製備日本腦炎病毒套膜蛋白單株抗體及發展奈米金檢驗試劑; Preparation of monoclonal antibody against the envelope protein of Japanese encephalitis virus and its application on nanogold-based diagnostic kits

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(1)中國醫藥大學. 中國醫藥大學醫學檢驗生物技術學系碩士班碩士學位論文. 醫技. 製備日本腦炎病毒套膜蛋白單株抗體及發. 系碩士班. 展奈米金檢驗試劑 Preparation of monoclonal antibody against the envelope protein of Japanese encephalitis virus and. 碩士學位. its application on nanogold-based diagnostic kits. 論文. 指導教授:林振文教授研究生陳宏. Cheng-Weng Lin. 研究生:陳宏綸 Hung-Lun Chen. 綸. 中華民國九十八年七月九十八年七月.

(2) 中國醫藥大學醫學檢驗生物技術學系碩士班碩士學位論文製備日本腦炎病毒套膜蛋白單株抗體及發展奈米金檢驗試劑 Preparation of monoclonal antibody against the envelope protein of Japanese encephalitis virus and its application on nanogold-based diagnostic kits. 指導教授:林振文教授 Cheng-Weng Lin. 研究生:陳宏綸 Hung-Lun Chen. 中華民國九十八年七月.

(3) 誌謝碩士生活也告了一個段落，兩年來所學到生命科學領域的知識，讓我的人生添加了不少美麗的色彩。不僅在學業上，在面對逆境更學會了『學會放下，不要放棄』。當遇到困難，要勇於放下眼前的挫折，但是堅持自己的目標，這句話將會伴隨我往後的人生旅程，也將這句話分享給看到這篇論文的各位。感謝我的父母從小到大對我的教導，無論在任何時候、任何地點都願意支持我的那股動力。謝謝我的兄弟陪伴著一起成長的歲月。感謝碩士班指導教授林振文老師在這兩年對我的鞭策與指導，實驗上指導研究方向的探索，也在做人處事的想法也影響了我；也感謝萬磊老師與黃素華老師在實驗技術上的指導及口試時的指教。感謝陪伴我走過碩士生活的大家。碩一剛入學時，感謝詩雯學姊、明璋學長、俊偉學長、姿穎學姊、美秀學姊、依芸學姊、靜瑩學姐、博成學長在實驗上的指導；一起為論文奮鬥的好同學：心元、曼慈、于禎、紹晟祝福大家在自己的道路上發光發熱。還在實驗室的學弟妹：偉生、妍冠、京伶、莉馨、忠翰、奕萱祝福大家實驗順利、心想事成，大學部的學弟妹也祝福你們能在實驗室學到更多東西。還要感謝好朋友們：啾桑、阿包、健倫、洪凱、小春、維仁、阿斌、仁宏、欣儀與固定班底們，謝謝你們在我最需要安慰時總是給予我最大的鼓. I.

(4) 勵。還有更多來不及感謝的人，謝謝大家。兩年的碩士生活時光飛逝，要畫下一個休止符，前往面對下一個人生旅程。這些歡樂與甘苦，令我在這裡成長了，我想我會很懷念十四樓的一切。. II.

(5) 中文摘要日本腦炎病毒為日本腦炎之病原，屬黃病毒科（Flaviviridae）之黃病（Flavivirus）。在日本腦炎的臨床診斷可使用病毒培養或血清學檢查，如有血球凝集抑制試驗(HI)、免疫螢光分析(IFA)、酵素免疫分析法(ELISA)以及中和試驗(NT)。奈米等級粒子有研究指出可應用在生物醫學偵測上，奈米金會以化學鍵結連接生物分子，能偵測到欲研究之分子在細胞內表現情形或體外診斷試劑。偵測活體內或活體外的奈米金粒子只需要用單一雷射光波長即可。本論文研究目的為製備抗日本腦炎病毒單株抗體及其應用於奈米金技術之日本腦炎診斷試劑。首先我們純化出日本腦炎病毒套膜蛋白第三區域重組蛋白，每兩週施打於 BALB/cByJNarl 小鼠。施打重組蛋白 4 次後，選定抗體價數較高的小鼠犧牲，取出脾臟細胞與 SP2/0 骨髓瘤細胞融合，進行極限稀釋培養。篩選出與日本腦炎病毒套膜蛋白及套膜蛋白第三區域重組蛋白結合能力良好的 5D6 單株抗體。5D6 單株抗體經西方墨點法及酵素免疫分析法確認可辦認日本腦炎套膜蛋白第三區域重組蛋白及原態病毒套膜蛋白，且不與登革熱病毒套膜蛋白結合。此外，經病毒斑點中和試驗進一步顯示 5D6 單株抗體具有中和日本腦炎病毒複製的能力。進一步將 5D6 單株抗體接合奈米金吸收波長從 520nm 位移到 540nm，証實 5D6 單株抗體接上奈米金粒子。再進行評估結合 5D6. III.

(6) 單株抗體之奈米金對日本腦炎病毒偵測的敏感性及專一性，得到 5D6 單株抗體接上奈米金對日本腦炎病毒有專一性及中和能力，敏感性經酵素免疫分析敏感性可達 10 pfu/ml。本論文結果獲得具有專一性及中和能力的 5D6 單株抗體，也提出奈米金在日本腦炎病毒診斷應用，有助於新型臨床診斷開發。. IV.

(7) Abstract Japanese encephalitis virus (JEV) is the pathogen of Japanese encephalitis, being an enveloped virus of the genus Flavivirius in the family Flaviviridae. Virus isolation and serological methods such as hemagglutination inhibition test (HI), immunofluorescence assay (IFA), enzyme-linked immunoassay (ELISA) and neutralization test (NT) are used for detection of Japaneseencephalitis virus. Nanoscale particles are used in biomedical applications, such as early disease detection. Biomolecules conjugated with gold nanoparticles can be applied on in vitro and in vivo optical assays and topological imaging. The goal of the study is to prepare the monoclonal antibodies (mAb) against JEV and to develop mAb-linked gold nanoparticles for detection of the JEV infection. Initially, JEV envelope domain III (ED3) recombinant protein was synthesized in E. coli, and purified using affinity chromatography. BALB/cByJNarl mice were immunized with purified ED3 protein in the adjuvant every two weeks for two months. Spleen cells from immunized mice were collected and then fused with myeloma cell using PEG 1500. Each hybridoma clone was generated by limiting dilution assay, and their mAb in the cultured supernatant was tested for specific recognition with recombinant ED3 proteins and native JEV envelope protein using ELISA, Western blotting, IFA and NT. 5D6 mAb showed specific binding ability to recombinant ED3 proteins and JEV envelope protein, but not dengue virus envelope protein. In addition, 5D6 mAb had neutralization activity against JEV using plaque assays. Furthermore, 5D6 mAb-linked gold nanoparticles exhibited an absorbance band at 540 nm, while gold nanoV.

(8) particles had an absorbance band at 520 nm.. ELISA indicated that the. sensitivity of 5D6 mAb-linked gold nanoparticles was 10 pfu/ml. In this study, we obtain JEV-specific 5D6 mAb and show the sensitivity of 5D6 mAb-linked gold particles for JEV detection. The results will be helpful for developing the novel diagnostic kits for JEV infection.. VI.

(9) 目錄誌謝. I. 中文摘要. III. 英文摘要. V. 圖目錄圖一病毒重組蛋白純化. 38. 圖二實驗小鼠抗體效價誘發測定. 39. 圖三融合瘤細胞抗體效價測定. 40. 圖四極限稀釋後細胞抗體效價測定. 41. 圖五 5D6 對原態病毒及重組蛋白辦認能力測試. 42. 圖六 5D6 不同稀釋倍數與原態病毒及重組蛋白辦認能力測試. 43. 圖七 5D6 辦認不同濃度的原態病毒及重組蛋白. 44. 圖八 5D6 中和病毒複製能力測試. 45. 圖九純化 5D6 抗體. 46. 圖十純化後抗體稀釋倍數與原態病毒及重組蛋白辦認能力測試 47 圖十一純化後 5D6 中和病毒複製能力測試. 48. 圖十二免疫螢光分析抗體結合受病毒感染的細胞. 49. 圖十三 5D6 接合奈米金. 50. i.

(10) 圖十四 5D6接合奈米金測試對病毒的結合能力. 51. 圖十五 5D6 接合奈米金以免疫螢光分析抗體結合受病毒感染的細胞 52 第一章前言第一節研究背景 1.1 日本腦炎 1.1.1 日本腦炎病毒. 1. 1.1.2 日本腦炎病毒基因組及結構. 2. 1.1.3 日本腦炎病毒套膜白結構與功能. 3. 1.1.4 日本腦炎病毒套膜第三區域蛋白結構與功能. 4. 1.1.5 日本腦炎診斷方法. 4. 1.1.6 日本腦炎疫苗. 5. 1.2 病毒單株抗體的制備及應用 1.2.1 單株抗體緣起. 5. 1.2.2 單株抗體制備. 6. 1.2.3 融合原理. 7. 1.2.4 單株抗體應用. 8. 1.3 奈米科技介紹及應用 1.3.1 奈米科技介紹. 9 ii.

