4. 臨床菌株的收集，培養和鑑定
4.5 製備藥盤
首先將實驗所需的藥物 amphotericin B、anidulafungin、fluconazole、
voriconazole 溶於有機溶劑 dimethyl sulfoxide (DMSO)中後，使用 RPMI 1640 （無 bicarbonate 及含 glutamine 與酸鹼指示劑）的培養基來稀釋藥物配成本實驗使用 最高藥物濃度的二倍濃度： amphotericin B (32 mg/L)、anidulafungin (16 mg/L) 、 fluconazole (128 mg/L)、voriconazole (16 mg/L)，每一種藥物進行二倍序列稀釋，
最終配成十個濃度，故藥物範圍分別是 Amphotericin B (0.0625 ~ 32 mg/ L)，
anidulafungin (0.0313 ~ 16 mg/L)，fluconazole (0.25 ~ 128 mg/L)，voriconazole (0.0313 ~ 16 mg/L)，分別在 96 孔盤第一到第十個及第十一個孔盤加入 100μl (第 十一個孔盤為控制組)，第十二個孔盤加入 200μl (此孔盤不加菌液)。
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4.6 肉湯微稀釋法 (broth microdilution)測定臨床菌株的最 小抑制濃度
根據美國臨床實驗室國家標準委員會 (Clinical and Laboratory Standards Institute) 所建議的 M27-A3 的修編版本進行實驗(CLSI, 2008)。實驗操作前須先 配製適量 RPMI 1640 broth、無菌 0.85% NaCl，放置於 1 升的血清瓶中，並裝上 分注器置於 4℃冰箱中備用，四種藥物濃度梯度之抗藥性試驗培養盤，放置於 -80℃冰箱中備用。
作法:
第一天
1. 自-80℃冰箱取出標示有編號的單一菌株存菌管以及標準菌株 YLO 6 (ATCC® 6258)，YLO 7 (ATCC® 22019)，YLO 12 (ATCC® 90028)，用竹棒挖取少許菌液，
放到含有 1 ml BHI 的 24 孔盤，置於 35℃培養箱培養 18-24 小時(念珠菌培養於 此條件，若是培養 Cryptococcus neoformans 菌株則是培養於 35℃約 48 小時)。
2.取出所需數量的 12×75 ㎜玻璃試管，以標示筆標示待測菌株編號，至於鐵架，
以鋁箔紙覆蓋後，利用高壓滅菌鍋進行滅菌，滅菌後取出備用。
3.取無菌離心管，標示待測菌株編號後，放置於鐵架上備用。
第二天
1.至-80℃冰櫃中取出適量已配好的 2 倍濃度梯度之抗藥性試驗培養盤，放置於室 溫下回溫備用並將抗藥性試驗培養盤依序標示檢體編號。
2.取出經 24 小時 35℃培養的 24 孔盤，利用 Pipet 混合均勻，吸取適量菌液，加 入含有 2 ml 0.85% NaCl 的玻璃試管，充分混合均勻後在 530nm 波長下利用比 色計測其波長，調整到菌液濃度約為 0.5 McFarland，過高或偏低可利用比色計 調整，此時菌液濃度約 1 ~ 5 × 106 cells / ml。
3.將菌液震盪均勻後取 0.1 ml 在 4.9 ml 0.85% NaCl 完成 50 倍稀釋，再從上述菌 液中取 0.2 ml 在 3.8 ml RPMI 1640 培養基完成稀釋 20 倍，總共稀釋 1000 倍，
12
將稀釋好的 RPMI 1640 broth 菌液的離心管混合均勻後，倒入無菌藥品槽，利用 12 爪 Pipet 裝上 11 支 tips，吸取 100 μl 菌液，同時加入 96 孔盤 A 列 1~11 行的 兩倍藥物濃度序列稀釋的藥盤中，第 12 行不加菌液。依序把同一菌液加入 amphotericin B (0.0313 ~ 16 mg/L)，fluconazole (0.125 ~ 64 mg/L) 和 voriconazole (0.0156 ~ 8mg/L) 藥盤中，此時藥盤濃度稀釋一倍，更換 tips，依序將菌液分別 加入 B~H 列，而菌液稀釋倍率為 2000 倍，最終接種數量約 0.5 ~ 2.5 × 103 cells/ml。
4.添加完畢後，蓋上抗藥性試驗培養盤蓋子，放入 35℃培養箱中分別培養 24 和 48 小時候測吸光值。
第三天
