteritidis、S. Typhimurium 以及 S. Pullorum 之間因為基因型類似，因此仍可見顯示出相近之親 緣關係。利用不具流行病學相關之 S. Schwarzengrund 計算 D 值，軟 體分析之親緣樹狀圖如 Fig 7。15 株菌共切出 11 種不同的圖譜(A1 到 A11 型)，鳳頭蒼鷹及紅冠水雞之菌株同為 A1 型，白肉種雞 Q 場及 K 場分離之菌株為 A2 型，寵物食品及白肉種雞 B 場分離菌株為 A3 型，

A2 及 A3 型之間差異只有一個條帶。豬場 A 及 B 場之菌株皆為 A6。

白肉雞分離所得菌株利用 AvrII 切割後無法有多個條帶，因此所得之

親緣性與其他菌株便顯示為相差許多。AvrII 酵素切割之結果 D 值為 0.96。

以 SpeI 限制酶所切割之 S. Schwarzengrund 電泳圖譜如 Fig 8a 及 8b，肉眼辨識其條帶分布密集，可以粗略看出有 7 種不同的圖譜，條 帶位置差異小。利用軟體分析之所有菌株的親緣樹狀圖如 Fig 9。具 有相同流行病學背景之 S. Schwarzengrund 如 C 場火雞、野鳥、白肉 種雞場之菌株皆呈現相同之圖譜。利用不具流行病學相關之 S.

Schwarzengrund 分析之親緣關係樹狀圖如 Fig 10。SpeI 限制酶無法 將寵物食品、鴨場、流浪狗、白肉種雞場來源之菌株辨別，15 株菌 分出了 9 種圖譜(S1 到 S9)，流浪狗、寵物食品、B 場白肉種雞場、Q 場白肉種雞場、2000 年由鴨隻的菌株為 S1 型，紅冠水雞、鳳頭蒼鷹 的菌株為 S4 型，來自於 A 場豬隻及 B 場豬隻的菌株為 S5 型，計算 得到 D 值為 0.89。

以 SfiI 限制酶切割之 S. Schwarzengrund 電泳圖譜如 Fig 11a 及 11b，

利用軟體分析之所有菌株親緣樹狀圖如 Fig 12。不具流行性學相關之 S. Schwarzengrund 菌株以軟體分析其親緣關係圖如 Fig 13。利用 SfiI 限制酶切割可分出 11 種不同圖譜(F1 到 F11)，其中流浪狗、D 場火 雞、B 場白肉種雞場之圖譜皆為 F1 型，而寵物食品及 K 場白肉種雞 來源之菌株圖譜為 F4，2012 年分離自火雞之菌株以及 A 場豬隻之菌

株圖譜同為 F9。計算出之 D 值為 0.95。

以 NotI 限制酶切割之 S. Schwarzengrund 電泳圖譜如 Fig 14a 及 14b，將電泳圖利用軟體分析。所有菌株包含不同血清型之分析結果 如 Fig 15，流行病學相關之菌株皆呈現相同圖譜，同一血清型所得之 結果親緣性接近。流行病學不相關之 15 個 S. Schwarzengrund 菌株所 分析圖譜如 Fig 16，共有 9 個不同之分型(N1-N9)。N1 型包括流浪狗、

白肉種雞場 Q 及 K 的三個菌株，白肉雞、紅冠水雞及鳳頭蒼鷹皆為 N4 型，A 場豬隻及 B 場豬隻分離之菌株則皆為 N5 型。D 值為 0.93。

以 PacI 限制酶切割之 S. Schwarzengrund 電泳圖譜如 Fig 17a 及 17b，將電泳圖利用軟體分析，可得分析結果如 Fig 18。流行病學不 相關之 S. Schwarzengrund 菌株經軟體分析後的親緣關係如 Fig 19，其 中 2000 年所分離之鴨隻菌株、寵物食品、白肉種雞場 Q 及 K 分型為 P1，A、B 場豬場以及自火雞所分離之菌株為 P2 型，15 株菌共分 10 種不同圖譜(P1-P10)。PacI 限制酶切割之 D 值為 0.91。SfiI 和 AvrII 兩個限制酶對於 S. Schwarzengrund 的鑑別效果較好，所以結合此兩 種限制酶後，可以將無流行病學相關之菌株成功分型。(Fig 20)

Pullorum 血清型所挑選的兩株菌株，一為標準菌株 BCRC15464，

此標準菌株之分離來源為人類之下痢病例，可說是相當特殊的一個案 例，XbaI 以及 AvrII 切割後結果可以看到兩株 S. Pullorum 差異很明顯

(如 Fig 3 及 Fig 6)，條帶數量及位置都有很大的變化。NotI 及 PacI 的結果則是跑出相同的條帶看不出變化(如 Fig 15 及 Fig 18)。SpeI 和 SfiI 切割後的結果條帶有些微差異，可以鑑別出兩株(如 Fig 9 及 Fig 12)。