(11) 1.3.2 奈米科技在生命科學領域的應用第二節研究目的與動機. 10 11. 第二章研究方法第一節研究設計 2.1.1 制備日本腦炎套膜蛋白區域 III(ED3)蛋白. 12. 2.1.2 制備日本腦炎病毒抗體. 12. 2.1.3 篩選專一性病毒抗體. 12. 2.1.4 單株抗體結合奈米金粒子. 12. 第二節研究材料 2.2.1 病毒株. 13. 2.2.2 細胞株(cell line). 13. 2.2.3 大腸桿菌株（Escherichia coli）. 13. 2.2.4 質體（vector）. 13. 2.2.5 抗體（Antibody）. 14. 2.2.6 引子(primer). 14. 2.2.7 奈米金粒子(HAuCl4 · 3H2O). 14. 2.2.8 實驗試劑及緩衝液. 15. 第三節實驗方法 iii.

(12) 2.3.1 病毒重組蛋白誘導 (protein induction ). 15. 2.3.2 病毒重組蛋白純化(Protein purification). 15. 2.3.3 蛋白濃度測定. 16. 2.3.4 蛋白質電泳分析（SDS-PAGE）. 16. 2.3.5 西方墨點法（Western bloting）. 17. 2.3.6 抗體免疫誘發. 17. 2.3.7 細胞融合. 18. 2.3.8 極限稀釋法(limit dilution). 19. 2.3.9 酵素連結免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA). 19. 2.3.10 中和試驗(Neutralization test; NT). 20. 2.3.11 細胞內免疫螢光染色（Immunofluorescence staining,IF） 20 2.3.12 製備奈米金粒子(gold nanoparticles). 21. 2.3.13 奈米金吸附抗體的最適抗體濃度測定. 21. 2.3.14 奈米金吸附單株抗體. 22. 第三章結果 3.1 病毒重組蛋白純化. 23. 3.2 實驗小鼠抗體效價誘發測定. 23. 3.3 融合瘤細胞抗體效價測定. 24. iv.

(13) 3.4 極限稀釋後細胞抗體效價測定. 24. 3.5 5D6 對原態病毒及重組蛋白辦認能力測試. 25. 3.6 5D6 不同稀釋倍數與原態病毒及重組蛋白辦認能力測試. 25. 3.7 5D6 辦認不同濃度的原態病毒及重組蛋白. 26. 3.8 5D6 中和病毒複製能力測試. 26. 3.9 純化 5D6 抗體. 26. 3.10 純化後抗體稀釋倍數與原態病毒及重組蛋白辦認能力測試 27 3.11 純化後 5D6 中和病毒複製能力測試. 27. 3.12 免疫螢光分析抗體結合受病毒感染的細胞. 28. 3.13 5D6接合奈米金. 28. 3.14 5D6接合奈米金測試對病毒的結合能力 29 3.15 5D6接合奈米金以免疫螢光分析抗體結合受病毒感染的細胞 29 第四章討論第一節單株抗體拮抗病毒蛋白的探討. 30. 第二節經純化5D6拮抗病毒蛋白的探討. 31. 第三節 5D6接合奈米金粒子發展診斷試劑的討論. 31. 第五章結論與建議第一節結論. 33. v.

(14) 第二節建議. 33. vi.

(15) 第一章前言第一節研究背景 1.1 日本腦炎 1.1.1 日本腦炎病毒日本腦炎主要是經由節肢動物傳播的病毒性疾病，藉由三斑家蚊（Culex tritaeniorhynchus），及環紋家蚊（Culex annulus） [1]叮咬所傳染，所以蚊蟲繁殖旺盛的夏季自然成為疫情流行的季節。在台灣，每年的五至十月為日本腦炎的主要傳染期，而六月則為流行的高峰；三至九歲以下的孩童為最主要的感染對象，但近年來發現，感染年齡有提高趨勢，甚至成人也有病例發生。日本腦炎是亞洲地區重要的指標流行性疾病之一。在台灣，民國四十四年，日本腦炎被列入報告傳染病，隨後隨後病例數呈現逐年增加的趨勢，致命率在民國四十五年高達百分之四十三點四，而在民國五十六年全台病例數更高達一千零二十四例。民國五十七年開始全面實施疫苗接種，民眾罹患日本腦炎的情況即大幅改善，直到目前為止，每年的病例通報數都在十至三十五例間，成為可以控制的傳染病。台灣地區病媒蚊主要為三斑家蚊、白頭家蚊和環蚊家蚊。流行初期病毒利用動物到蚊，再從蚊到動物的方式傳播，當流行範圍擴大後出現動物到蚊還有人的途境。台灣地區仍以豬為主要增幅動物，豬將 1.

(16) 病毒增幅後開始人的流行。所以每年都大約在豬抗體陽性率超過 50 ％之後三週，臨床病例就會急劇增加[2]。. 1.1.2 日本腦炎病毒基因組及結構日本腦炎病毒在病毒學的分類為黃病毒科（flaviviridae）黃病毒屬（flavivirus），為單股正性的 RNA 病毒[3]，其基因體全長約為 11 kb 的 RNA。此基因體的 5'端及 3'端都包含有一段非轉譯(non-translated region；NTR)可形成高度保留的二級結構，且 5'端具有 cap，3'端則不具 polyadenylate tail[4]。非轉譯區中帶有開放性區域（open reading frames 簡稱 ORF）經過轉譯形成一段大約 2500 個氨基酸的聚勝肽鏈 (polypeptide)，此聚勝肽鏈經由勝肽水解酶及病毒本身的 NS2B-NS3 蛋白酶切割後形成三個結構蛋白，分別為核蛋白（core protein；C）、前膜蛋白（membrane protein；prM）、套膜蛋白（envelope protein；E），及七個非結構蛋白（nonstructure proteins）NS1、NS2A、NS2B、NS3、 NS4A、NS4B、NS5[5]。而結構蛋白主要負責病毒顆粒的組成，核心蛋白包覆病毒的 RNA genome ；前膜蛋白是膜蛋白的前驅物[6]，當病毒由宿主細胞釋放到胞外時，前膜蛋白的 N 端會被切除而形成膜蛋白（M protein），套膜蛋白主要形成病毒的顆粒，與宿主細胞的病毒接受體融合[7]。非結構蛋白的功能，仍未完全明瞭，已知 NS1 是病毒複製複合體 2.

(17) （replication complex，簡稱 RC）的其中之一，可能和病毒顆粒得成熟有關[8]； NS2B 會與 NS3 結合形成蛋白酶並增加前膜蛋白和套膜蛋白的分泌[9]；NS3 具有絲胺酸蛋白酶（Serine protease）、解旋酶（helicase）及 RNA triphosphatase（RNA 三磷酸酶）的功能[10]；在同為黃病毒屬的 C 型肝炎病毒（HCV）中， NS4A 可作為 NS5 RNA 聚合酶的輔助因數[11]可在蛋白質多勝肽鏈切割時，扮演 NS3 蛋白酶的輔因數，增加 NS3 裂解非結構蛋白的能力；NS4B 為含有疏水性胺基酸的膜蛋白質，能使細胞膜通透性改變，造成細胞病變（cytopathic effect，簡稱 CPE），可在病毒感染時誘導含有病毒蛋白質的囊狀小泡形成； NS5 主要的功能為依附 RNA 型的 RNA 聚合酵素（RNA- dependent RNA polymerase，簡稱 RdRp）[12]，於複製病毒基因上扮演極重要之角色。. 1.1.3 日本腦炎病毒套膜白結構與功能日本腦炎病毒套膜蛋白(envelope protein)分子量為 53–55 kDa 是典型的透膜醣蛋白(Membrane glycoprotein, MG)，為構成病毒外殼最主要的結構[3]。為近 500 個胺基酸所組成，包含六個保守性的雙硫鍵以維持套膜蛋白的構形。套膜蛋白共分為三個區域： central β-barrel( 區域 I) 、延長聚體化區域 ( 區域 II) 、 C 端免疫球蛋白 (immunoglobulin) 單元(區域 III)。套膜蛋白有下列幾種功能：病毒附 3.

(18) 著在宿主細胞表面、病毒融合、紅血球凝集、病毒毒性、引發保護性免疫反應[13]。. 1.1.4 日本腦炎病毒套膜第三區域蛋白結構與功能套膜蛋白是日本腦炎主要的表面蛋白，據文獻指出具有受器會與宿主細胞作用[14]。套膜蛋白區域 III 有一個獨特的 IgC 結構包含了 Arg-Gly-Asp(RGD) motif，RGD motif 普遍被認為擁有細胞性附著蛋白，所以套膜蛋白區域 III 被認為是具有與受器結合的功能[15]。套膜蛋白區域 III 擁有一個雙硫鍵以維持構型結構，並可獨立摺疊成 trypsin-resistant 的核心蛋白[16]。因此套膜蛋白區域 III 是整個病毒套膜蛋白中與宿主的免疫反應關係最密切的區域，此種特性使得套膜蛋白區域 III 可被應用發展在疫苗的制備上。. 1.1.5 日本腦炎診斷方法依據台灣疾病管制局分類，日本腦炎屬於第三類傳染性疾病。檢驗方法包含下列各項即時反轉錄聚合脢鏈鎖反應，Real-time reverse transcriptase - polymerase chain reaction（Real-time RT-PCR）、IgM 及 IgG 抗體檢驗（Capture IgM and IgG ELISA）。在實驗室診斷中，符合下列任何一項，即判定為陽性：由組織、血液、腦脊髓液或其他體液中偵測到日本腦炎病毒或核酸。腦脊髓液中，抗日本腦炎病毒之 IgM. 4.