1.讀取培養盤菌液生長濃度，開啟 Biotrack II plate reader 電源，於主畫面中進入 select method 中選 YEASTAH 後，機器會進入 YEASTAH 模式。
2.啟動電腦，在桌面上點選 Bio DC 程式捷徑，開啟視窗後，點選 run，將輸出 模式(F3)改選成‖serial ―直接將數據輸出到電腦存取。
3.取出已經 35℃培養 24 小時的抗藥性試驗培養盤，放在具有 96 孔盤專用承載盤 的震盪器上，調整震盪速度於 2~3 之間，震盪時間約 1 min。震盪均勻後，將 培養盤蓋子移開，將培養盤放置於 Biotrack II plate reader 的讀取槽內。在 Biotrack II plate reader 上輸入該培養盤的編號後，接著選點 run，則培養盤會 進入機器內部讀取吸光值。讀取完畢後培養盤會退出，且在電腦程式中顯示出 96 孔盤的 OD 數值。
4.將培養盤取出，並將培養盤蓋子蓋上，重複操作步驟 3 直到全部的培養盤都讀 取完成後，於 Bio DC 點選 finish 將結果匯出到 Excel 並存檔，培養盤放回 35℃培養箱繼續培養 24hr。
第四天
讀取 48 小時 (Cryptococcus neoformans 則是需要測第 72 小時)培養盤黴菌生 長濃度，重複第三天的操作方式，利用 Excel 中 If 函數的功能
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〔if(value>5,‖R‖,mic conc.)〕，在 AmB 若百分比數值值＞5 則顯示 R，若 OD 值<5 則顯示該孔盤的試藥濃度；〔if(value <=50,‖R‖,mic conc.)〕，在 Flu 若百 分比數值>50，則顯示 R，若百分比數值<=50 則顯示該孔盤的試藥濃度。讀 取 MIC 數值，並將結果輸入資料庫中。
4.7 分別以美國臨床實驗室國家標準委員 (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) 和歐洲藥敏試驗委 員會(European committee for antimicrobial susceptibility testing, EUCAST)利用肉湯微稀釋法 (broth microdilution) 測定臨床菌株的最小抑菌濃度 (MIC)
根據美國臨床實驗室國家標準委員會所建議的 M27-A3 的修編版本和歐洲 藥敏試驗委員會(Rodriguez-Tudela et al., 2003)，兩者在實驗方法有些許差異(見 Appendix 1)，包括(1)葡萄糖濃度在美國臨床實驗室國家標準委員會是 0.2％，而 在歐洲藥敏試驗委員會是 2％；(2) 96 孔盤在美國臨床實驗室國家標準委員會是 圓球形底部，而在歐洲藥敏試驗委員會是扁帄形底部；(3)細胞接種在美國臨床 實驗室國家標準委員會是 0.5 ~ 2.5
×
103 CFU/ml，而在歐洲藥敏試驗委員會是 0.5~ 2.5
×
105 CFU/ml；(4) 結果判讀方面在美國臨床實驗室國家標準委員會是肉眼 判斷 (約 50％抑制程度)，而在歐洲藥敏試驗委員會則是由測吸光值判斷菌液生 長受藥物抑制達百分之五十程度的濃度定義為最小抑菌濃度(minimal inhibited concentration, MIC) (Rodriguez-Tudela et al., 2007)。實驗操作前須先配製適量 RPMI 1640 培養基 (適用於 CLSI 實驗方法)、
RPMI 1640 2％G 培養基 (RPMI 1640 含百分之二葡萄糖，適用於 EUCAST 實驗 方法)、無菌 0.85% NaCl、滅菌二次水，放置於 1 升的血清瓶中，並裝上分注器 置於 4℃冰箱中備用，另外製備下列四種藥物濃度梯度之抗藥性試驗 96 培養孔 盤(扁帄底部)，放置於-80℃冰箱中備用。
作法:
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第一天
1. 自-80℃冰箱取出標示有編號的單一菌株存菌管以及標準菌株 YLO 6
(ATCC® 6258)，YLO7 (ATCC® 22019)，YLO12 (ATCC® 90028)，用滅菌竹棒 挖取少許菌液培養在 SDA 培養基，置於 35℃培養箱培養 18-24 小時 (念珠 菌培養於此條件，若是培養 Cryptococcus neoformans 菌株則是培養於 35℃約 48 小時)。
