抗體（Antibody）

Mouse Anti-His tag antibody (Novagen TM)

Goat anti-mouse IgG，AP Conjugate labeled antibody (ZYMED) Anti-mouse Peroxidase （Kirkegaard Perry Liboratories；KPL）

FITC-conjugated anti-Rabbit IgG (H+L)

HRP-labeled anti-Mouse IgG (H+L) (Kirkegaard Perry Laboratories) 2.2.6 引子(primer) VH 5’ sense primers

MHyVH1 gct gcc caa cca gcc atg gcc ctc gag gtr mag ctt cag gag tc MHyVH4 gct gcc caa cca gcc atg gcc ctc gag gtc car ctg caa car tc MHyVH9 gct gcc caa cca gcc atg gcc ctc gag gtg awg ytg gtg gag tc MHyVH10 gct gcc caa cca gcc atg gcc ctc gag gtg cag skg gtg gag tc VH 3’ reverse primers

MHyIgGCH1-B1 cga tgg gcc ctt ggt gga ggc tga gga gac ggt gac cgt ggt MHyIgGCH1-B2 cga tgg gcc ctt ggt gga ggc tga gga gac tgt gag agt ggt MHyIgGCH1-B3 cga tgg gcc ctt ggt gga ggc tgc aga gac agt gac cag agt MHyIgGCH1-B4 cga tgg gcc ctt ggt gga ggc tga gga gac ggt gac tga ggt LC6’

5-’CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA-3’

κ

5’-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’

2.2.7 奈米金粒子(HAuCl4 · 3H2O)

Gold(III) chloride trihydrate (SIGMA)(感謝亞洲大學黃素華博士提供)

2.2.8 實驗試劑及緩衝液 見附表

第三節 實驗方法

2.3.1 病毒重組蛋白誘導 (protein induction)

將含有病毒片段的質體的單一菌落，用 10ml LB 含抗生素在 37℃的培養箱中轉速為 250r.p.m 增菌一夜後，加入到 500ml LB 含抗 生素在 37℃的培養箱中在增菌 3 小時，吸光值範圍達 OD 600nm 約 為 0.4 到 1 間，加入 isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside(IPTG) 0.8M 500 μl，使最終濃度為 0.8mM，在 16℃培養箱中轉速 250r.p.m 搖晃 16 小時以上，將菌液以 6000r.p.m 離心 30 分鐘，移除上清液後，加 入 20ml 的 20mM imidozolec 回溶細胞沉澱物，回收上清液。置於超 音波擊碎（sonicator）30 分鐘將細菌打碎。再以 4℃ 8000r.p.m 離心 30 分鐘，回收上清液。

2.3.2 病毒重組蛋白純化(Protein purification)

使用Fast Protein Liquid Chromatography(FPLC)純化病毒重組蛋 白，在管柱中先裝填入10ml的Ni Sepharose^TM (GE Healthcare)，將已 打碎的細胞上清液使用幫浦通過管柱。使用100mM imidazole沖洗管

柱，再以400mM沖洗管柱將純化後的蛋白析出。

2.3.3 蛋白濃度測定

使用胎牛血清蛋白濃度為 1mg/ml，配製濃度為 0、0.9、1.95、3.9、

7.8、15.625、31.25μg/ml 各 10μl，加入到含 990μlBio-Rad protein assay 的 1.5ml 微量離心管中。使用 BECKMAN 紫外及可見分光度計算出 吸光值，帶回線性回歸公式，做出標準曲線，R²必頇大於 0.995 方為 可信區間。再取從管柱析出的蛋白取 10μl 加到含 990μl Bio-Rad protein assay 中，使用 OD595nm 測得各管濃度。