(19) 抗體陽性。單支血清中，抗日本腦炎病毒之 IgM 及 IgG 抗體均為陽性，而抗登革病毒之 IgM 抗體陰性者。成對血清中，抗日本腦炎病毒之 IgM 或 IgG 抗體力價有 4 倍或更高倍上升者。. 1.1.6 日本腦炎疫苗日本腦炎腦炎在中國大陸、韓國及台灣實施接種二十五年來，約有五百萬人次接受接種。全球常見的日本腦炎疫苗有下列三種：從小鼠腦部分離出的不活化病毒疫苗、從倉鼠腎臟細胞株(BHK)分離出的初級不活化病毒疫苗、接種細長的日本腦炎病毒(Allergic reactions t)[17]。台灣地區使用的疫苗是由受感染新生白鼠腦部組織的懸浮液所純化而來的，效力可達百分之九十五以上[18]，使用時以皮下注射於上臂外側。如果要得到最好的免疫效果，必頇在一定的時間內完成三劑的基礎疫苗接種，以後如要繼續維持免疫力則至少四年再追加接種一次。但是對於日本腦炎患者目前醫界並沒有很具體的突破，多半仍是以支持性治療為主[19]，對患者給予生命症狀的支援，並且適時投以降腦壓藥物，以避免對腦部造成嚴重的傷害。因此對於日本腦炎病毒偵測上及抑制病毒在宿主體內的複製是可以加以研究的領域。. 1.2 病毒單株抗體的制備及應用 1.2.1 單株抗體緣起. 5.

(20) 目前單株抗體的制備大都是沿用 Kohler & Milstein[20] 在 1975 年所發展出來的方法。將抗原注射到老鼠體內，待老鼠體內產生誘發免疫反應後，抗體被 B 細胞生產出來後，抗體是一種用以抵抗外來物侵襲的蛋白質（分子量約 15～90KDa）[21]。當身體有外來的物質 (antigen)侵入時，身體會採取許多防禦措施來使這外來物質被消除或破壞。而抗體的產生是其中的一個防防禦措施。抗體是由 B 細胞所分泌。而每一個 B 細胞只能生產一種抗體。另外此種細胞本身不具再分裂，再增殖的能力，因此，當此 B 細胞生產抗體達一段時間之後，就會死亡、消失。科學家採用了細胞融合技術，將產生抗體的 B 細胞與可以不斷分裂增殖的癌細胞融合在一起，那麼該融合細胞就可以一面生產抗體，同時又不斷的增殖。所以在 1975 年，Kohler 與 Milstein 將 B 細胞與骨髓瘤細胞(myeloma cells )成功地合成融合瘤細胞，開啟了應用單株抗體的新紀元。. 1.2.2 單株抗體制備將抗原打入實驗小鼠體內，其抗原通常有許多抗原決定基，則老鼠免疫反應(如 B 細胞)，會生成對抗這 4 種抗原決定基的抗體，經幾次抗原刺激免疫反應後，免疫系統產生專第一抗體體來辦認抗原後，再取出老鼠的脾臟細胞，將它和骨髓癌細胞融合，融合後要以 HAT(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine)培養篩選[22]，能存活下來 6.

(21) 並生長穩定的是 B 細胞與骨髓癌細胞的正確融合細胞[23]。但從小鼠中分離出的 B 細胞不全是所要的抗體，小白鼠原先就存在許多 B 細胞株對抗一般外來抗原；因此要用酵素免疫分析法 (ELISA)挑出專一性體，經過 HAT 與酵素免疫分析法篩選後的細胞株，仍含有兩群以上的細胞，因此要進行單株化，此時要使用極限稀釋法，要將該細胞株稀釋，下到 96 孔盤細胞培養盤中，計算使得每孔只含有一個細胞，使其穩定生長成群落後，再次以 ELISA 篩選專一性抗體。量產抗體可分兩種方法︰可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然後以針頭收集所產生的腹水，腹水中的抗體濃度非常高。把融合細胞在大型培養槽中培養，收集培養液上清即得抗體[24]。. 1.2.3 融合原理當兩種細胞因細胞膜融合使新生成的細胞同時具有兩種細胞的特性。Kohler＆ Milstein（1975）成功地將小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合產生一具有分泌抗體又可不斷分裂培養的融合瘤細胞。細胞融合的方式利用 polyethylene glycol（PEG），亦可使用電極脈衝反應。目前較常使用的則是 PEG[25]。細胞融合時有許多未融合之細胞，需利用 HAT（hypoxanthine, aminopterin, thymidine）培養基進行融合瘤細胞的篩選。. 7.

(22) 1.2.4 單株抗體應用利用單株抗體在醫學檢驗試劑方面，單株抗體對抗原點結合之專一性，可以測出檢體內抗原點數量。在實驗室中製造出單株抗體與可測量物質，例如帶有放射性化學物、酵素、螢光等等之結合體，再依據此結合體與抗原之結合數目，如此可測得檢驗體中抗原(外來病原) 之數量。目前普通使用的單株抗體做出人體外檢驗試劑，包括細胞表面抗原（cell surface antigen）[26]、癌細胞指標（tumor markers）[27]、病毒、細菌。用於人體內的則有癌腫瘤及偵測心臟病等之醫學檢驗試劑，都普遍應用病人身上。也有應用在醫學治療方面，將病人所需藥物連接在單株抗體上，如此一來可利用單株抗體的專一性將藥物帶至標的器官或是組織。例如將對抗細胞的藥物與對癌細胞有特異性之單株抗體結合一起，再將此結合物打入癌症病患體內，單株抗體就會把藥物帶到癌細胞處，再發揮藥效將癌細胞殺死，並且不會影響到正常細胞。但是利用單株抗體對抗癌細胞亦有其缺點，因癌細胞表面抗原變異性過大，所以單株抗體療效受限制。腫瘤細胞接受單株抗體處理後，其抗原會轉向進細胞內部。對較大之腫瘤，單株抗體只能標定外圍之細胞，無法達到完全的治療效果。近年來，更有研究指出利用單株抗體結合上奈米科技[28]應用上發展各類細胞表面抗原、癌細胞指標、病毒、細菌等等的醫學檢驗技術。跟傳統檢驗相較之下，這種新. 8.

(23) 發展的技術可以提升偵測的準確率及便利性，也縮短了檢驗時間。例如，傳統的癌細胞指標偵測需利用標定放射線，但在活體中照射過量的放射線會使全身其他的正常細胞造成一定程度的傷害，對於患者本身會導致副作用。但當標定了奈米粒子後，因奈米粒子具有穩定性及良好的生物相容性，進入生物體後，使用紅外線儀偵測即可，十分便利，更會隨著身體的循環系統排出，不會對患者造成額外影響。. 1.3 奈米科技介紹及應用 1.3.1 奈米科技介紹奈米的定義為：：奈米是英文(nanometer)的譯名，還有一種說法是源自於拉丁文(NANO)，是長度的單位；一奈米為百萬分之一公釐，也就是十億分之一公尺，相當於 4 個原子的直徑，是 10 個氫原子並排的長度[29]。奈米科技材料是包括所有微觀世界中奈米級範圍內的所有物質材料，物質材料經過奈米處理過後，會讓材料產生與原本完全不同的特性而形成相當多的特殊功能。在 80 年代研發出的奈米金屬以及近來研發出的奈米半導體薄膜[30]、奈米陶瓷[31]、奈米磁性材料以及結合生命科學領域的奈米生物醫學材料[32]等，均屬於奈米材料科學的一部分。製作這些奈米材料，依結構上的不同又可區分為零維結構(如奈米球形粒子或量子點)，一維結構(如奈米線或奈米棒) 和二維結構(如奈米薄膜)三種形式。這些奈米材料具有以下的特性： 9.

(24) 表面效應、小尺寸效應、宏觀量子穿隧效應（量子尺寸與量子局域效應）[33]等特性。在表面效應特性部分，超微顆粒的表面具有很高的活性，例如金屬超微顆粒利用表面活性，可望成為新一代的高效催化劑以及低熔點材料。在小尺寸效應特性部分，由於顆粒尺寸變小所引起的巨集觀物理性質的變化，故稱之為小尺寸效應，進而在物理性質產生特殊的性質變化，尤其是在力學性質方面，譬如陶瓷材料在一般情況下是呈脆性，由奈米超微顆粒製成的奈米陶瓷材料卻具有良好的韌性與一定的延展性，賦予陶瓷材料新的力學性質；另外如奈米晶粒的金屬要比傳統金屬硬 3 至 5 倍。 1.3.2 奈米科技在生命科學領域的應用奈米科技在生命科學領域的發展已包含許多層面，將碳加工成穩定性最高的 C60，因碳類具有低毒性的特質，在骨骼中可逗留長達兩天之久，故可在生物醫學中在活體內作為顯影劑使用[34]。C60 中心結構部份可經加工後，形成攜帶藥物或是抗體的載體，到達特定的器官、組織、或細胞後，釋放藥效或是發揮治療效果。透過了奈米技術加工及化學結構的修飾，碳類有可能成為藥物的新載體。也有研究指出碳類結構或其衍生物會影響愛滋病病毒複製的蛋白酶抑制劑（HIV protease）[35]結合，並抑制其活性。在中藥加工方面，一般細胞大小約是 10μm，而傳統中草藥萃取物顆粒平均約高達 300 微米左右[36]，. 10.

