第三章 材料與方法
第二節 沙門氏菌之抗菌劑感受性試驗
進 行 抗 菌 劑 感 受 性 試 驗 之 培 養 基 需 使 用 Muller-Hinton agar (Difco, USA)，經過 121°C、15 分鐘、1.5 大氣壓之高溫高壓滅菌後，
待其冷卻利用 pipet-aid 加入直徑 15 公分之培養皿中，加入 80 ml 之 Muller-Hinton agar，使其培養基厚度均為 5 mm。進行感受性試驗之 培養基應於當天新鮮配置。
3.2.2 菌液濃度調整
前一晚先行培養所需使用之菌株於 TSB 中，菌液需調整成 0.5 McFarland 之濃度。因使用目測之差異大，因此利用分光光度計作為 測量濃度之工具，0.5 McFarland 濃度的菌液在波長 600 nm 時之 OD 值約為 0.08-0.1。測量原菌液濃度後，利用 TSB 作為稀釋將菌液濃度 調整到 0.5 McFarland standard。
3.2.3 瓊脂藥片擴散法
取已調整好濃度之菌液 300 µl 均勻散佈至 Muller-Hinton agar 上，
並以無菌棉棒將菌液均勻塗抹於 agar 上。實驗所用之抗菌劑藥片 (Oxoid, USA)，包括 Beta-lactam 類的 Ampicillin (10 µg, AMP10) Cephalothin (30 µg, KF30)，Phenicols 類的 Chloramphenicol (30 µg,
C30)，Aminoglycosides 類的 Gentamicin (10 µg, CN10)、Streptomycin (10 µg, S10)、Kanamycin (30 µg, K30)，Tetracycline 類的 Tetracycline (30 µg, TE30) 、 Oxytetracycline (30µg, OT30) ， Quinolone 類 的 Ciprofloxacin (5 µg, CIP5)、Enrofloxacin (ENR)、Nalidixic acid (30 µg, NA30)以及 Sulfamethoxazole/Trimethoprim (1.25/23.75µg, SXT25)。共 計 12 種藥片。將藥片放入 Disk Dispenser (Oxoid, USA)，使用 Disk Dispenser 將藥片貼於塗好菌液之 Muller-Hinton agar 上，於 37 °C 培 養 18 小時。測量抑菌圈直徑，判讀菌株是否具抗藥性或者為敏感性(如 Table 2.)。
第三節 脈衝式電泳
實驗主要根據 PulseNet USA 的沙門氏菌脈衝式電泳標準流程，
並依照實驗需求進行些許調整(CDC, 2010)。使用 XbaI、AvrII、SpeI、
SfiI、PacI、NotI 等六種限制酶(Zheng et al., 2007)。
3.3.1 試劑製備
泡製所需量之 Tris-EDTA (TE buffer)、Cell suspension buffer (CSB)、cell lysis buffer (CLB)以及 0.5X TBE buffer。
取 10 ml pH 8.0 的 1M Tris 和 2 ml 0.5M EDTA (pH 8.0)加入 DDW，
配製成 1L 的 TE buffer；100 ml 的 CSB 配製方法為在 DDW 中 10 ml 1M Tris (pH 8.0)及 20 ml 0.5M EDTA (pH 8.0)。25 ml pH 8.0 的 1M Tris 、 50 ml 0.5M EDTA (pH 8.0)以及 50 ml 10% Sarcosyl 稀釋於 DDW 中，
配製成 500 ml CLB。取 5X TBE buffer (Protech, Taiwan)用 DDW 稀釋 10 倍，泡製成 0.5X TBE buffer，即為電泳緩衝液。
3.3.2 菌塊製備
將欲進行試驗之菌株接種於 TSA 上，於 37 °C 培養箱培養 18±2 小時。Pulsed Field Certified Agarose (BIO-RAD, USA) 0.15g 加入 15 ml TE buffer 中，微波煮沸後放入 56 °C 水浴槽降溫備用。使用 10 µl 釣菌環取足夠之菌量到 500 µl CSB 內，混合均勻後抽取 100 µl 至 900
1.2 之菌液加入 20 µl proteinase K ( QIAGEN, Germany )輕彈離心管使 混合均勻，取 400 µl 1% Pulsed Field Certified Agarose 與菌液混合均 勻後注入膠模，待其凝固。在 15 ml 離心管中加入 25 µl proteinase K 及 5 ml CLB，將已凝固之菌塊推入。確定菌塊皆在液面下，放入 56 °C 水浴槽水浴 2 小時，約半小時手動震盪一次。同時進行二次水以及 TE buffer 的預熱。將菌塊撈出依照不同菌株放在 Screened Caps (BIO-RAD, USA)上，放入雜交管後以 56 °C 轉速 60 rpm 清洗菌塊 15 分鐘，先用二次水清洗兩次，再以 TE buffer 用同樣條件清洗四次。
清洗好之菌塊放入裝 1 ml TE buffer 的微量離心管中，保存於 4 °C 冰 箱。
3.3.3 限制酶切割
以滅菌過二次水 180 µl、NEBuffer 20µl (New England Biolabs, UK) 之比例先調配好預切割液，不同限制酶有相對應適合之 NEBuffer，
XbaI、AvrII、SpeI、SfiI 皆為使用 NEBuffer 4，PacI 使用 NEBuffer 1、
NotI 使用 NEBuffer 3。每個菌塊放入 200 µl 預切割液，37 °C 水浴 20 分鐘。將菌塊撈起並擦乾後放入含限制酶、BSA 2 µl (New England Biolabs, UK)、 NEBuffer 20 µl 以及滅菌二次水之 200 µl 溶液，確認 菌塊沒入溶液當中，37 °C 水浴 3～4 小時。取 1 g Pulsed Field Certified Agarose 加入 100 ml 0.5X TBE buffer，加熱沸騰使粉末均勻溶解，放
入 56°C 水浴槽降溫。降溫後之 Pulsed Field Certified Agarose 倒入鑄 膠模，靜置待其凝固。取 2300 ml 0.5X TBE buffer 灌入電泳槽中，打 開幫浦固定在流速 70，確認管線中無氣泡後打開預冷機，讓 TBE buffer 降溫至 14 °C。消化好之菌塊取出放至 200 µl 0.5 X TBE buffer 內靜置 5 分鐘。將菌塊取出吸乾殘留液體之後放入尺梳移走的孔洞中，
確定無氣泡殘留。Marker 使用 Salmonella enterica serovar Braenderup (ATCC® BAA664™)，並用 XbaI 限制酶切割。
使用機器為 CHEF Mapper
®
XA System (Bio-Rad, USA)，條件設 定參考 Zheng 等人的研究（如 Table 3.），其中 AvrII 與 BlnI 為不同廠 商所出之限制酶，是相同切位的異構酶。進行脈衝式電泳的時間經過 測試，發現 19 小時皆已足夠，不需跑到 20.5 小時，因此稍作調整。3.3.4 PFGE 結果
GelStar™ Nucleic Acid Stain (Lonza, USA) 40 μl 加400 ml 0.5X TBE buffer混勻，電泳膠取出放入，染色20分鐘後以ChemiDoc™ XRS+
System (Bio-Rad, USA)紫外光顯像，照相並存檔。使用Bionumerics 軟體(Bio-Rad, USA; 第7.1版)，樹狀圖建立是以Dice coefficient of similarity 以及 unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) 來 進 行 運 算 ， 分 析 條 件 設 定 為 band tolerance 1.5 及 optimization為1% (Ngoi et al., 2013)。
第四節 多重基因座序列分型法