2.3.4 蛋白質電泳分析（SDS-PAGE）

將收下的蛋白質樣品取 50μl，加到含 50μl 2X protein loading dye 的 1.5ml 微量離心管，用乾浴器加熱變性使用 110℃煮 5 分鐘，靜置 冰上 5 分鐘使其冷卻即完成樣品前處理。SDS-PAGE 凝膠分上下兩 層，下層 separating gel 配製 12%，上層的 stacking gel 則配製 4%，在 SDS-PAGE 中 蛋 白 質 會 依 分 子 量 分 離 。 將 配 製 好 的 膠 體 放 置 在 Bio-Rad 電泳槽內，倒入 Running buffer，將 Protein Molecular Weight Marker 及蛋白質樣品注入 SDS-PAGE 的的孔槽中，通以電壓 80 Volts 30 分鐘，待樣品通過上層的 stacking gel 後，在通以電壓 110 Volts 70 分鐘，視實驗需要決定樣本跑到哪個位子。

2.3.5 西方墨點法（Western bloting）

本實驗是使用 Bio-Rad 半乾式電泳轉漬槽的電泳裝置，裁切電泳 膠中所頇轉漬的區域後，浸泡於 transfer buffer 中，將 NC membrane 與 3M 濾 紙 浸 泡在 transfer buffer 中 。 轉 印 石 墨 板的 正 極 板 以 transfer buffer 潤濕後，依序重疊平鋪 3 張 3M 濾紙、PVDF mem-brane、gel、3 張 3M 濾紙，小心去除氣泡，轉印紙位向正極，膠片 位向負極。電流 10V，電流 400mA 經 45 分鐘後將 PVDF membrane 取出，浸泡於以 1x TBST 泡好的 5 % 脫脂牛奶中，室溫搖晃 1 小 時，以 1x TBST 清洗 PVDF membrane 10 分鐘 3 次，加入一級抗 體 anti-His (1:2000 1x TBST 稀釋)，置於 4℃下搖晃作用 3 小時，再 以 1x TBST buffer 清洗 membrane 10 分鐘 3 次，加入二級抗體 anti-mouse Co-AP tag (1: 2000 1x TBST 稀釋)，使其在室溫下搖晃作 用 2 小時之後，用 1x TBST buffer 清洗 10 分鐘 3 次，再加入 NBT/TCIP 顯影劑，反應至呈色。呈色完成後加入 ddH2O 使反應終 止，晾乾後保存。

2.3.6 抗體免疫誘發(感謝中醫所萬磊博士指導)

採用購自國家動物中心6-8週齡BALB/c 小白鼠，將純化出的病 毒重組蛋白與等量TiterMax® 以MICRO-EMULSIFYING NDLS混合

均勻，打入實驗小鼠皮下。在兩週之後進行第二次免疫誘發反應，將 病毒重組蛋白與等量佛氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant;

IFA)以MICRO-EMULSIFYING NDLS一樣混合均勻，打入實驗小鼠 皮 下 。 在 於 兩 週 後 ， 病 毒 重 組 蛋 白 與 減 半 量 佛 氏 不 完 全 佐 劑 (incomplete Freund’s adjuvant; IFA)以MICRO-EMULSIFYING NDLS 混合均勻，打入實驗小鼠皮下。再於兩週後，進行最後一次免疫誘發 反應，直接以病毒重組蛋白注射小鼠腹腔。採集眼窩血，進行抗體與 抗原效價測定。若反應為陽性，則一週後進行融合實驗。

2.3.7 細胞融合

將骨髓瘤細胞(SP2/O-Ag14)沖洗並離心下來，使用30ml RPMI -1640(無血清)沖洗細胞，並完成細胞數計算，並保存在37℃下。小白 鼠以二氧化碳法處理，待實驗小鼠犧牲後以大頭針固定於保麗龍板 上，以酒精噴霧擦拭小鼠，然後以無菌操作將腹腔切開，小心取出脾 臟置於冰上的含10ml RPMI-1640滅菌玻璃培養皿內，以1mL 無菌注 射針筒反覆沖洗脾臟細胞。將沖洗出之脾臟細胞再以50ml離心管收 集，再加入20ml RPMI-1640，靜止等待細胞殘骸沉澱後，收集上清液 後以900 rpm 十二分鐘離心，將沉澱之細胞以10ml沖洗三次並完成細 胞記數。最後將分別清洗過之5倍脾臟細胞與1倍SP2/O -Ag14細胞以 不含血清之RPMI-1640混合之，混合後的細胞使用30ml RPMI-1640沖