(25) 不易被人體細胞所吸收，若選擇了藥物將其中的有效成分奈米化，使其粒徑小至 0.5μm，不但能使藥物較易被吸收，很多不溶於水的物質做成奈米微粒後可溶於水，將可增加水溶性以利於水溶性差的中藥在身體被吸收，將藥效發揮在人體中的最佳療效。. 第二節研究目的與動機在本次研究，由載體帶有日本腦炎套膜蛋白區域 III 的此段基因，這段重組蛋白即為本次研究的抗原，注射入實驗小鼠內，引發體內的免疫反應誘發出抗體。經過反覆篩選後得到了專一性抗體。利用此抗體結合奈米金，分別對原態病毒及重組蛋白進行實驗分析，是否具有專一性與敏感性。製備日本腦炎病毒的檢驗試劑，本次研究目的評估單株抗體接合奈米金對日本腦炎的診斷及治療。. 11.

(26) 第二章研究方法第一節研究設計 2.1.1 制備日本腦炎套膜蛋白區域 III(EDIII)蛋白將勝任細胞中(BL21)帶有 EDIII 片段的質體 pET24a，加入 IPTG 誘導表現 JEV EDIII 的重組蛋白，利用鎳離子親和管柱純化 JEV EDIII 的重組蛋白，並利用 SDS-PAGE 及西方點墨法來確認其表現。. 2.1.2 制備日本腦炎病毒抗體將 JEV EDIII 的重組蛋白為抗原，注射入實驗小鼠內，引發體內的免疫反應誘發出抗體，經過多次的抗原追加，以提升實驗小鼠對抗原的免疫反應。犧牲小鼠後，將脾臟細胞與骨髓瘤(myeloma)細胞 (SP2/O-Ag14)融合後，培養觀察生長變化。. 2.1.3 篩選專一性病毒抗體以 ELISA 測定 96 孔盤中，挑出幾個最具效價的細胞大量培養，待大量培養後再以 ELISA 測定效價。挑出幾個最具效價的細胞使用西方點墨法、免疫螢光確認對原態病毒及重組蛋白的結合能力，利用中和試驗確認抗體對於病毒複製能力的影響。. 2.1.4 單株抗體結合奈米金粒子純化出的單株抗體 5D6 接合奈米金粒子後，以 ELISA 測定結合 12.

(27) 病毒效價及免疫螢光觀察對活體外細胞的標定情況。. 第二節研究材料 2.2.1 病毒株日本腦炎病毒台灣本土株（T1P1）. 2.2.2 細胞株(cell line) 幼小倉鼠腎臟纖維母細胞（baby hamster kidney cell，BHK-21），培養於含 10 % FBS（fetal bovine serum）的 MEM (Modified Eagle Medium) 培養基中。老鼠骨髓瘤(myeloma)細胞(SP2/O-Ag14)，培養於含 10 % FBS（fetal bovine serum）的 DMEM ( Dulbecco Modified Eagle Medium) 培養基中。(感謝中醫所萬磊博士提供). 2.2.3 大腸桿菌株（Escherichia coli） BL21 (DE3)：基因型為 F-，ompT ，hsdSB ( rB- mB- )，gal， dcm (DE3) (camR)，用於蛋白質表現（protein induction）。. 2.2.4 質體（vector） pET24a(Novagen)：含有 5.3Kb 個鹼基配對，可在大腸桿菌 BL21 品系中，經 IPTG 誘導表現蛋白，N 端具有 T7-tag，C 端具有 His-tag。. 13.

(28) 2.2.5 抗體（Antibody） Mouse Anti-His tag antibody (Novagen TM) Goat anti-mouse IgG，AP Conjugate labeled antibody (ZYMED) Anti-mouse Peroxidase （Kirkegaard Perry Liboratories；KPL） FITC-conjugated anti-Rabbit IgG (H+L) HRP-labeled anti-Mouse IgG (H+L) (Kirkegaard Perry Laboratories) 2.2.6 引子(primer) ED3-pET24a primer ED3-pET24a -F-BamH I TCGC-GGATCC-GGCACAACCTATGGCATGTGCACA ED3-pET24a -R-Hind III CCGC-AAGCTT-AGCTTTGTGCCAATGGTGGTTGAT VH 5’ sense primers MHyVH1 gct gcc caa cca gcc atg gcc ctc gag gtr mag ctt cag gag tc MHyVH4 gct gcc caa cca gcc atg gcc ctc gag gtc car ctg caa car tc MHyVH9 gct gcc caa cca gcc atg gcc ctc gag gtg awg ytg gtg gag tc MHyVH10 gct gcc caa cca gcc atg gcc ctc gag gtg cag skg gtg gag tc VH 3’ reverse primers MHyIgGCH1-B1 cga tgg gcc ctt ggt gga ggc tga gga gac ggt gac cgt ggt MHyIgGCH1-B2 cga tgg gcc ctt ggt gga ggc tga gga gac tgt gag agt ggt MHyIgGCH1-B3 cga tgg gcc ctt ggt gga ggc tgc aga gac agt gac cag agt MHyIgGCH1-B4 cga tgg gcc ctt ggt gga ggc tga gga gac ggt gac tga ggt LC6’ 5-’CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA-3’ κ 5’-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’ 2.2.7 奈米金粒子(HAuCl4 · 3H2O) 14.

(29) Gold(III) chloride trihydrate (SIGMA)(感謝亞洲大學黃素華博士提供). 2.2.8 實驗試劑及緩衝液見附表. 第三節實驗方法 2.3.1 病毒重組蛋白誘導 (protein induction) 將含有病毒片段的質體的單一菌落，用 10ml LB 含抗生素在 37℃的培養箱中轉速為 250r.p.m 增菌一夜後，加入到 500ml LB 含抗生素在 37℃的培養箱中在增菌 3 小時，吸光值範圍達 OD 600nm 約為 0.4 到 1 間，加入 isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside(IPTG) 0.8M 500 μl，使最終濃度為 0.8mM，在 16℃培養箱中轉速 250r.p.m 搖晃 16 小時以上，將菌液以 6000r.p.m 離心 30 分鐘，移除上清液後，加入 20ml 的 20mM imidozolec 回溶細胞沉澱物，回收上清液。置於超音波擊碎（sonicator）30 分鐘將細菌打碎。再以 4℃ 8000r.p.m 離心 30 分鐘，回收上清液。. 2.3.2 病毒重組蛋白純化(Protein purification) 使用Fast Protein Liquid Chromatography(FPLC)純化病毒重組蛋白，在管柱中先裝填入10ml的Ni SepharoseTM (GE Healthcare)，將已打碎的細胞上清液使用幫浦通過管柱。使用100mM imidazole沖洗管 15.

(30) 柱，再以400mM沖洗管柱將純化後的蛋白析出。. 2.3.3 蛋白濃度測定使用胎牛血清蛋白濃度為 1mg/ml，配製濃度為 0、0.9、1.95、3.9、 7.8、15.625、31.25μg/ml 各 10μl，加入到含 990μlBio-Rad protein assay 的 1.5ml 微量離心管中。使用 BECKMAN 紫外及可見分光度計算出吸光值，帶回線性回歸公式，做出標準曲線，R2 必頇大於 0.995 方為可信區間。再取從管柱析出的蛋白取 10μl 加到含 990μl Bio-Rad protein assay 中，使用 OD595nm 測得各管濃度。. 2.3.4 蛋白質電泳分析（SDS-PAGE）將收下的蛋白質樣品取 50μl，加到含 50μl 2X protein loading dye 的 1.5ml 微量離心管，用乾浴器加熱變性使用 110℃煮 5 分鐘，靜置冰上 5 分鐘使其冷卻即完成樣品前處理。SDS-PAGE 凝膠分上下兩層，下層 separating gel 配製 12%，上層的 stacking gel 則配製 4%，在 SDS-PAGE 中蛋白質會依分子量分離。將配製好的膠體放置在 Bio-Rad 電泳槽內，倒入 Running buffer，將 Protein Molecular Weight Marker 及蛋白質樣品注入 SDS-PAGE 的的孔槽中，通以電壓 80 Volts 30 分鐘，待樣品通過上層的 stacking gel 後，在通以電壓 110 Volts 70 分鐘，視實驗需要決定樣本跑到哪個位子。 16.

(31) 2.3.5 西方墨點法（Western bloting）本實驗是使用 Bio-Rad 半乾式電泳轉漬槽的電泳裝置，裁切電泳膠中所頇轉漬的區域後，浸泡於 transfer buffer 中，將 NC membrane 與 3M 濾紙浸泡在 transfer buffer 中。轉印石墨板的正極板以 transfer buffer 潤濕後，依序重疊平鋪 3 張 3M 濾紙、PVDF membrane、gel、3 張 3M 濾紙，小心去除氣泡，轉印紙位向正極，膠片位向負極。電流 10V，電流 400mA 經 45 分鐘後將 PVDF membrane 取出，浸泡於以 1x TBST 泡好的 5 % 脫脂牛奶中，室溫搖晃 1 小時，以 1x TBST 清洗 PVDF membrane 10 分鐘 3 次，加入一級抗體 anti-His (1:2000 1x TBST 稀釋)，置於 4℃下搖晃作用 3 小時，再以 1x TBST buffer 清洗 membrane 10 分鐘 3 次，加入二級抗體 anti-mouse Co-AP tag (1: 2000 1x TBST 稀釋)，使其在室溫下搖晃作用 2 小時之後，用 1x TBST buffer 清洗 10 分鐘 3 次，再加入 NBT/TCIP 顯影劑，反應至呈色。呈色完成後加入 ddH2O 使反應終止，晾乾後保存。. 2.3.6 抗體免疫誘發(感謝中醫所萬磊博士指導) 採用購自國家動物中心6-8週齡BALB/c 小白鼠，將純化出的病毒重組蛋白與等量TiterMax® 以MICRO-EMULSIFYING NDLS混合. 17.

