第三章 材料與方法
十七. 抽取 RNA 及 cDNA 的製備
(一) RNA 的抽取
1. 藥品配置
(1) BCP (1-bromo-3-chloropropane, MRC)
(2) SUPERase-In(RNase inhibitor, Ambion, 20 u/uL, 2500 u, cat 2694)放置於 -20℃保存
(3) RNase-Free Dnase I Set (Qiagen 79254)
(4) DNase I 以 550ul RNase-free water 溶解，即可使用，之後儲存於-20℃
reagent 需要量
DNase I 10 μl
RDD buffer 70 μl
2. 實驗步驟－RNAmini kit (Qiagen)
(1) 取 0.1g 的脂肪組織加入 0.5ml TRIzol 以均質機均質，而肝臟則是取 0.1g 加
第三章 材料與方法
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入 1ml TRIzol 以均質機均質，並收集在 1.5ml eppendrof
(2) 室溫下混合 5-10 分鐘，如沒有要馬上抽 RNA，均質液可放在-70℃保存數週 (3) sample 離心 10 分鐘(10,000rpm，4℃)，離心後取下層(粉紅色)至一個新的
eppendrof，每個 eppendrof 加 TRIzol 至 1ml，再加入 100ul
BCP(1-bromo-3-chloropropane, MCR:BP-151)至每一個 sample，以 vortex 混勻，室溫下放 5 分鐘，再離心 15 分鐘(12,000rpm，4℃)
(4) 取上層(無色)至一新的 eppendrof 並加入 600ul 的 70%酒精(以 DEPC-H2O 配 置)，再以 vortex 混勻
(5) 取 700ul loading 至 RNeasy spin columns(放在 2ml collection tube 上)後，離 心(10000rpm，15 秒)，流出液丟棄，再 loading 剩下的 sample，離心(10000rpm，
15 秒)，流出液丟棄
(6) 加入 350ul 的 RW1，離心(10000rpm，15 秒)，流出液丟棄
(7) 另以新的 eppendrof 配置 DNase 所需要的量：每一 sample 需 10ul DNase I stock solution(Qiagen)和 70ul Buffer RDD (Qiagen)依 sample 量預先混好，
再加在 DNase 時盡量都加在白色的 silica membrane 上每 sample 加 80 ul，
室溫下放 15 分鐘
(8) 加入 350ul 的 RW1，離心(10000rpm，15 秒)，流出液丟棄
(9) 加入 500ul 的 RPE(需確認是否有加 100%酒精)後，離心(10000rpm，15 秒)，
流出液丟棄
(10) 加入 500ul 的 RPE 後，離心(10000rpm，2 分鐘)，流出液丟棄
(11) 將 RNeasy spin columns 放到新的 2ml collection tube 裡，離心(14000rpm，
1 分鐘)，去除殘餘的酒精
(12) 配置所需的 SUPERase-In(RNase inhibitor, Ambion, 20 u/uL, 2500 u, cat 2694)，每一 sample 需 1ul SUPERase-In 和 4ul RNase-free water 依 sample 量預先混好，再加在新的 1.5ml collection tube，每管加入 5ul
第三章 材料與方法
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(13) 將 RNeasy spin columns 放到加了 SUPERase-In 的 1.5ml collection tube 裡，
加 40ul RNase-free water，離心 (10000rpm，1 分鐘) 收集流出液，內含 RNA (14) 以 nanoDrop 測 260/280 ratio 和濃度，RNA 需放置-70℃長期保存。
(二) RNA quality
1. 鑄膠
藥品 需要量
Agarose (GibcoBRL) 1g
Etidium Bromide (Gene pure) 26μl
將上述藥品皆加入 1x TAE (UniRegion Bio-Tech) buffer 配成 1%膠，微波 2 -3 min 至完全溶解，將鑄膠液倒入 RNA gel 鑄膠槽並插入齒模，避免產生氣泡，
待其凝固後即可用於 RNA 電泳。
2. 樣品
Sample 取 2μg RNA 在依比例加入 10X dye，混勻後即可注入洋菜膠體中，
以 100 伏特電壓進行電泳，當色帶泳動至洋菜膠體之 3 / 4 時停止，取出膠體置 於 UV box（LONGLIFE FILTER, SPECTROLINE）上觀察 rRNA 28S / 18S 的 比例，若約等於 2：1 表示 RNA 品質良好，無降解現象便可進行 qRT-PCR。
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(三) RNA 轉成 cDNA(Reverse transcription reaction)
1. 原理
逆轉錄反應(Reverse transcription；RT reaction)是利用逆轉錄酶(Reverse transcriptase) ， 將 單 股 RNA (Single-stranded RNA) 逆 轉 錄 為 互 補 DNA (Complementary DNA；cDNA)。逆轉錄作用即為第一股 cDNA 之合成(First strand cDNA synthesis) 。 此 cDNA 可 用 來 進 行 後 續 的 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (Polymerase chain reaction；PCR)。
2. 反應試劑製備 (均使用滅菌之 Eppendorf)
(1) 50 ng /μL Random hexamer
Reagent 需要量 final conc.
Random hexamer (Promega C118A)
(500 μg / mL，20 µg，共 40 µL) 40μl 50 ng /μL
DEPC-H2O 360μl
以 DEPC-H2O 將 500 μg / mL stock 稀釋為 50 ng /μL 的 Random hexamer。分裝 於 Eppendorf 儲存於-20℃。避免重複冷凍解凍。
Random hexamer 是非專一性 primer，含有 6 個 nucleotide。又稱為 random primer。
(2) M-MLV RT (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) (200 U /μL) (Promega M1701)
儲存於-20℃，於使用前才取出。避免重複冷凍解凍。
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(3) 5x M-MLV RT buffer (Promega M531A) (1 mL)
儲存於-20℃，使用前 vortex 均勻。避免重複冷凍解凍。
(4) 10 mM dNTP mixture
Reagent final conc.
40 mM dNTP mixture stock 10 mM DEPC-H2O
以 DEPC-H2O 將 40 mM Stock 稀釋為 10 mM 的 dNTP mixture。分裝於 Eppendorf 儲存於-20℃。
3. 反應試劑條件＆操作步驟
(1)反應試劑
Reagent 需要量
Total RNA 500ng
Random hexamer (50 ng /μL) 1μL
以 DEPC-H2O 補體積至 14 μL，於 70℃加熱 10min(為避免 primer 的二級結構 產生，以 70℃加熱 10min 打開二級結構)。後迅速冰浴 3 min(防止二級結構再黏 合回去)。
(2)再依序加入以下試劑
Reagent 需要量 Final conc.
5x M-MLV RT buffer 4 μL 1x
10 mM dNTP mixture 1 μL 0.5 mM
M-MLV RT(200 U /μL) 1 μL 10 U /μL
總體積 20 μL
於室溫下反應 10 min，42℃下反應 50 min，95℃下反應 5 min 將 RT 去活化以 終止反應，最後置於 4℃下 10 min，此即完成了第一股 cDNA 之合成，分裝於
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滅菌 Eppendorf 中凍於-80℃備用 (此 cDNA 濃度為 50ng /μL)。
十八. Real time polymerase chain reaction (同步定量 PCR ;