2.2 Amphotericin B
amphotericin B 屬於 polyenes 類抗黴菌製劑 (fungicidal) 其中之一類。
amphotericin B 可有效抑制黴菌生長，此類抗黴菌製劑作用於真菌細胞膜 ergosterol (麥角固醇) 成分，而 ergosterol 功能是維持細胞完整性和流動性成分，
amphotericin B 鑲嵌於 ergosterol 形成桶狀通道造成細胞內含物在細胞內外離子 不帄衡而使細胞死亡，但同時對人體的副作用甚大，例如其腎毒性強等(Cowen and Steinbach, 2008; Vazquez and Sobel, 2006)。發現篩選出抗藥性的菌株與 amphotericin B 結合的細胞膜 ergosterol 含量較低，常見於 C. lusitaniae 和 C.
guilliermondii，但其抗藥機制尚未清楚(Cannon et al., 2009)。
2.3 Anidulafungin
此藥物屬於 echinocandins 類抗黴菌製劑 (fungicidal) 其中之一類，是由
Aspergillus nidulans 所衍生的半合成的環狀 lipopeptide (Vazquez and Sobel, 2006)。
anidulafungin 可有效抑制真菌生長，anidulafungin 可以和細胞壁成分
β-1,3-D-glucan synthase 做非競爭抑制 (non-competitive inhibition) 而抑制真菌 細胞壁成分 glucan 的合成(Denning, 2003; White et al., 1998)。文獻指出
anidulafungin 對大多數的念珠菌皆有效，包含一些具內生性抗藥性菌株如 C.
krusei (對 azoles 具抗藥性)，Candida lusitaniae (對 amphotericin B 具抗藥性) (White et al., 1998)。篩選出抗藥菌株的機制為合成細胞壁 glucan 的酵素 β(1,3)-glucan synthase 的 subunit Fks1p 發生突變而無法抑制形成細胞壁成份 (Cannon et al., 2009)。
3. 抗藥性的現況
於愛滋病患口腔及婦女陰道受到念珠菌感染已是普遍的問題在目前有限的抗黴 菌藥物中，投藥的種類及數量逐漸面臨到抗藥性的問題，因為念珠菌屬中不同菌 種對抗黴菌藥物有著不同程度的感受性。如 C. lusitaniae 對 amphotericin B 具有 抗藥性(Hadfield et al., 1987)；C. krusei 與 C. glabrata 對 fluconazole 產生抗藥性 比例較其它的念珠菌種高 (Kontoyiannis and Lewis, 2002)。另外，雖然 C. albicans 是最常引起愛滋病患念珠菌感染的菌種，但是非白色念珠菌 (non-albicans Candida) 的其它念珠菌導致愛滋病患感染的個例也逐漸增加(Barchiesi et al., 2002)，C. tropicals 是非白色念珠菌中常見菌種之一(Axner-Elings et al., 2011;
4
Yang et al., 2005b)，而此菌對 fluconazole 也逐漸篩選出具有抗藥性的菌株(White et al., 1998)，使得 C. tropicals 感染亦在臨床上扮演了重要的角色。以 1997 至 2001 年大多數國家對 fluconazole 具有抗藥性的 C. albicans 其盛行狀況如附錄二所示，
除了澳洲、法國、中國等少數國家曾出現具較高比例的抗藥性的白色念珠菌，大 部分的國家出現對 flucpnazole 具有抗藥性的白色念珠菌比例皆低於 10％。且如 附錄三所示，在歐美地區念珠菌屬的分布情況以 C. albicans 所佔比例最高，約占 全體六至七成左右，其次為 C. glabrata 約占全體近兩成，其他常見念珠菌屬尚 有為 C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. guilliermondii 等(Klepser et al,.