(32) 均勻，打入實驗小鼠皮下。在兩週之後進行第二次免疫誘發反應，將病毒重組蛋白與等量佛氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant; IFA)以MICRO-EMULSIFYING NDLS一樣混合均勻，打入實驗小鼠皮下。在於兩週後，病毒重組蛋白與減半量佛氏不完全佐劑 (incomplete Freund’s adjuvant; IFA)以MICRO-EMULSIFYING NDLS 混合均勻，打入實驗小鼠皮下。再於兩週後，進行最後一次免疫誘發反應，直接以病毒重組蛋白注射小鼠腹腔。採集眼窩血，進行抗體與抗原效價測定。若反應為陽性，則一週後進行融合實驗。. 2.3.7 細胞融合將骨髓瘤細胞(SP2/O-Ag14)沖洗並離心下來，使用30ml RPMI -1640(無血清)沖洗細胞，並完成細胞數計算，並保存在37℃下。小白鼠以二氧化碳法處理，待實驗小鼠犧牲後以大頭針固定於保麗龍板上，以酒精噴霧擦拭小鼠，然後以無菌操作將腹腔切開，小心取出脾臟置於冰上的含10ml RPMI-1640滅菌玻璃培養皿內，以1mL 無菌注射針筒反覆沖洗脾臟細胞。將沖洗出之脾臟細胞再以50ml離心管收集，再加入20ml RPMI-1640，靜止等待細胞殘骸沉澱後，收集上清液後以900 rpm 十二分鐘離心，將沉澱之細胞以10ml沖洗三次並完成細胞記數。最後將分別清洗過之5倍脾臟細胞與1倍SP2/O -Ag14細胞以不含血清之RPMI-1640混合之，混合後的細胞使用30ml RPMI-1640沖 18.

(33) 洗兩次以上後，吸掉多餘上清液，將細胞液之離心管置於37℃的溫水中，於60 秒內在掁盪中緩慢滴入PEG1500 1 ml，再於1分鐘內緩慢滴入不含血清之RPMI-1640 1ml，接著再於2分鐘內緩慢滴入不含血清之 RPMI -1640 8 ml，最後將10ml細胞液放置在37℃細胞培養箱中10分鐘。將培養箱中細胞拿出離心900r.p.m 10分鐘後，吸掉多餘上清液後加入含20%FBS、10%BM、1%L-glu、1%PS的PMI-1640 50ml，並分裝於5盤96 孔細胞培養盤內，每孔100μL，於5％CO2的37℃培養箱中培養觀察。. 2.3.8 極限稀釋法(limit dilution) 將融合後細胞，每天取出觀察細胞生長情況，於一週後每孔盤加入含10%FBS、1%PS 的100μl RPMI-1640。再將生長狀況良好融合瘤細胞進行極限稀釋(limit dilution) 使細胞單株化。. 2.3.9 酵素連結免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 將JEV病毒液2x105 pfuml-1或病毒重組蛋白10μg加入等量coating buffer，96孔盤中每孔加入100μl，放置在4℃冰箱中隔夜。將96孔盤上清液去除，每孔加入100μl的5％脫脂奶粉作用1個小時，之後使用 TBST沖洗三次，每次7分鐘。使用細胞上清液當作第一抗體，每孔加入100μl作用1小時。去除孔盤上清液，使用TBST沖洗三次，每次7分 19.

(34) 鐘。再加入第二抗體(goat anti-mouse peroxidase ; HRP)作用1小時。去除孔盤上清液，使用TBST沖洗三次，每次7分鐘。使用ABTS® 呈色試劑組(KPL)，等量試劑A加入試劑B。在避光環境下，每一孔加入 100μl呈色劑，作用20分鐘後，使用ELISA reader 測其OD(405nm)之數值。. 2.3.10 中和試驗(Neutralization test; NT) 將BHK-21培養在2盤6孔盤中，細胞數約為2x106 。將第一抗體分別稀釋成原倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍，先將各濃度抗體與2x105 pfuml-1的JEV在4℃下搖晃作用1小時。分別將不同濃度抗體含病毒液加入到6孔盤中，二重複，保留一個對照組只加病毒液，不加抗體。在5％CO2的37℃培養箱中作用1小時，每隔15分鐘輕輕搖晃，讓抗體、病毒、細胞均勻混合後，加入覆蓋液。每天觀察細胞病變現象(CPE)，當CPE達到80%後，加入染色液。作用1小時後，小心倒掉染色液，待乾後，仔細計算噬菌斑(plaques)數目。. 2.3.11 細胞內免疫螢光染色（Immunofluorescence staining,IF）以 1x PBS 清洗 2 次 6 孔盤內的 BHK-21 細胞後，加入固定液（3.7%福馬林、10% acetone in 1x PBS ）固定 30 分鐘後，加入 1%BSA blocking 1小時，再以 1x PBS 清洗的三次，去除上清液，加. 20.

(35) 入 5D6 抗體在室溫下搖晃作用 3 小時，去除 5D6 抗體後以 1x PBS 清洗 3 次。再加入 anti-mice FITC (1:2000) 抗體避光作用 2 小時，去除抗體後再以 1x PBS 清洗 3 次，將細胞於螢光顯微鏡下觀察、拍照。. 2.3.12 製備奈米金粒子(gold nanoparticles) (感謝亞洲大學黃素華博士指導) 四氯金酸 HAuCl4 來自 Sigma (G4022) 公司購得。取2 ml l% HAuCl4 加入去離子水體積至 200 ml，使其終濃度為 0.005%。加熱攪拌至沸騰，再加入還原劑 3.6 ml 1% 檸檬酸三納 (trisodium citrate) 後，持續加熱攪拌沸騰。當HAuCl4減少時，奈米金溶液顏色由透明轉變為灰色至黑色，再轉變為淡紫色至紅色。持續將溶液迴流20 min。室溫下慢慢冷卻後，以去離子水恢復原體積。然後，加入 0.1 M K2CO3 調至 pH 7.4 。粒徑小的奈米金會使溶液呈橘紅色，粒徑大的則使溶液呈淡紫色。. 2.3.13 奈米金吸附抗體的最適抗體濃度測定取0.5 ml奈米金溶液 (pH7.4)分別加入等體積 (1 ml) 的抗體之不同濃度，分別為320.340.360.380.400μl，進行奈米金吸附抗體步驟，振盪並置於4 ℃下靜置約 5 分鐘。再於各管加入 50 μl 30% NaCl 均. 21.

(36) 勻混合，以未加入抗體的奈米金溶液為對照組，分別以目測法觀察和分光光度計檢測。. 2.3.14 奈米金吸附單株抗體當奈米金吸附抗體的最適 pH 值和最適的抗體濃度決定後，便可以製備結合奈米金粒子之抗體的複合物(gold nanoparticles-antibody conjugate )作為特異性標誌物，取 340μl之單株抗體溶液 , 加入 0.5 ml 之奈米金溶液內，於 4 ℃下混合靜置 3~5 分鐘進行吸附，再加入 50 μl 30% 之NaCl溶液幫助奈米金與蛋白質緊密地吸附，混合靜置 15 分鐘後，加入0.1 ml 5%casein 之遮蔽劑，混合靜置15 分鐘，以高速離心機(轉速 10,000 rpm) 離心15分鐘，吸取上清液以除去未吸附的蛋白質，再加入 50 μl 2.5%casein與 50 μ l 10mM PBS (pH7.4) 振盪回溶，最後加入 10 μ l 0.1%NaN3 防腐，置於4 ℃備用。. 22.

(37) 第三章結果 3.1 病毒重組蛋白純化將帶有 JEV EDIII 片段的 pET24a，BL21 品系的大腸菌株，大量表現重組蛋白後。使用 Fast Protein Liquid Chromatogra- phy(FPLC)以純化回收，日本腦炎套膜蛋白區域 III 約為 100 個胺基酸所構成的蛋白質，可從 SDS-PAGE 利用 Coomassie blue 染劑染色，觀察 EDIII 蛋白質純化後的程度(圖一 A)，可觀察到 ED3 蛋白有明顯的表現，也沒有其他蛋白的表現，證明蛋白純度非常高。再經由西方墨點法（Western Blotting），第一抗體為 anti-His，第二抗體為 mouse co-Ap，確定得到約為 13 KDa 的蛋白質(圖一 B)，而分子量大小與 ED3 符合，經由本實驗得到了 JEV ED3 的重組蛋白。. 3.2 實驗小鼠抗體效價誘發測定經過免疫計畫(如附錄)誘發七隻實驗小鼠抗體的產生，在犧牲前一週採取血清後，使用 ELISA 測定對抗原的效價。依照稀釋的倍數越高，每組老鼠血清對抗原的效價，OD405 之讀值依倍數下降。控制組讀值約為 0.1。稀釋 50 倍條件下，其中第 2,3 號實驗小鼠與控制組有 2.5 倍的差距，第 7 號小鼠有 1.5 倍的差距，餘下小鼠與控制組沒有明顯差距。箭號所指便是本次研究所以犧牲的實驗小鼠(mice 7). 23.