Typhimirum 血清型兩株菌株一為標準菌株 ATCC23566，一為臨 床分離株(分離自中止蛋)，利用 XbaI 切割後條帶位置數目相同，判定 為同一型態，而 AvrII 限制酶的結果可以分出兩株菌株之差異，有數 個條帶位置有所差異(如 Fig 3 及 Fig 6)。SpeI、 SfiI 切割結果兩菌株 有三個條帶的差異(如 Fig 9 及 Fig 12)。NotI 限制酶切割出條帶約只有 一個差異，PacI 的結果顯示兩株菌株親緣關係相差遠，標準菌株被分 析為與野鳥之 S. Schwarzengrund 菌株親緣關係較近(如 Fig 15 及 Fig 18)。

Enteritidis 血清型兩株菌株一為標準菌株 ATCC13076，一為分離 自種雞場孵蛋機之臨床分離株，XbaI 之型態有兩個條帶之差異。AvrII 切割結果約莫有 4 個條帶差異(如 Fig 3 及 Fig 6)，可以很清楚辨別出 兩個菌株的不同。SpeI、SfiI 無法辨別兩株菌株的差異(如 Fig 9 及 Fig 12)。NotI、PacI 切割結果可以鑑別出為不同之型態，但條帶差異不 大，相關性相當的近(如 Fig 15 及 Fig 18)。

Albany 血清型兩株菌株皆為臨床分離株，但分屬不同雞場，XbaI

切割後分別有不同之型態，有數條條帶的差異。AvrII 也可將兩株菌 株鑑別，但判定之親緣關係與 S. Schwarzengrund 相當近(如 Fig 3 及 Fig 6)。SpeI 切割結果雖可鑑別兩株菌之型態不同，但其中一株菌卻 被分為跟 S. Schwarzengrund 有較近之親緣性(如 Fig 9)。SfiI 切割後分 析結果，被分至兩個不同的群集，分別與 S. Enteritidis、S. Typhimirum 擁有較相近之徒譜型態(Fig 12)。NotI 切割後的條帶結果相似，但仍 可鑑別出兩者有不同型態，PacI 則無法鑑別出兩者差異(如 Fig 15 及 Fig 18)。

在其他血清型的部份所使用的樣本數量不夠多，但就目前的結果 來做個推估，S. Pullorum 用 XbaI 和 AvrII 切割效果都不錯，而所挑 選之 S. Typhimirum 用 XbaI 無法鑑別，但利用其他限制酶時卻都可 以將兩株菌株鑑別出來；以 S. Enteritidis 來看則是較適合使用 XbaI 及 AvrII，其他的限制酶雖可以將兩菌株鑑別，但差異小，在判讀上 較難；S. Albany 除了 PacI 無法鑑別其差異，其他限制酶都可將兩株 S. Albany 成功鑑別，而且條帶差異都很大，但是 S. Albany 於 AvrII、

SpeI、NotI、SfiI 的結果發現容易與其他 S. Schwarzengrund 菌株有較 近之親緣性，這兩個血清型使用這四個限制酶時可能鑑別效果會較 差。

第三節 多重基因座序列分型法

aroC 基因增幅所得之產物大小為 826 bp，dnaN 基因增幅所得 之產物大小為 833 bp，hemD 基因增幅所得之產物大小為 666 bp，purE 基因增幅所得之產物大小為 510 bp，sucA 基因增幅所得之產物大小 為 643 bp，thrA 基因增幅所得之產物大小為 852 bp，hisD 基因增幅 所得之產物大小為 894 bp。因這些基因為沙門氏菌之管家基因，因此 皆可增幅出這些大小的片段。

利用電泳確認增幅成功之後，將 PCR 產物送定序，使用定序之 引子對如 Table 5。所得之定序結果至 MLST 網站上進行比對，將各 個基因之序列依序輸入，即可得一對偶基因型之號碼。目前基因庫中 共有 6167 個資料，包含 1817 個 Sequence type。

30 株 S. Schwarzengrund 菌株 aroC 基因定序結果，皆屬於對偶基 因型 aroC 43，比對序列長為 501 bp；dnaN 基因之定序結果，所有 S. Schwarzengrund 菌株皆屬於對偶基因型 dnaN 47，比對序列長為 501 bp；hemD 基因之定序結果，也皆屬於對偶基因型 hemD 49，比 對序列長為 501 bp；30 株 S. Schwarzengrund 菌株的 hisD 基因之定序 結果，皆屬於對偶基因型 hisD 49，比對序列長為 501 bp；30 株 S.

Schwarzengrund 菌株的 purE 基因之定序結果，皆屬於對偶基因型 purE 41，比對序列長為 399 bp；sucA 基因之定序結果，所有 S.

Schwarzengrund 菌株皆屬於對偶基因型 sucA 15，比對序列長為 501 bp；

thrA 基因之定序結果，皆屬於對偶基因型 thrA 3，比對序列長為 501 bp。

得到七個基因之對偶基因型態號碼後，與資料庫比對，所有菌株 皆屬於 sequence type 96。查找 MLST 之資料庫，可見 ST96 皆為不同

得到七個基因之對偶基因型態號碼後，與資料庫比對，所有菌株 皆屬於 sequence type 96。查找 MLST 之資料庫，可見 ST96 皆為不同