將帶有 JEV EDIII 片段的 pET24a，BL21 品系的大腸菌株，大量 表現重組蛋白後。使用 Fast Protein Liquid Chromatogra- phy(FPLC)以 純化回收，日本腦炎套膜蛋白區域 III 約為 100 個胺基酸所構成的蛋 白質，可從 SDS-PAGE 利用 Coomassie blue 染劑染色，觀察 EDIII 蛋 白質純化後的程度(圖一 A)，可觀察到 ED3 蛋白有明顯的表現，也沒 有 其 他 蛋白 的表現 ， 證 明蛋 白純度 非 常 高。 再經由 西 方 墨點 法
（Western Blotting），第一抗體為 anti-His，第二抗體為 mouse co-Ap，
確定得到約為 13 KDa 的蛋白質(圖一 B)，而分子量大小與 ED3 符 合，經由本實驗得到了 JEV ED3 的重組蛋白。
3.2 實驗小鼠抗體效價誘發測定
經過免疫計畫(如附錄)誘發七隻實驗小鼠抗體的產生，在犧牲前
一週採取血清後，使用 ELISA 測定對抗原的效價。依照稀釋的倍數 越高，每組老鼠血清對抗原的效價，OD405 之讀值依倍數下降。控 制組讀值約為 0.1。稀釋 50 倍條件下，其中第 2,3 號實驗小鼠與控制 組有 2.5 倍的差距，第 7 號小鼠有 1.5 倍的差距，餘下小鼠與控制組 沒有明顯差距。箭號所指便是本次研究所以犧牲的實驗小鼠(mice 7)
3.3 融合瘤細胞抗體效價測定
犧牲小鼠後，將脾臟細胞與老鼠骨髓瘤(myeloma)細胞(SP2/O -Ag14) 融 合 後 ， 形 成 融 合 瘤 細 胞 。 培 養 在 培 養 於 含 10 % FBS RPMI-1640 的培養基中，每日觀察生長情形後，待細胞生長穩定後，
吸取細胞上清液為第一抗體，一共有 37 株融合瘤細胞進行測試(圖 二)，與對照組(只加培養基)相比，共有 2,19,35 三組細胞上清液效價 較高(箭號所標示)皆有 2 倍以上的差距。2 號有 2 倍的差距；19 號差 距達到 3.5 倍；35 號則有 2.5 倍差距。其中又以 35 號融合瘤細胞生 長持續穩定，且細胞型態外觀良好，本次實驗使用 35 號融合瘤細胞 進行極限稀釋。
3.4 極限稀釋後細胞抗體效價測定
圖三第 35 組樣本，待生長狀況良好後，將融合瘤細胞進行極限 稀釋，使細胞單株化後，繼續培養後，25 組生長狀況穩定的細胞取 細胞上清液為第一抗體(圖四)，每一組樣本與控制組對照後，得到 3D6、3E6、5C2、5D6 有明顯的差距，其中三組箭號所指，在續培養 中，細胞生長情況良好，圓圈箭號所指(5D6)為此次研究所使用的單 株抗體。持續培養後，並使用 5D6 的細胞上清液進行對原態病毒及 重組蛋白的結合能力測試。
3.5 5D6 對原態病毒及重組蛋白辦認能力測試
將 5D6 的細胞上清液，以 900 r.p.m 離心三分鐘後，收取上清液 為第一抗體。進行西方墨點法實驗(圖五)，Lane 1 注入 2x105pfu/ml 日 本腦炎病毒，Lane 2 注入 10 μg EDIII 重組蛋白。將上清液稀釋十倍 後。日本腦炎病毒套膜蛋白約為 70 KDa ，Lane 1 可得到 5D6 對於原 態病毒有辦認能力。ED3 重組蛋白約為 13 KDa，Lane 2 可得到 5D6 對於 D3 重組蛋白有辦認能力。由 Lane 1 及 Lane 2 可得到 5D6 單株 抗體可同時辦認日本腦炎及 ED3 重組蛋白。
3.6 5D6 不同稀釋倍數與原態病毒及重組蛋白辦認能力測試
同圖五將 5D6 細胞上清液，以 900 r.p.m 離心三分鐘後，分別稀 釋為原倍、10 倍、100 倍、1000 倍、10000 倍、當作第一抗體。依照 不同的稀釋倍數的抗體及對照組(培養基)，得到圖六。圖六 A 為抗體 不同稀釋倍數與 JEV(2x105)的結合能力，可看到原倍與對照組有最高 的結合能力，依濃度下降，結合能力也下降。稀釋 10000 倍的抗體與 對照組沒有顯著的差異。圖六.B 為抗體不同稀釋倍數與重組蛋白 ED3(10μg)的結合能力，可看到原倍與對照組有最高的結合能力，依 濃度下降，結合能力也下降。稀釋 10000 倍的抗體與對照組沒有顯著 的差異。由圖六 A.B 得到抗原濃度固定，抗體對抗原的結合能力與抗 體濃度有線性關係。
3.7 5D6 辦認不同濃度的原態病毒及重組蛋白
將 5D6 的細胞上清液，以 900 r.p.m 離心三分鐘後，收取上清液 為第一抗體，進行西方墨點法實驗(圖七)。圖七 A 中 Lane 1,2,3,4 分 別注入 2x105,2x104,2x103,2x102 pfu/ml 的日本腦炎病毒，可看出濃度 越高的病毒量，抗體所辦認的程度越高；而濃度低的病毒量，抗體所 辦認的程度越低。圖七 B 中 Lane 1,2,3,4 分別注入 20,10,5,1 ug ED3 重組蛋白，當蛋白濃度越高抗體所辦認的程度越高；而濃度低的蛋 白，抗體所辦認的程度越低。圖七 A.B 可得到 5D6 單株抗體可與抗 原進行免疫反應後表現。