(38) 3.3 融合瘤細胞抗體效價測定犧牲小鼠後，將脾臟細胞與老鼠骨髓瘤(myeloma)細胞(SP2/O -Ag14) 融合後，形成融合瘤細胞。培養在培養於含 10 % FBS RPMI-1640 的培養基中，每日觀察生長情形後，待細胞生長穩定後，吸取細胞上清液為第一抗體，一共有 37 株融合瘤細胞進行測試(圖二)，與對照組(只加培養基)相比，共有 2,19,35 三組細胞上清液效價較高(箭號所標示)皆有 2 倍以上的差距。2 號有 2 倍的差距；19 號差距達到 3.5 倍；35 號則有 2.5 倍差距。其中又以 35 號融合瘤細胞生長持續穩定，且細胞型態外觀良好，本次實驗使用 35 號融合瘤細胞進行極限稀釋。. 3.4. 極限稀釋後細胞抗體效價測定圖三第 35 組樣本，待生長狀況良好後，將融合瘤細胞進行極限. 稀釋，使細胞單株化後，繼續培養後，25 組生長狀況穩定的細胞取細胞上清液為第一抗體(圖四)，每一組樣本與控制組對照後，得到 3D6、3E6、5C2、5D6 有明顯的差距，其中三組箭號所指，在續培養中，細胞生長情況良好，圓圈箭號所指(5D6)為此次研究所使用的單株抗體。持續培養後，並使用 5D6 的細胞上清液進行對原態病毒及重組蛋白的結合能力測試。. 24.

(39) 3.5 5D6 對原態病毒及重組蛋白辦認能力測試將 5D6 的細胞上清液，以 900 r.p.m 離心三分鐘後，收取上清液為第一抗體。進行西方墨點法實驗(圖五)，Lane 1 注入 2x105pfu/ml 日本腦炎病毒，Lane 2 注入 10 μg EDIII 重組蛋白。將上清液稀釋十倍後。日本腦炎病毒套膜蛋白約為 70 KDa ，Lane 1 可得到 5D6 對於原態病毒有辦認能力。ED3 重組蛋白約為 13 KDa，Lane 2 可得到 5D6 對於 D3 重組蛋白有辦認能力。由 Lane 1 及 Lane 2 可得到 5D6 單株抗體可同時辦認日本腦炎及 ED3 重組蛋白。. 3.6. 5D6 不同稀釋倍數與原態病毒及重組蛋白辦認能力測試同圖五將 5D6 細胞上清液，以 900 r.p.m 離心三分鐘後，分別稀. 釋為原倍、10 倍、100 倍、1000 倍、10000 倍、當作第一抗體。依照不同的稀釋倍數的抗體及對照組(培養基)，得到圖六。圖六 A 為抗體不同稀釋倍數與 JEV(2x105)的結合能力，可看到原倍與對照組有最高的結合能力，依濃度下降，結合能力也下降。稀釋 10000 倍的抗體與對照組沒有顯著的差異。圖六.B 為抗體不同稀釋倍數與重組蛋白 ED3(10μg)的結合能力，可看到原倍與對照組有最高的結合能力，依濃度下降，結合能力也下降。稀釋 10000 倍的抗體與對照組沒有顯著的差異。由圖六 A.B 得到抗原濃度固定，抗體對抗原的結合能力與抗體濃度有線性關係。 25.

(40) 3.7. 5D6 辦認不同濃度的原態病毒及重組蛋白將 5D6 的細胞上清液，以 900 r.p.m 離心三分鐘後，收取上清液. 為第一抗體，進行西方墨點法實驗(圖七)。圖七 A 中 Lane 1,2,3,4 分別注入 2x105,2x104,2x103,2x102 pfu/ml 的日本腦炎病毒，可看出濃度越高的病毒量，抗體所辦認的程度越高；而濃度低的病毒量，抗體所辦認的程度越低。圖七 B 中 Lane 1,2,3,4 分別注入 20,10,5,1 ug ED3 重組蛋白，當蛋白濃度越高抗體所辦認的程度越高；而濃度低的蛋白，抗體所辦認的程度越低。圖七 A.B 可得到 5D6 單株抗體可與抗原進行免疫反應後表現。. 3.8 5D6 中和病毒複製能力測試使用 BHK-21 細胞感染日本腦炎病毒 2x105 pfu/ml，將原倍 5D6 抗體以 10 倍、100 倍稀釋後加入六孔盤中，當細胞病變程度達到 80% 後，加入染色液後計算病毒斑點數目(圖八)。LaneA 為加入原倍 5D6 抗體、LaneB 為加入 10 倍 5D6 抗體、LaneC 為加入 100 倍 5D6 抗體。 LaneA 與 B.C 比較可觀察到細胞病變情形有明顯改善。可看出當加入濃度高的抗體，病毒複製能力有被中和的情形。導致病毒斑點數減少。. 3.9. 純化 5D6 抗體收集 5D6 細胞上清液，進行 SDS-PAGE 及西方墨點法分析(圖. 26.

(41) 九)。圖九 A 為 SDS-PAGE 分析，抗體重鏈分子量約有 75 K Da，而輕鍊分子量 25 KDa。可看出圖中 75 KDa 及 25 KDa 皆有表現量，純化下的 5D6 有抗體表現。圖九 B 為西方墨點法分析，在 75 KDa 的位子，可看到有重鏈表現。由圖九可得到純化後依然具有抗體分子。所以可與抗原結合。. 3.10 純化後抗體稀釋倍數與原態病毒及重組蛋白辦認能力測試將 5D6(178μg/ml)稀釋成 17.8 及 1.78μg/ml 為第一抗體。抗原為日本腦炎病毒(2x105pfu/ml)及 ED3 重組蛋白(10μg)進行 ELISA 分析 (圖十)178、17.8 跟 1.78μg/ml 濃度的抗體及對照組相比較後。圖十.A 可看出當 5D6 濃度為 178、17.8μg/ml 與對照組相比有明顯的差異， 178μg/ml 與對照組更有達到 5 倍以上的差距。圖十 B 中 5D6 濃度 178μg/ml 有明顯結合能力，跟對照組比較差異到 4 倍左右。由圖十可觀察到抗原濃度固定，抗體對抗原的結合力與抗體濃度有線性關係。. 3.11 純化後 5D6 中和病毒複製能力測試使用日本腦炎病毒感染 BHK-21 細胞，5D6 抗體濃度 178、 17.8μg/ml 加入，對照組為只加病毒無抗體。再感染日本腦炎病毒 2x105 pfu/ml，計算病毒斑點(圖十一)。LaneA 為只加病毒液，病毒斑點數為 160(±11)個；LaneB 為 178μg/ml 抗體，病毒斑點數為 41(±3). 27.

(42) 個；LaneC 為 17.8μg/ml 抗體，病毒斑點數為 98(±7)個。可看出加入抗體有中和病毒複製能力，抗體濃度 178μg/ml 中和效果與對照組相比，達到了約 75%。病毒複製能力有被中和的情形。導致病毒斑點數減少。. 3.12 免疫螢光分析抗體結合受病毒感染的細胞計算日本腦炎病毒量使MOI分別為10、1、0.1、0.001，感染BHK-21 細胞，對照組為只加培養基。感染72小時後，加入5D6(1.78μg/ml)作用3小時後，將細胞於螢光顯微鏡下觀察、拍照(圖十二)。在感染初期(0小時) MOI等於10、1、0.1、0.001、對照組，細胞生長情形良好。 72小時可看到當MOI等於10、1時，細胞有明顯的病變情形。在免疫螢光觀察下所偵測到的亮度，隨著MOI下降而減少。. 3.13 5D6接合奈米金將配製完成的奈米金溶液，使用比色儀(BECKMAN)，掃描波長 400-700nm，紀錄下各波長的吸光值，作圖成圖十三 A。波長約在 520nm 時出現最高的波峰。奈米金溶液接合上單株抗體後，使用比色儀(BECKMAN)，掃描波長 400-700nm，紀錄下各波長的吸光值，作圖成圖十三 B。波長約在 540nm 時出現最高的波峰。比較圖十三(A) (B) 兩圖，可觀察到奈米金溶液接合上單株抗體後，最高的吸收光波峰有. 28.

(43) 向右偏移的現象。可得知奈米金確實有接合上單株抗體 5D6。. 3.14 5D6 接合奈米金測試對病毒的結合能力抗原為純化的 5D6，第一抗體使用不同病毒濃度的日本腦炎病毒，分別為 105、104、103、102、101、0.1、0.01pfu/ml，兩抗為 5D6 接合奈米金的抗體(圖十四)。當病毒濃度較高時(105、104、103、102 pfu/ml)效價與控制組相比約有將近五倍的差距，病毒濃度較低(101、 1、0.1 pfu/ml) 效價與控制組相比約有將近三倍的差距。0.01 pfu/ml 則是跟控制組不大。由圖十四可得知，5D6 接合奈米金後可辦認病毒與具有可被偵測的特性。. 3.15 5D6 接合奈米金以免疫螢光分析抗體結合受病毒感染的細胞將 BHK-21 分別以 M.O.I 為 10、1、0.1、0.01 感染 72 小時後，加入 5D6 接合奈米金的抗體，使用螢光顯微鏡拍照(圖十五)。可見光部分可看出當 M.O.I 下降，細胞病變的情況也趨緩。因此當加入 5D6 抗體後，因接合上奈米金粒子本身可自發螢光，可在螢光顯微鏡下直接觀察。當 M.O.I 為 10、1、0.1 時，由圖可觀察到抗體結合病毒。依 M.O.I 程度不同，螢光下觀察也依程度而下降。. 29.