洗兩次以上後，吸掉多餘上清液，將細胞液之離心管置於37℃的溫水 中，於60 秒內在掁盪中緩慢滴入PEG1500 1 ml，再於1分鐘內緩慢滴 入不含血清之RPMI-1640 1ml，接著再於2分鐘內緩慢滴入不含血清之 RPMI -1640 8 ml，最後將10ml細胞液放置在37℃細胞培養箱中10分 鐘。將培養箱中細胞拿出離心900r.p.m 10分鐘後，吸掉多餘上清液後 加入含20%FBS、10%BM、1%L-glu、1%PS的PMI-1640 50ml，並分 裝於5盤96 孔細胞培養盤內，每孔100μL，於5％CO2的37℃培養箱中 培養觀察。

2.3.8 極限稀釋法(limit dilution)

將融合後細胞，每天取出觀察細胞生長情況，於一週後每孔盤加 入含10%FBS、1%PS 的100μl RPMI-1640。再將生長狀況良好融合瘤 細胞進行極限稀釋(limit dilution) 使細胞單株化。

2.3.9 酵素連結免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay;

ELISA)

將JEV病毒液2x10⁵ pfuml^-1或病毒重組蛋白10μg加入等量coating buffer，96孔盤中每孔加入100μl，放置在4℃冰箱中隔夜。將96孔盤 上清液去除，每孔加入100μl的5％ 脫脂奶粉作用1個小時，之後使用 TBST沖洗三次，每次7分鐘。使用細胞上清液當作第一抗體，每孔加 入100μl作用1小時。去除孔盤上清液，使用TBST沖洗三次，每次7分

鐘。再加入第二抗體(goat anti-mouse peroxidase ; HRP)作用1小時。去 除孔盤上清液，使用TBST沖洗三次，每次7分鐘。使用ABTS® 呈色 試劑組(KPL)，等量試劑A加入試劑B。在避光環境下，每一孔加入 100μl呈色劑，作用20分鐘後，使用ELISA reader 測其OD(405nm)之 數值。

2.3.10 中和試驗(Neutralization test; NT)

將BHK-21培養在2盤6孔盤中，細胞數約為2x10⁶ 。將第一抗體 分別稀釋成原倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍，先將各濃度抗體 與2x10⁵ pfuml^-1的JEV在4℃下搖晃作用1小時。分別將不同濃度抗體含 病毒液加入到6孔盤中，二重複，保留一個對照組只加病毒液，不加 抗體。在5％CO2的37℃培養箱中作用1小時，每隔15分鐘輕輕搖晃，

讓抗體、病毒、細胞均勻混合後，加入覆蓋液。每天觀察細胞病變現 象(CPE)，當CPE達到80%後，加入染色液。作用1小時後，小心倒掉 染色液，待乾後，仔細計算噬菌斑(plaques)數目。

2.3.11 細胞內免疫螢光染色（Immunofluorescence staining,IF）

以 1x PBS 清洗 2 次 6 孔盤 內的 BHK-21 細胞後，加入固定 液（3.7%福馬林、10% acetone in 1x PBS ）固定 30 分鐘後，加入 1%BSAblocking 1小時，再以 1x PBS 清洗的三次，去除上清液，加

入 5D6 抗體在室溫下搖晃作用 3 小時，去除 5D6 抗體後以 1x PBS 清洗 3 次。再加入 anti-mice FITC (1:2000) 抗體避光作用 2 小時，去除抗體後再以 1x PBS 清洗 3 次，將細胞於螢光顯微鏡下 觀察、拍照。

2.3.12 製備奈米金粒子(gold nanoparticles) (感謝亞洲大學黃素華博 士指導)

四氯金酸 HAuCl4 來自 Sigma (G4022) 公司購得。取2 ml l%

HAuCl4 加入去離子水體積至 200 ml，使其終濃度為 0.005%。加熱 攪拌至沸騰，再加入還原劑 3.6 ml 1% 檸檬酸三納 (trisodium citrate) 後，持續加熱攪拌沸騰。當HAuCl4減少時，奈米金溶液顏色由透明 轉變為灰色至黑色，再轉變為淡紫色至紅色。持續將溶液迴流20 min。室溫下慢慢冷卻後，以去離子水恢復原體積。然後，加入 0.1 M K2CO3 調至 pH 7.4 。粒徑小的奈米金會使溶液呈橘紅色，粒徑大的 則使溶液呈淡紫色。