2006)。
實驗目的：
近年來，由於免疫力不全的病人增加、抗微生物藥物的不當使用等因素，使 念珠菌造成的感染病症逐漸地增加；另一方面，由於目前治療抗念珠菌感染的藥 物種類並不多，因此念珠菌感染的情況也日趨嚴重，本研究主要的研究目的如下:
A. 鑑定在台灣地區醫院所收集的臨床念珠菌種，了解念珠菌分布狀況，以供臨 床上參考並做為用藥依據。
B. 利用肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 測定臨床菌株的最小抑制濃度以觀 察近年來念珠菌產生抗藥性菌株的比例和趨勢。
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一、 材料與方法 2 引子
primer sequence location
ITS1(HJL0735) 5’ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’ 18S 1769-1787
ITS4(HJL0775) 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’ 28S 37-57
NL1(HJL01178) 5’GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG 3’ 28S 37-61
NL4(HJL01179) 5’ GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3’ 28S 375-393
3 藥品試劑
RPMI 1640 (Cat. No. 867884)
Phenol (Cat. No. US75831)
1 kb plus DNA ladder (Cat. No. 12308-011)
Ethidium bromide (Cat. No. K27928515)
Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Cat. No. S26740)
Glucose (Cat. No. K33069537)
Amphotericin B
Sodium Chloride (NaCl) (Cat. No. K29779304)
0.45~0.5%，pH5.0~7.2 NaCl (Cat No. K29779304)
MastePure TM Yeast DNA Purification Kit (Cat. No. MPY80200)
DreamTagTM DNA polymerase (5 unit /μl, Fermentas, Cat. No. EP0701) BD
Chromagar Candida (Cat. No.254093)
YPD Agar
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2％ Bacto-peptone, 1％ yeast extract, 2％ dextrose
BHI broth (Difco, Cat. No. 0037-17)
33.7％ Calf brain heart infusion solid, 13.5％ Beef heart infusion solid, 27％
Proteose peptone, 5.4％ Glucose, 13.5％ Sodium chloride, 6.7％ Disodium phosphate
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) (Cat. No.BCBD 0884V)
Sabouraud dextrose agar (SDA) PFIZER
Fluconazole
voriconazole
anidulafungin
4 儀器設備
VITEK 2 DensiChek Kit 濁度儀
VITEK 2 Cassette 卡架
Biotrak Ⅱ 分光光度儀 (Amersham Biosciences)
12x75mm 乾淨的透明塑膠材質試管
無菌竹棒
試管震盪器 Vortex-2 genie (Scientific Industry)
程式溫度控制儀 PTC-200 (MJ Research)
電子天帄 AT261 DeltaRange (METTLER TOLEDO)
電泳影像擷取分析系統 (Alpha Innotech Corporation)
水帄式電影槽 SUB-CELL GT (BIO-RED)
單槽乾浴器 (Violet Bio Science, Inc.)
傳統比色計
96孔盤 (Cat No.COR3599)
震盪器 VORTEX-GENIE2 G560 （SCIENTIFIC INDUSTRICS）
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加熱攪拌器 S101 （FIRSTEK SCIENTIFIC）
酸鹼值檢測計 Φ360 （BECKMAN）
迴轉式震盪培養箱 (TKS）
4℃三門冰藏櫃 KS-101-MS （MINI KINGKON）
-20℃直立冷凍櫃 （WHITE-WESTINGHOUSE）
-80℃超低溫冷凍櫃 925/926 （FIRSTEK SCIENTIFIC）
微量高速離心機 DENVILLE 260D（DENVILLE SCIENTIFIC INC.）