(44) 第四章討論本次研究探討經動物模式誘導取得抗體後，經過一連串的篩選抗體步驟，得到專一性性拮抗原態病毒及重組蛋白的單株抗體。以及討討是否可以中和病毒複製能力、感染細胞內抗體標示情形。最後再接合奈米金粒子，探討發展檢驗試劑發展潛力。. 第一節單株抗體拮抗病毒蛋白的探討經過純化後的重組蛋白(圖一 B)，當做抗原使實驗小鼠誘發出抗體(圖二)後，將脾臟細胞與老鼠骨髓瘤(myeloma)細胞融合後，經過篩選後(圖三)(圖四)得到了專一性拮抗病毒蛋白的單株抗體 5D6。5D6 可以辦認到日本腦炎病毒套膜蛋白及重組蛋白 ED3(圖五)顯示此抗體是具有可以同時辦認病毒及套膜蛋白，[37]中純化 dengue 2 virus 的抗體，其西方點墨法分析抗原使用重組蛋白，但本研究同時採用了日本腦炎病毒套膜蛋白及重組蛋白 ED3，其目的為探討 5D6 單株抗體可辦認原來的抗原(ED3)，也同時可辦認日本腦炎病毒套膜蛋白。確認在往下實驗可偵測到在宿主細胞中的日本腦炎病毒。為了確認抗體濃度高低與抗原是否有線性關係，圖六中固定抗原濃度用不同倍數的抗體測定結合的能力，顯示未純化過的 5D6 對抗原(日本腦炎病毒原態套膜蛋白及重組蛋 ED3)結合能力有線性正相關。而在圖七中，不同濃度的抗原使用 5D6 辦認，當病毒 2x103pfu/ml 及蛋白濃度為 5μg 30.

(45) 時，西方點墨法也可清晰觀察。圖八中可看出抗體可以抑制病毒在宿主細胞中的複製，抗體濃度越低中和的能力相對減少。綜合圖七八可觀察到抗體 5D6 有辦認抗原(JEV,ED3)的能力，也具有中和病毒複製的能力。. 第二節經純化 5D6 拮抗病毒蛋白的探討分析純化後的 5D6，圖九可看到抗體的重鏈與輕鍊部分，在圖中皆有表現。比較圖六、十可看出純化後的抗體與未純化前抗體與控制組相比差距較大，敏感性經純化後上升。圖十一顯示出當抗體濃度較低時，與[38]相同有抑制病毒複製的能力，細胞的病變現象下降。圖十二顯示出抗體接合病毒在細胞表現[39]，當病毒感染細胞皆可使用 IFA 偵測到。. 第三節 5D6 接合奈米金粒子發展診斷試劑的討論圖十三可觀察到奈米金粒子接合 5D6 單株抗體後，波峰圖向右位移可看出有成功接上。[40]中也一樣使用了 HAuCl4 · 3H2O 為奈米金粒子，吸收波長皆約為 550nm 左右，經加工後接上分子後波峰都往右位移。經過 ELISA 分析後(圖十四)，在低濃度的病毒存在下也可以被偵測到，有高度敏感性。在病毒感染細胞後，使用奈米金粒子接合 5D6 單株抗體偵測，使用螢光顯微鏡觀察，可觀察到當抗體結合上病. 31.

(46) 毒後，奈米金粒子可使用螢光顯微鏡直接觀察[41]，使用 nanogold 接合上細胞表面抗體，使在顯微鏡下可觀察到細胞型態，而本次實驗則是採用病毒表面抗體，藉此觀察病毒在細胞中的表現量。不需再添加第二抗體反應(圖十五)，使得偵測病毒的時間可以縮短，使得病毒在短時間被檢測，並採取有效的防禦措施。這點有利於應用在診斷試劑的發展。. 32.

(47) 第五章結論與建議第一節結論由本實驗結果顯示所得到的 5D6 單株抗體，辦認日本腦炎病毒套膜蛋白具有專一性。應用在診斷試劑開發方面，可確保偵測的準確性，可確定偵測出日本腦炎病毒；也具有高度敏感性，低濃度的病毒也可被偵測。當病毒在複製的初期，病毒劑量較低，即可被 5D6 抗體結合，可達到事先預防的目的。本次實驗將 5D6 單株抗體結合上奈米金粒子，結果顯示可縮短檢測時間，使得可較快檢驗出病毒。本次研究所純化出的 5D6 單株抗體濃度約為 178μg/ml，濃度不高，主要原因為抗體來源為收取細胞上清液，細胞上清液包含了細胞激素、細胞蛋白及培養基廢物等等，而抗體的濃度在上清液中相對較低。如提高濃度可將抗體打回實驗小鼠腹水以提高濃度：或是將單株抗體使用表現載體表現，以利研究進行。. 第二節建議本論文目的在診斷試劑研發，而本論文結果獲得具有專一性及中和能力的 5D6 單株抗體，也提出奈米金在日本腦炎病毒診斷應用，有助於新型臨床診斷開發。可應用在縮短病毒檢測的時程，有利於及早檢測出病毒。也提高了檢測的敏感性，使病毒更容易被檢測出。. 33.

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(52) Fig.1. A. B. kDa 10. 圖一病毒重組蛋白純化將大量表現的 ED3 重組蛋白使用 FPLC 純化，使用 400μM Imidazole 緩衝液析下後，分別進行 A.SDS-PAGE 使用 Coomassie blue 染劑染色 B. Western Blotting，第一抗體體為 Mouse Anti His-tag，第二抗體體為 Goat Anti-Mouse IgG AP Conjugate (H + L)。. 38.

(53) Fig.2. Serum ELISA titer blank mice3 mice5 mice7. O.D(405 nm). 0.3 0.25 0.2. mice2 mice4 mice6. 0.15 0.1 0.05 0 50x. 100x. 200x. Serum Dilution. 圖二實驗小鼠抗體效價誘發測定使用 ELISA 測定對抗原的效價，共有六隻實驗小鼠，犧牲前一週採取的血清，分別稀釋 50 倍、100 倍、200 倍後為第一抗體，第二抗體為 Horseradish Peroxidase (HRP) anti-mouse IgG. 39.

(54) Fig.3. ELISA titer. OD(405nm). 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 1 2. 3 4 5. 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 C. sample number. 圖三融合瘤細胞抗體效價測定 ELISA 測定抗體對抗原(JEV)的效價，第一抗體為融合瘤細胞上清液，第二抗體為 Horseradish Peroxidase (HRP) anti-mouse IgG。共有 37 個生長良好的融合瘤細胞株進行分析。. 40.

(55) Fig.4. 圖四極限稀釋後細胞抗體效價測定取圖三的 35 號融合瘤細胞，極限稀釋後，將 25 個融合瘤單株細胞進行 ELISA 測定抗體對抗原(JEV)的效價。第一抗體為融合瘤細胞上清液，第二抗體為 Horseradish Peroxidase (HRP) anti-mouse IgG。圖中圓圈箭號即為本次研究的 5D6 單株抗體。. 41.

(56) Fig.5 1. kDa. 2. 70. 10. 圖五 5D6 對原態病毒及重組蛋白辦認能力測試收集 5D6 的細胞上清液為第一抗體，第二抗體為 Horseradish Peroxidase (HRP) anti-mouse IgG，進行西方墨點法。第一抗體作用 2 小時後，加入第二抗體後在作用 2 小時後，使用 Chemiluminescent HRP Substrate (MILLIPORE) 呈色 Lane 1 日本腦炎病毒 Lane 2 ED3 重組蛋白. 42.

(57) Fig.6 A. B ELISA 2. 2. 1.5. OD405. 2.5 1.5 1. 1 0.5. 倍原. X 10. 0X 10. 00 10. 0X 00 10. bl. 倍原. X 10. 0X 10. X 00. 00 10. oc bl. 10. 0X. oc. k. 0. X. 0. 0.5 k. OD405/ c ont rol ra t i o. ELISA. dilution rate. dilution rate. 圖六 5D6 不同稀釋倍數與原態病毒及重組蛋白辦認能力測試 96 孔盤分別固定 JEV(A).ED3(B)為抗原，5D6 細胞上清液，分別稀釋為原倍、10 倍、100 倍、1000 倍、10000 倍為第一抗體，第二抗體為 Horseradish Peroxidase (HRP) anti-mouse IgG。 A.5D6 對病毒原態套膜蛋白的效價 B.5D6 對 ED3 重組蛋白的效價. 43.

(58) Fig.7 A. 1. 2. 3. 4. B. 1. 2. 3. 4. 圖七 5D6 辦認不同濃度的原態病毒及重組蛋白收集 5D6 的細胞上清液為第一抗體，第二抗體為 Horseradish Peroxidase (HRP) anti-mouse IgG，進行西方墨點法。 A. Lane 1,2,3,4 分別注入 2x105,2x104,2x103,2x102 pfu/ml 的日本腦炎病毒。 B. Lane 1,2,3,4 分別注入 20,10,5,1 ug ED3 重組蛋白. 44.

(59) Fig.8 B. A. Cultured medium dium. 1/10 cultured medium. C. 1/100 cultured me-. 圖八 5D6 中和病毒複製能力測試 BHK-21 細胞培養在六孔盤中，待細胞長至八分滿後，將原倍 5D6 抗體以 10 倍，100 倍稀釋後，加到六孔盤中，再感染日本腦炎病毒 2x105 pfu/ml，每日觀察細胞被感染的情形，當細胞病變程度達到 80%後，加入染色液後計算病毒斑點數目。 Lane A 加入原倍 5D6 抗體 Lane B 加入 10 倍 5D6 抗體 Lane C 加入 100 倍 5D6 抗體. 45.