2.3.13 奈米金吸附抗體的最適抗體濃度測定

取0.5 ml奈米金溶液 (pH7.4)分別加入等體積 (1 ml) 的抗體之 不同濃度，分別為320.340.360.380.400μl，進行奈米金吸附抗體步驟，

振盪並置於4 ℃下靜置約 5 分鐘。再於各管加入 50 μl 30% NaCl 均

勻混合，以未加入抗體的奈米金溶液為對照組，分別以目測法觀察和 分光光度計檢測。

2.3.14 奈米金吸附單株抗體

當奈米金吸附抗體的最適 pH 值和最適的抗體濃度決定後，便 可以製備結合奈米金粒子之抗體的複合物(gold nanoparticles-antibody conjugate )作為特異性標誌物，取 340μl之單株抗體溶液 , 加入 0.5 ml 之奈米金溶液內， 於 4 ℃下混合靜置 3~5 分鐘進行吸附，再加 入 50 μl 30% 之NaCl溶液幫助奈米金與蛋白質緊密地吸附，混合靜 置 15 分鐘後， 加入0.1 ml 5%casein 之遮蔽劑， 混合靜置15 分鐘，

以高速離心機(轉速 10,000 rpm) 離心15分鐘，吸取上清液以除去未 吸附的蛋白質，再加入 50 μl 2.5%casein與 50 μ l 10mM PBS (pH7.4) 振盪回溶，最後加入 10 μ l 0.1%NaN3 防腐，置於4 ℃備用。

第三章 結果 3.1 病毒重組蛋白純化

將帶有 JEV EDIII 片段的 pET24a，BL21 品系的大腸菌株，大量 表現重組蛋白後。使用 Fast Protein Liquid Chromatogra- phy(FPLC)以 純化回收，日本腦炎套膜蛋白區域 III 約為 100 個胺基酸所構成的蛋 白質，可從 SDS-PAGE 利用 Coomassie blue 染劑染色，觀察 EDIII 蛋 白質純化後的程度(圖一 A)，可觀察到 ED3 蛋白有明顯的表現，也沒 有 其 他 蛋白 的表現 ， 證 明蛋 白純度 非 常 高。 再經由 西 方 墨點 法

（Western Blotting），第一抗體為 anti-His，第二抗體為 mouse co-Ap，

確定得到約為 13 KDa 的蛋白質(圖一 B)，而分子量大小與 ED3 符 合，經由本實驗得到了 JEV ED3 的重組蛋白。

3.2 實驗小鼠抗體效價誘發測定

經過免疫計畫(如附錄)誘發七隻實驗小鼠抗體的產生，在犧牲前

一週採取血清後，使用 ELISA 測定對抗原的效價。依照稀釋的倍數 越高，每組老鼠血清對抗原的效價，OD405 之讀值依倍數下降。控 制組讀值約為 0.1。稀釋 50 倍條件下，其中第 2,3 號實驗小鼠與控制 組有 2.5 倍的差距，第 7 號小鼠有 1.5 倍的差距，餘下小鼠與控制組 沒有明顯差距。箭號所指便是本次研究所以犧牲的實驗小鼠(mice 7)

3.3 融合瘤細胞抗體效價測定

犧牲小鼠後，將脾臟細胞與老鼠骨髓瘤(myeloma)細胞(SP2/O -Ag14) 融 合 後 ， 形 成 融 合 瘤 細 胞 。 培 養 在 培 養 於 含 10 % FBS RPMI-1640 的培養基中，每日觀察生長情形後，待細胞生長穩定後，

吸取細胞上清液為第一抗體，一共有 37 株融合瘤細胞進行測試(圖

吸取細胞上清液為第一抗體，一共有 37 株融合瘤細胞進行測試(圖