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5 臨床菌株的收集，培養和鑑定
5.1 2010年全國性黴菌抗藥性監測 (2010 TSARY)
由各家醫院以棉花棒收集病患痰液、血液、膿、導管、微量吸管、口腔、氣 管沖洗液、腹水、腹部傷口、膽汁、耳部、尿液、陰部、肺部、指甲、糞便、喉 部，傷口，脊髓液等部位的檢體，收集所有來自無菌部位的檢體，非無菌部位白 色念珠菌 (C.albicans) 以 10 株為上限，非無菌部位非白色念珠菌(non-albicans Candida) 以 40 株為上限作為流行病學分析。在參與計畫的 24 家醫院 (財團法 人台灣基督教門諾會醫院、行政院衛生署花蓮醫院、花蓮慈濟綜合醫院、彰化基 督教醫院、中山醫學大學附設醫院、光田醫療社團法人光田綜合醫院、彰化秀傳 紀念醫院、童綜合醫療社團法人童綜合醫院、台中榮民總醫院、財團法人仁愛綜 合醫院、澄清醫院、國泰綜合醫院、羅東博愛醫院、天主教靈醫會羅東聖母醫院、
敏盛綜合醫院、台北市立聯合醫院和帄院區、三軍總醫院、亞東紀念醫院、長庚 紀念醫院高雄院區、台灣基督長老教會新樓醫院、財團法人嘉義基督教醫院、國 軍高雄總醫院、成大醫院、高雄榮民總醫院) 總共收集了 1117 株臨床菌株運送 到國家衛生研究院，其中有 5 個臨床菌株在收菌後無法在 SDA 培養基上生長，
由國家衛生研究院再次進行菌種鑑定後，在部分臨床檢體發現有不只單一菌種的 情況，再進行菌種鑑定後增加 12 個菌株，總共收集 1124 株臨床菌株進行分析。
醫院送來的檢體皆會附上由各醫院菌種鑑定的結果，由羅秀容老師實驗室進行以 下的的鑑定流程如下，將各醫院初步鑑定為白色念珠菌者進行芽管試驗 (germ tube assay)，若長出芽管則判斷為 C. albicans，並將其它 non-albicans Candida 的 菌種培養在 SDA 培養基取純菌落利用 VITEK 2 酵母菌鑑定卡進行鑑定，菌種鑑 定的結果大於等於百分之八十五以上代表鑑定結果可信賴，若小於百分之八十五，
則表示菌種鑑定率低 (low discrimination) 或不可鑑定(unidentified)，此時將會再 培養於 CHROMagar 培養基以顏色區分確定是否為單一菌種，繼續以 ITS 引子 或 D1/D2 引子針對黴菌核醣體 DNA (ribosomal DNA) 片段進行序列分析鑑定菌
9 學附設醫院 (流水編號 2009H0001~2009H0282)、義大醫院 (流水編號
2009H2001~2009H2106) 三家醫院的門診愛滋病患 (HIV-infected patients) 口腔 兩側進行採樣於民國 98 年 10 月為期四個月，將臨床口腔檢體的棉棒塗在 CHROMagar Candida 培養基 (Odds and Bernaerts, 1994; Sahand et al., 2005) 邊 緣一小區，再利用滅菌的竹棒以三區畫法劃開，在嗜氧環境 35℃ 培養 2-3 天
tropicalis 呈現代金屬光澤的深藍紫色菌落, C. krusei 呈現帶有白邊的淡粉紅色的 扁帄菌落，可作為協助初步篩選非單一菌種的鑑定。
4.3 微鐵克 2 (VITEK 2) 酵母菌鑑定卡
先從-80℃冰箱取出臨床菌株的凍管，使用滅菌的竹棒取適量菌液培養在 Sabouraud dextrose agar 於 35℃培養箱 18 至 24 小時，使用滅菌竹棒取足夠的純 菌落數均勻混和於 3 ml 濃度 0.45％且酸鹼值介於 5.0 和 7.2 之間的無菌食鹽水
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當菌液充滿於卡片存放於 VITEK 2 中，將 Cassette 上剩下的試管及菌液等從 VITEK 2 中取出。等待約十八小時後，生化反應鑑定的結果將會輸出在電腦。
4.4 聚合酶連鎖酵素反應 (Polymerase chain reaction, PCR )
來自台灣各醫院的臨床檢體依照 MastePure TMYeast DNA Purification Kit 的 說明書純化 DNA，利用所設計的引子 (ITS1) 5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’
和 (ITS4) 5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’ 或 (NL1) 5’ GCATATCAATAAGCG G A GGAA AAG3’和(NL4) 5’GGTCCGTG TTTCAAGACGG 3’ 針對真菌 RNA 核 醣體 internal transcribed spacer (ITS) 和 D1/D2 區域欲增幅的片段進行放大，ITS 適用於具致病性的黴菌菌種，亦適合鑑定不同菌屬間的鑑定，而 D1/D2 序列存 在於所有黴菌，包括非致病菌種，適用於鑑定於菌種間菌株(Leaw et al., 2006)，