3.8 5D6 中和病毒複製能力測試
使用 BHK-21 細胞感染日本腦炎病毒 2x105 pfu/ml，將原倍 5D6 抗體以 10 倍、100 倍稀釋後加入六孔盤中，當細胞病變程度達到 80%
後，加入染色液後計算病毒斑點數目(圖八)。LaneA 為加入原倍 5D6 抗體、LaneB 為加入 10 倍 5D6 抗體、LaneC 為加入 100 倍 5D6 抗體。
LaneA 與 B.C 比較可觀察到細胞病變情形有明顯改善。可看出當加入 濃度高的抗體，病毒複製能力有被中和的情形。導致病毒斑點數減少。
3.9 純化 5D6 抗體
收集 5D6 細胞上清液，進行 SDS-PAGE 及西方墨點法分析(圖
九)。圖九 A 為 SDS-PAGE 分析，抗體重鏈分子量約有 75 K Da，而 輕鍊分子量 25 KDa。可看出圖中 75 KDa 及 25 KDa 皆有表現量，純 化下的 5D6 有抗體表現。圖九 B 為西方墨點法分析，在 75 KDa 的位 子，可看到有重鏈表現。由圖九可得到純化後依然具有抗體分子。所 以可與抗原結合。
3.10 純化後抗體稀釋倍數與原態病毒及重組蛋白辦認能力測試 將 5D6(178μg/ml)稀釋成 17.8 及 1.78μg/ml 為第一抗體。抗原為 日本腦炎病毒(2x105pfu/ml)及 ED3 重組蛋白(10μg)進行 ELISA 分析 (圖十)178、17.8 跟 1.78μg/ml 濃度的抗體及對照組相比較後。圖十.A 可看出當 5D6 濃度為 178、17.8μg/ml 與對照組相比有明顯的差異，
178μg/ml 與對照組更有達到 5 倍以上的差距。圖十 B 中 5D6 濃度 178μg/ml 有明顯結合能力，跟對照組比較差異到 4 倍左右。由圖十可 觀察到抗原濃度固定，抗體對抗原的結合力與抗體濃度有線性關係。
3.11 純化後 5D6 中和病毒複製能力測試
使用日本腦炎病毒感染 BHK-21 細胞，5D6 抗體濃度 178、
17.8μg/ml 加入，對照組為只加病毒無抗體。再感染日本腦炎病毒 2x105 pfu/ml，計算病毒斑點(圖十一)。LaneA 為只加病毒液，病毒斑 點數為 160(±11)個；LaneB 為 178μg/ml 抗體，病毒斑點數為 41(±3)
個；LaneC 為 17.8μg/ml 抗體，病毒斑點數為 98(±7)個。可看出加入 抗體有中和病毒複製能力，抗體濃度 178μg/ml 中和效果與對照組相 比，達到了約 75%。病毒複製能力有被中和的情形。導致病毒斑點數 減少。
3.12 免疫螢光分析抗體結合受病毒感染的細胞
計算日本腦炎病毒量使MOI分別為10、1、0.1、0.001，感染BHK-21 細胞，對照組為只加培養基。感染72小時後，加入5D6(1.78μg/ml)作 用3小時後，將細胞於螢光顯微鏡下觀察、拍照(圖十二)。在感染初 期(0小時) MOI等於10、1、0.1、0.001、對照組，細胞生長情形良好。
72小時可看到當MOI等於10、1時，細胞有明顯的病變情形。在免疫 螢光觀察下所偵測到的亮度，隨著MOI下降而減少。
3.13 5D6接合奈米金
將配製完成的奈米金溶液，使用比色儀(BECKMAN)，掃描波長 400-700nm，紀錄下各波長的吸光值，作圖成圖十三 A。波長約在 520nm 時出現最高的波峰。奈米金溶液接合上單株抗體後，使用比色 儀(BECKMAN)，掃描波長 400-700nm，紀錄下各波長的吸光值，作 圖成圖十三 B。波長約在 540nm 時出現最高的波峰。比較圖十三(A) (B) 兩圖，可觀察到奈米金溶液接合上單株抗體後，最高的吸收光波峰有
向右偏移的現象。可得知奈米金確實有接合上單株抗體 5D6。
3.14 5D6 接合奈米金測試對病毒的結合能力
抗原為純化的 5D6，第一抗體使用不同病毒濃度的日本腦炎病 毒，分別為 105、104、103、102、101、0.1、0.01pfu/ml，兩抗為 5D6 接合奈米金的抗體(圖十四)。當病毒濃度較高時(105、104、103、102 pfu/ml)效價與控制組相比約有將近五倍的差距，病毒濃度較低(101、 1、0.1 pfu/ml) 效價與控制組相比約有將近三倍的差距。0.01 pfu/ml 則是跟控制組不大。由圖十四可得知，5D6 接合奈米金後可辦認病毒 與具有可被偵測的特性。
3.15 5D6 接合奈米金以免疫螢光分析抗體結合受病毒感染的細胞
將 BHK-21 分別以 M.O.I 為 10、1、0.1、0.01 感染 72 小時後，加 入 5D6 接合奈米金的抗體，使用螢光顯微鏡拍照(圖十五)。可見光部 分可看出當 M.O.I 下降，細胞病變的情況也趨緩。因此當加入 5D6 抗體後，因接合上奈米金粒子本身可自發螢光，可在螢光顯微鏡下直 接觀察。當 M.O.I 為 10、1、0.1 時，由圖可觀察到抗體結合病毒。
依 M.O.I 程度不同，螢光下觀察也依程度而下降。