2. 取出所需數量的 12×75mm 玻璃試管，以標示筆標示待測菌株編號，至於鐵 架，以鋁箔紙覆蓋後，利用高壓滅菌鍋進行滅菌，滅菌後取出備用。
3. 取無菌離心管，標示待測菌株編號後，放置於鐵架上備用。
第二天
1. 至-80℃冰櫃中取出適量已配好的 2 倍濃度梯度之抗藥性試驗培養 盤，放置於室溫下回溫備用並將抗藥性試驗培養盤依序標示檢體編號。
2. 取出經 24 小時 35℃培養的 24 孔盤，利用 Pipet 混合均勻，
吸取適量菌液，加入含有 2.5 ml 滅菌的二次水的玻璃試管，充分混合均勻後 在 530nm 波長下利用比色計測其波長，調整到菌液濃度約為 0.5 McFarland，
過高或偏低可利用比色計調整，此時可以得到約 1 ~ 5 × 106 cells / ml。
3. (CLSI 實驗流程)從步驟 2 的菌液中震盪均勻後取 0.1 ml 在 4.9 ml 0.85% NaCl (稀釋 50 倍)，從上述菌液中取 0.3 ml 在 5.7 ml RPMI 1640 培養基中(稀釋 20 倍)，總共稀釋 1000 倍，將稀釋好的 RPMI 1640 培養基菌液的離心管混合均 勻後，倒入無菌藥品槽，利用 12 爪 Pipet 裝上 11 支 tips，吸取 100 μl 菌液，
同時加入 96 孔盤 A 列 1~11 行的兩倍藥物濃度序列稀釋的藥盤中，第 12 行 不加菌液。依序把同一菌液加入 amphotericin B (0.0313 ~ 16 mg/L)，
anidulafungin (0.0156 ~ 8 mg/L)，fluconazole (0.125 ~ 64 mg/L) 和
voriconazole (0.0156 ~ 8 mg/L)藥盤中，此時藥盤濃度稀釋一倍，更換 tips，依 序將檢體分別加入 B~H 列，而菌液稀釋倍率為 2000 倍，最終接種數量約 0.5
~ 2.5 × 103 CFU/ml。
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4. (EUCAST 實驗流程)從步驟 2 的菌液中震盪均勻後取 0.6 ml 在 5.4 ml RPMI 1640 添加 2％G 培養基 (稀釋 10 倍)，將稀釋好的 RPMI 1640 添加 2％G 培 養液的離心管混合均勻後，倒入無菌藥品槽，利用 12 爪 Pipet 裝上 11 支 tips，
吸取100 μl 菌液，同時加入 96 孔盤 A 列 1~11 行的兩倍藥物濃度序列稀釋的 藥盤中，第 12 行不加菌液，為無菌操作的對照組。依序把同一菌液加入 amphotericin B (0.0313 ~ 16 mg/L)，anidulafungin (0.0156 ~ 8 mg/L)，
fluconazole (0.125 ~ 64 mg/L) 和 voriconazole (0.0156 ~ 8mg/L)藥盤中，更換 tips，依序將檢體分別加入 B~H 列，此時藥盤濃度稀釋一倍，而菌液稀釋倍 率為 20 倍，最終接種數量約 0.5~2.5 × 105 CFU/ml。
添加完畢後，蓋上抗藥性試驗培養盤蓋子，放入 35℃培養箱中分
別培養 24 小時(供 CLSI 和 EUCAST 結果判讀)和 48 小時(供 CLSI 結果判讀) 候測吸光值。
第三天
1. 讀取培養盤菌液生長濃度，開啟 Biotrack II plate reader 電源，
於主畫面中進入 select method 中選 YEASTAH 後，機器會進入 YEASTAH 模 式。
2. 啟動電腦，在桌面上點選 Bio DC 程式捷徑，開啟視窗後，點選 run，將輸出 模式(F3)改選成‖serial ―直接將數據輸出到電腦存取。
3.取出已經 35℃培養 24 小時的抗藥性試驗培養盤，放在具有 96 孔盤專用承 載盤的震盪器上，調整震盪速度於 2~3 之間，震盪時間約 1 min。震盪均勻後，
將培養盤蓋子移開，將培養盤放置於 Biotrack II plate reader 的讀取槽內。在 Biotrack II plate reader 上輸入該培養盤的編號後，接著選點 run，則培養盤會 進入機器內部讀取吸光值。讀取完畢後培養盤會退出，且在電腦程式中顯示 出 96 孔盤的 OD 數值以供 CLSI 和 EUCAST 方法分析。EUCAST 方法在接菌 後的藥盤培養至 35℃24 小時後若其吸光值(OD595)低於 0.5 (常見於 C.