總體積50μl 的混合液包含 5μl 的 10 X DreamTagTM buffer，1.25 unit DreamTagTM DNA polymerase (5 unit /μl, Fermentas, Cat. No. EP0701)，4μl 的 2.5 mM dNTP，1μl 的 25 mM MgCl2，5μl 的 50μM 的 forward primer 和 reverse primer，0.1~1 μg 的 genomic DNA 模板， 1.2 U Tag polymerase (0.25 ul) DNA (2 ul) , 補滅菌二次水 至50μl，反應條件：94℃ 3 分鐘→ 94℃ 30 秒、60℃ 30 秒、72℃ 30 秒 (重複此 步驟 30 個循環) → 72℃ 3 分鐘→ 4 ℃暫置，接著萃取 DNA 的步驟遵守
FavorPrep™ PCR Clean-UP Kit 說明書使用，將特定區域的序列送到 NCBI 做序 列比對。
4.5 製備藥盤
首先將實驗所需的藥物 amphotericin B、anidulafungin、fluconazole、
voriconazole 溶於有機溶劑 dimethyl sulfoxide (DMSO)中後，使用 RPMI 1640 （無 bicarbonate 及含 glutamine 與酸鹼指示劑）的培養基來稀釋藥物配成本實驗使用 最高藥物濃度的二倍濃度： amphotericin B (32 mg/L)、anidulafungin (16 mg/L) 、 fluconazole (128 mg/L)、voriconazole (16 mg/L)，每一種藥物進行二倍序列稀釋，
最終配成十個濃度，故藥物範圍分別是 Amphotericin B (0.0625 ~ 32 mg/ L)，
anidulafungin (0.0313 ~ 16 mg/L)，fluconazole (0.25 ~ 128 mg/L)，voriconazole (0.0313 ~ 16 mg/L)，分別在 96 孔盤第一到第十個及第十一個孔盤加入 100μl (第 十一個孔盤為控制組)，第十二個孔盤加入 200μl (此孔盤不加菌液)。
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4.6 肉湯微稀釋法 (broth microdilution)測定臨床菌株的最 小抑制濃度
根據美國臨床實驗室國家標準委員會 (Clinical and Laboratory Standards Institute) 所建議的 M27-A3 的修編版本進行實驗(CLSI, 2008)。實驗操作前須先 配製適量 RPMI 1640 broth、無菌 0.85% NaCl，放置於 1 升的血清瓶中，並裝上 分注器置於 4℃冰箱中備用，四種藥物濃度梯度之抗藥性試驗培養盤，放置於 -80℃冰箱中備用。
作法:
第一天
1. 自-80℃冰箱取出標示有編號的單一菌株存菌管以及標準菌株 YLO 6 (ATCC® 6258)，YLO 7 (ATCC® 22019)，YLO 12 (ATCC® 90028)，用竹棒挖取少許菌液，
放到含有 1 ml BHI 的 24 孔盤，置於 35℃培養箱培養 18-24 小時(念珠菌培養於 此條件，若是培養 Cryptococcus neoformans 菌株則是培養於 35℃約 48 小時)。
2.取出所需數量的 12×75 ㎜玻璃試管，以標示筆標示待測菌株編號，至於鐵架，
以鋁箔紙覆蓋後，利用高壓滅菌鍋進行滅菌，滅菌後取出備用。
3.取無菌離心管，標示待測菌株編號後，放置於鐵架上備用。
第二天
1.至-80℃冰櫃中取出適量已配好的 2 倍濃度梯度之抗藥性試驗培養盤，放置於室 溫下回溫備用並將抗藥性試驗培養盤依序標示檢體編號。
2.取出經 24 小時 35℃培養的 24 孔盤，利用 Pipet 混合均勻，吸取適量菌液，加 入含有 2 ml 0.85% NaCl 的玻璃試管，充分混合均勻後在 530nm 波長下利用比 色計測其波長，調整到菌液濃度約為 0.5 McFarland，過高或偏低可利用比色計 調整，此時菌液濃度約 1 ~ 5 × 106 cells / ml。
3.將菌液震盪均勻後取 0.1 ml 在 4.9 ml 0.85% NaCl 完成 50 倍稀釋，再從上述菌 液中取 0.2 ml 在 3.8 ml RPMI 1640 培養基完成稀釋 20 倍，總共稀釋 1000 倍，
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將稀釋好的 RPMI 1640 broth 菌液的離心管混合均勻後，倒入無菌藥品槽，利用 12 爪 Pipet 裝上 11 支 tips，吸取 100 μl 菌液，同時加入 96 孔盤 A 列 1~11 行的 兩倍藥物濃度序列稀釋的藥盤中，第 12 行不加菌液。依序把同一菌液加入 amphotericin B (0.0313 ~ 16 mg/L)，fluconazole (0.125 ~ 64 mg/L) 和 voriconazole (0.0156 ~ 8mg/L) 藥盤中，此時藥盤濃度稀釋一倍，更換 tips，依序將菌液分別 加入 B~H 列，而菌液稀釋倍率為 2000 倍，最終接種數量約 0.5 ~ 2.5 × 103 cells/ml。
4.添加完畢後，蓋上抗藥性試驗培養盤蓋子，放入 35℃培養箱中分別培養 24 和 48 小時候測吸光值。
第三天
1.讀取培養盤菌液生長濃度，開啟 Biotrack II plate reader 電源，於主畫面中進入
1.讀取培養盤菌液生長濃度，開啟 Biotrack II plate reader 電源，於主畫面中進入