本次研究探討經動物模式誘導取得抗體後，經過一連串的篩選抗 體步驟，得到專一性性拮抗原態病毒及重組蛋白的單株抗體。以及討 討是否可以中和病毒複製能力、感染細胞內抗體標示情形。最後再接 合奈米金粒子，探討發展檢驗試劑發展潛力。
第一節 單株抗體拮抗病毒蛋白的探討
經過純化後的重組蛋白(圖一 B)，當做抗原使實驗小鼠誘發出抗 體(圖二)後，將脾臟細胞與老鼠骨髓瘤(myeloma)細胞融合後，經過篩 選後(圖三)(圖四)得到了專一性拮抗病毒蛋白的單株抗體 5D6。5D6 可以辦認到日本腦炎病毒套膜蛋白及重組蛋白 ED3(圖五)顯示此抗體 是具有可以同時辦認病毒及套膜蛋白，[37]中純化 dengue 2 virus 的 抗體，其西方點墨法分析抗原使用重組蛋白，但本研究同時採用了日 本腦炎病毒套膜蛋白及重組蛋白 ED3，其目的為探討 5D6 單株抗體 可辦認原來的抗原(ED3)，也同時可辦認日本腦炎病毒套膜蛋白。確 認在往下實驗可偵測到在宿主細胞中的日本腦炎病毒。為了確認抗體 濃度高低與抗原是否有線性關係，圖六中固定抗原濃度用不同倍數的 抗體測定結合的能力，顯示未純化過的 5D6 對抗原(日本腦炎病毒原 態套膜蛋白及重組蛋 ED3)結合能力有線性正相關。而在圖七中，不 同濃度的抗原使用 5D6 辦認，當病毒 2x103pfu/ml 及蛋白濃度為 5μg
時，西方點墨法也可清晰觀察。圖八中可看出抗體可以抑制病毒在宿 主細胞中的複製，抗體濃度越低中和的能力相對減少。綜合圖七八可 觀察到抗體 5D6 有辦認抗原(JEV,ED3)的能力，也具有中和病毒複製 的能力。
第二節 經純化 5D6 拮抗病毒蛋白的探討
分析純化後的 5D6，圖九可看到抗體的重鏈與輕鍊部分，在圖中
皆有表現。比較圖六、十可看出純化後的抗體與未純化前抗體與控制 組相比差距較大，敏感性經純化後上升。圖十一 顯示出當抗體濃度 較低時，與[38]相同有抑制病毒複製的能力，細胞的病變現象下降。
圖十二顯示出抗體接合病毒在細胞表現[39]，當病毒感染細胞皆可使 用 IFA 偵測到。
第三節 5D6 接合奈米金粒子發展診斷試劑的討論
圖十三可觀察到奈米金粒子接合 5D6 單株抗體後，波峰圖向右位
移可看出有成功接上。[40]中也一樣使用了 HAuCl4 · 3H2O 為奈米金 粒子，吸收波長皆約為 550nm 左右，經加工後接上分子後波峰都往右 位移。經過 ELISA 分析後(圖十四)，在低濃度的病毒存在下也可以被 偵測到，有高度敏感性。在病毒感染細胞後，使用奈米金粒子接合 5D6 單株抗體偵測，使用螢光顯微鏡觀察，可觀察到當抗體結合上病
毒後，奈米金粒子可使用螢光顯微鏡直接觀察[41]，使用 nanogold 接 合上細胞表面抗體，使在顯微鏡下可觀察到細胞型態，而本次實驗則 是採用病毒表面抗體，藉此觀察病毒在細胞中的表現量。不需再添加 第二抗體反應(圖十五)，使得偵測病毒的時間可以縮短，使得病毒在 短時間被檢測，並採取有效的防禦措施。這點有利於應用在診斷試劑 的發展。
第五章 結論與建議