parapsilosis 和 C. guilliermondii)，則必須再培養 12 至 24 小時觀察，若 培養
16
48 小時其 OD 值仍低於 0.5 則需要重測。
4.將培養盤取出，並將培養盤蓋子蓋上，重複操作步驟 3 直到全部的培養盤都讀 取完成後，於 Bio DC 點選 finish 將結果匯出到 Excel 並存檔，培養盤放回 35℃培養箱繼續培養 24hr 以供 CLSI 方法分析。
第四天
讀取 48 小時 (Cryptococcus neoformans 則是需要測第 72 小時 OD 值)培養盤黴 菌生長濃度，重複第三天的操作方式，讀取 MIC 數值，並將結果輸入資料庫 中。
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二、 結果
1. 2010 全國黴菌抗藥性監測計畫臨床菌株的菌種分布
由在 2010年全國黴菌抗藥性監測計畫中 (Taiwan Surveillance of Antimicrobial Resistance of Yeasts, TSARY) ，總共從台灣24醫院收集了1124臨床菌株，經國家衛 生研究院羅秀容老師實驗室以 VITEK 2 和序列分析對菌種鑑定的結果，總共得到 28 個菌種，分別是: 427 株C. albicans，267株 C. tropicalis，258株 C. glabrata，
89株 C. parapsilosis，18株C. krusei，15株 Cryptococcus neoformans，4株 Candida nivariensis，8株 Candida guilliermondii，7株 Trichosporon asahii，4株 Kodamaea ohmeri，3株 Candida pelliculosa，3株 Pichia mississippiensis，2株 Trichosporon mucoides，1株 Candida catenulate，2株 Candida dubliniensis，1株 Candida famata，
1株 Candida haemulonii，1株 Candida intermedia，1株 C. lusitaniae，1株 Candida metapsilosis，1株 Candida orthopsilosis，1株 Pichia farinosa，1株 Candida utilis，
1株 Cryptococcus albidus，1株 Rhodosporidium fluviale，1株 Rhodotorula minuta，
1株 Sterigmatomyces elviae，1株Trichosporm beigelii，以及臨床菌株中有1株 Candida sp. 和 2株 Trichosporon sp.菌種鑑定到同屬的結果。
其中，如Figure 1所示，以 C. albicans 佔所收集之臨床菌株的38.0％
(427/1124)，是所有念珠菌中比例最高的菌種，接著依序為C. tropicalis佔所 收集之臨床菌株的23.8％ (267/1124)， C. glabrata佔所收集之臨床菌株的 23.0％ (258/1124)，C. parapsilosis佔所收集之臨床菌株的7.9％ (89/1124)，
C. krusei佔所收集之臨床菌株的1.6％ (18/1124)，其它部分含25種不同種類 菌種約佔5.8％ (65/1124)，相較於2002年其它部分22種不同種類菌種約佔10.0％
(95/953)與2006年其它22種部分不同種類菌種約佔6.3％ (66/1050)在種類上是增加 的，但所佔比例的卻減少。
如Figure 2所示：2010年全國黴菌抗藥性監測計畫各類念珠菌的分布
中，C. albicans 出現的比例由 2002 年和 2006 年的 43.5％ 下降至 2010 年 的
18
38.0％，C .tropicalis 出現的比例為 2002 年的 26.8％，2006 年的 25.5％ 及 2010 年的 23.8％，然而 C. glabrata 出現的比例由 2002 年的 20.6％，2006 年的 21.9
％ 至 2010 年的 23.0％，C. parapsilosis 出現的比例由 2002 年的 6.9％和 2006 年的 6.4％升至 2010 年的 7.9％，C. krusei 出現的比例由 2002 年的 1.0％和 2006 年的 1.5％及 2010 年的 1.6％，經由統計檢定後，C. albicans，C .tropicalis，C. glabrata，
C. parapsilosis，C. krusei 在 1999 年至 2010 年的抗黴菌監測性計畫的菌種分布並無 明顯變化 ( p value＞0.05 )。在結果分析部分，在收集的 1124 株臨床菌株中，其中 1063 符合歐洲藥檢委員會 (European Committee for Antimicrobial Susceptibility
C. parapsilosis，C. krusei 在 1999 年至 2010 年的抗黴菌監測性計畫的菌種分布並無 明顯變化 ( p value＞0.05 )。在結果分析部分，在收集的 1124 株臨床菌株中，其中 1063 符合歐洲藥檢委員會 (European Committee for Antimicrobial Susceptibility