(60) Fig.9 KDa. KDa B 97. A 97. 66 Heavy chain 66 36 Light chain 21. 圖九純化 5D6 抗體收集 5D6 細胞上清液，使用 HiTrap rProtein A FF(GE Healthcare)管柱純化抗體。將純化後的 5D6 抗體，進行 A.SDS-PAGE 及 B.西方墨點法分析，將純化的 5D6 抗體注入膠中，第一抗體直接以 Horseradish Peroxidase (HRP) anti-mouse IgG 作用一小時後觀察。. 46.

(61) Fig.10 A. B pab5D6-ED3 ELISA. pab5D6-JEV. 2. 1.2 1. 1.5. 0.8 0.6. 1. 0.4. 0.5. 0.2. 0. 0 178ug/ml. 17.8ug/ml. 1.78ug/ml. control. 178ug/ml. 17.8ug/ml. 1.78ug/ml. control. 圖十純化後抗體稀釋倍數與原態病毒及重組蛋白辦認能力測試 96 孔盤中，分別固定日本腦炎病毒(2x105pfu/ml)及 EDIII 重組蛋白 (10μg)進行 ELISA 分析。依照 178、17.8 跟 1.78μg/ml 濃度的抗體及對照組(培養基)，為第一抗體，第二抗體為 Horseradish Peroxidase (HRP) anti-mouse IgG 後，使用 ABTS® 呈色試劑組(KPL)呈色，以 ELISA reader 測其 OD(405nm)之數值 A.抗原為日本腦炎原態病毒套膜蛋白 B.抗原為 ED3 重組蛋白. 47.

(62) Fig.11. A. B. Virus only. Plaque number. Virus. Virus. 178ug/ml. 17.8ug/ml. 41 ±3. 160±11. C. 98±7. 圖十一純化後 5D6 中和病毒複製能力測試 BHK-21 細胞培養在六孔盤中，待細胞長至八分滿後，將 5D6 抗體濃度 178、17.8μg/ml，加到六孔盤中，對照組為只加病毒無抗體。再感染日本腦炎病毒 2x105 pfu/ml，每日觀察細胞被感染的情形，當細胞病變程度達到 80%後，加入染色液後計算病毒斑點。 Lane A 為只加病毒液，病毒斑點數為 160(±11)個 Lane B 為 178μg/ml 抗體，病毒斑點數為 41(±3)個 Lane C 為 17.8μg/ml 抗體，病毒斑點數為 98(±7)個. 48.

(63) Fig.12 c. MOI=10. MOI=1. MOI=0.1. MOI=0.01. 0 hr. 72 hr. IF. 圖十二免疫螢光分析抗體結合受病毒感染的細胞計算病毒量使 MOI 分別為 10、1、0.1、0.001 後，感染 BHK-21。分別在 0 小時、72 小時拍照觀察細胞病毒病變情形。加入 anti-mouse FITC 螢光拍照。. 49.

(64) Fig.13. 圖十三 5D6 接合奈米金使用比色儀(BECKMAN)，掃描波長 400-700nm，紀錄下各波長的吸光值。 A. 奈米金溶液未接合 5D6 單株抗體 B. 奈米金溶液接合上 5D6 單株抗體. 50. 700. 680. 660. 640. 620. 600. 580. 560. 540. 520. 700. 680. 660. 640. 620. 600. 580. 560. 540. 520. 500. 480. 460. 440. 420. 400. 0. 500. 0.1. 480. 0.2. 460. 0.3. 440. OD. OD. 0.4. 420. 0.5. 0.2 0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 400. 0.6.

(65) Fig.14 nanogold-5D6 2 abs. 1.5 1 0.5 0 100000 10000 1000. 100. 10. 1. 0.1. 0.01. 0.001. 0. PFU/ml. 圖十四 5D6 接合奈米金測試對病毒的結合能力 96 孔盤固定純化的 5D6，第一抗體使用不同病毒濃度的日本腦炎病毒，分別為 105、104、103、102、101、0.1、0.01pfu/ml 作用，兩抗為 5D6 接合奈米金的抗體。. 51.

(66) Fig.15 c. MOI=10. MOI=1. MOI=0.1. MOI=0.01. 72 hr. IF. 圖十五 5D6 接合奈米金以免疫螢光分析抗體結合受病毒感染的細胞計算病毒量以 M.O.I 為 10、1、0.1、0.01 感染 BHK-21 72 小時後，加入 5D6 接合奈米金的抗體。直接使用螢光顯微鏡觀察。. 52.

(67) 附表 DNA electrophoresis 0.25%(w/v) bromophenol blue,0.25%(w/v) xylene DNA 5x 追蹤染劑 cyaol FF,30%(v/v) glycerol in ddH2O TAE buffer 40 mM Tris.Acetate, 2 mM EDTA, pH=8.5 EtBr 0.5 /ml ethidium bromide Western Blotting 1.5M Tris-base 45.4g tris-base add ddH2O 250ml pH=8.8 (pH8.8) 0.5M Tris-HCl 7.88gtris-HCl,dd ddH2O 100ml,pH=6.8 (pH6.8) 10% SDS 10g SDS sodium dodecyl sulfate ,add ddH2O to 100ml APS 10% ammonium persulfate 1g/10ml ddH2O ddH2O 1.35ml,30%Acy/Bis 0.27ml,0.5M Tris-HCl Stacking (pH6.8)0.55ml,APS10%22.5μl,10%SDS22.5μl,TEMED gel(4%) 3.5μl ddH2O 4.8ml ,30 % Acy/Bis 4.2ml,1.5M Tris-base separating gel (pH8.8)3.0ml, APS 10% 120μl,10% SDS (10%) 120μl,TEMED 6.5μl glyceol 2.5 ml , 2-mercaptoethanol 100μl, 10% SDS 2 ml, 0.5 M Tris-HCl 1.25 ml, pH6.8, 0.5% 2x sample loading buffer (W/V)bromophenyl blue 0.2ml, ddH2O 3.55 ml , glycerol 2.5ml 10X : 30g tris-base,144g glycine,10% SDS100ml add running buffer ddH2O to 1L 1X :25mM tris-base,250mM glycine,0.1%SDS 40%methanol ,10% acetic acid, 0.1% Commassie brilCommassie brilliant blue liant bluer-250 Destain solu40%methanol ,10% acetic acid tion 8.72g tris-base,4.4g glycine, add ddH2O to 1.5L, pH Transfer buffer 8.4,add methanol 300ml,10% SDS 5.6ml 10x TBS 200 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 M NaCl 1x TBST 1 X TBS cotaining 0.1% Tween-20 5% skim milk 2.5g skim milk/50ml TBST. 53.

(68) Protein concentration detection Protein Standard. bovine serum albumin（1 g/ul）. Protein assay dye. Bio-RAD Protein assay dye reagent concentrat, 450 ml. Immunoprecipitation 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM TSET buffer NET buffer. EDTA, 2﹪Triton X-100 150 mM NaCl, 30 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.1 mM EDTA. Phage display coating buffer LB. Top agarose PEG/NaCl. 0.1 M sodium carbonate NaHCO3 pH8.8 Per liter：10 g Bacto tryptone,5 g Yeast extract 10 g NaCl Per 100 ml ,1 g Bacto tryptone,0.5 g Yeast extract,0.5 g NaCl. Add 100 ml deionized water Autoclave 20 min 20% (W/V)polyethylene glycol-8000,2.5M NaCl .. FPLC. 8x Phosphate buffer. 2 M Imidazole. 1.42 g Na2HPO4 . 2H2O (177.99 g/mol), 1.11 g NaH2PO4 . H2O (137.99 g/mol) and 23.38 g NaCl (58.44 g/mol), add distilled water to 90 ml and dissolve completely.Adjust pH, to 7.4. Add distilled water to 100 ml and filter through a 0.45 µm filter. This gives a final concentration of 160 mM phosphate and 4 M NaCl. 13.62 g imidazole (68.08 g/mol) add distilled water to 90 ml and dissolve completely. Adjust pH to 7.4 us54.

(69) ing conc. HCl. Add distilled water to 100 ml and filter through a 0.45 µm filter. 20mM sodium phosphate,0.5M NaCl,0.05M EDCleaning buffer TA,pH7.4 Incubation buffer 1M NaOH 2.63g NiSO4.6H2O (262.86/mol)add dd H2Oto 100ml 0.1 M NiSO4 filter through a 0.45 µm filter. Denaturing buffer 10mM imidazol ,8M urea, 1 mM ß-mercaptoethanol Refolding buffer 10mM imidazol , 1mM ß-mercaptoethanol Phosphate buf2 M ImidaImidazole concentra- fer 8x stock water Distilled zole pH 7.4 tion in buffer mM solution pH 7.4 ml ml ml 10 mM 62.5 2.5 to 500 ml 100 mM 62.5 25.0 to 500 ml 400 mM 62.5 100.0 to 500 ml. 55.

(70) 附錄. Immunization Schedule: 7 BALB/cByJNarl mices . Antigen is ED3 fusion protein. Week. Manipulation. 1. Serum collection. 2. Boost #1. 3. 4. 5. Adjuvant. TiterMax®. Serum collection Boost #2. Incomplete Freund’s adjuvant. Serum collection. 6. Boost #3. Incomplete Freund’s adjuvant. 8. Prefusion boost. none. 9. Harvest. 56.

(71)